范奕好，葛晨亮，程 陽(yáng)，何 燕

（廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧 530021）

心肌纖維化（myocardial fibrosis，MF）是多種心臟疾病如缺血性心肌病等的重要病理變化，導(dǎo)致正常組織結(jié)構(gòu)的破壞和心臟進(jìn)行性功能障礙[1-3]。藥物是比較便捷的治療方式，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)鈣通道阻滯劑、β-腎上腺素受體阻滯劑等在調(diào)節(jié)重塑過(guò)程和減少不良心血管事件的發(fā)生方面有效[4]。然而這些藥物不能完全抑制MF 發(fā)展，因此開(kāi)發(fā)新型的更有效且平價(jià)的藥物仍十分重要。植物中的部分材料花青素、維生素C和類(lèi)胡蘿卜素等，具有重要的抗氧化以及緩解炎癥的作用[5]。β-胡蘿卜素是類(lèi)胡蘿卜素之一，作為維生素A的前體對(duì)健康有益并能降低某些疾病風(fēng)險(xiǎn)[6-7]。它有效減少了促炎細(xì)胞因子的生成，包括腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-18（IL-18）等炎癥標(biāo)志物[8-10]。含核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體3（Pyrin Domain Containing Protein 3，NLRP3）與炎癥疾病的啟動(dòng)和進(jìn)展密切相關(guān)，能夠作為一個(gè)有效的治療靶點(diǎn)[11-12]。它由多種病原體和相關(guān)信號(hào)激活，能使NLRP3、ASC 和procaspase 1 組成的細(xì)胞質(zhì)復(fù)合物形成，激活caspase-1，促炎細(xì)胞因子IL-1β 和IL-18 的水解成熟[13-15]。因此，本研究旨在與探索β-胡蘿卜素能否通過(guò)抑制NLRP3 來(lái)緩解MF，為MF 的治療提供新的藥物治療方向。

1 材料方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)程序均符合國(guó)家衛(wèi)生研究院（NIH）現(xiàn)行指南，并獲得廣西醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。選用長(zhǎng)沙天勤公司成年雄性SD大鼠18只，許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0014，使用許可證編號(hào)：SYXK 桂2014-0002，年齡6～8 周齡，體重280～320 g。在25 ℃、12 h 的光暗周期下，大鼠能夠自由獲取水和食物，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均在廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物及相關(guān)試劑 β-胡蘿卜素購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司（貨號(hào)：C110501-5 g），異丙腎上腺素購(gòu)于大連美侖生物技術(shù)有限公司（貨號(hào)：MB5204），二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)于北京索萊寶有限公司（貨號(hào)：CAS＃67-68-5），鼠抗NLRP3抗體購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司（貨號(hào)bs-10021R，稀釋1∶2 000），鼠抗GAPDH抗體購(gòu)于Proteintech抗體公司（貨號(hào)：60004-1-Ig，稀釋1∶5 000），鼠抗caspase-1購(gòu)于Abmart抗體公司（貨號(hào)：P29466，稀釋1∶1 000）Ⅰ型膠原多克隆抗體購(gòu)于Proteintech抗體公司（貨號(hào)：14695，稀釋1:200）、Ⅲ型膠原多克隆抗體購(gòu)于Proteintech 抗體公司（貨號(hào)22734，稀釋1∶1 000）、兔抗IL-1β抗體購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司（貨號(hào)：bs-0812R，稀釋1∶400）、兔抗IL-18抗體購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司（貨號(hào)：bs-0529R，稀釋1∶400），二抗購(gòu)于Servicebio 抗體公司（貨號(hào)：GB233303，稀釋1∶200）。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及處理 18 只SD 大鼠在適應(yīng)1 周后，隨機(jī)分成對(duì)照組、模型組及β-胡蘿卜素組，每組6 只。對(duì)照組皮下注射生理鹽水（5 mg/kg）及灌胃1 mL二甲基亞砜（DMSO）；模型組僅皮下注射異丙腎上腺素（ISO）（5 mg/kg）及灌胃1 mL DMSO，β-胡蘿卜素組皮下注射ISO（5 mg/kg）及灌胃β-胡蘿卜素（30 mg/kg,1 mL DMSO 溶解）[13]。大鼠MF 模型的建立：采用皮下注射ISO，每日5 mg/kg，皮下注射均為下午，且連續(xù)10 d[16]。第11天，對(duì)大鼠使用過(guò)量戊巴比妥（150 mg/kg）深度麻醉后處死，取出心臟稱(chēng)重，剪取部分左心室心臟組織為Western blotting 實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備，余下放入4%組織固定液中固定作切片。

1.4 免疫印跡實(shí)驗(yàn)（Western blotting）檢測(cè)NLRP3、caspase-1、caspase-1-p20 相對(duì)表達(dá)量 將大鼠心臟組織從-80 ℃冰箱取出，加入RIPA 裂解液，用低溫組織研磨機(jī)在4 ℃、60 Hz 下作用50 s 提取總蛋白。使用BCA 蛋白質(zhì)分析試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。使用SDS-PAGE電泳與濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，在5%濃度的脫脂牛奶中封閉后清洗，加入NLRP3、caspase-1 抗體，4 ℃冰箱孵育過(guò)夜。再經(jīng)過(guò)二抗孵育顯影。

1.5 大鼠心肌組織的心臟指數(shù)檢測(cè) 在麻醉后處死大鼠前測(cè)量每只動(dòng)物的體重，將心臟取出吸干心臟組織表面水分再后測(cè)量其心臟重量，通過(guò)將心臟重量（mg）除以體重（g）來(lái)評(píng)估心臟指數(shù)。

1.6 大鼠心臟Masson 染色 心室組織收集于4%甲醛溶液中，石蠟包埋，切片為5 μm，并使用Masson三色染色。在光學(xué)顯微鏡下觀察染色切片，每個(gè)切片隨機(jī)選擇3個(gè)區(qū)域，以檢查組織學(xué)外觀和與MF相關(guān)的變化。

1.7 大鼠心肌組織的免疫組化分析Ⅰ型膠原蛋白（Collagen Ⅰ）、Ⅲ型膠原蛋白（Collagen Ⅲ）、IL-1β、IL-18 表達(dá)量 心臟組織在二甲苯和系列乙醇稀釋液中再水化，并在室溫下用3%牛血清白蛋白（BSA）封閉30 min。然后將切片分別加入Ⅰ型膠原多克隆抗體、Ⅲ型膠原多克隆抗體、兔抗IL-1β 抗體、兔抗IL-18 抗體在4 ℃下孵育過(guò)夜。羊抗兔二抗在室溫下孵育1 h。用磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）清洗組織，用二氨基聯(lián)苯胺染色，并在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 8.0和SPSS 22.0中進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。所有計(jì)數(shù)資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間兩兩比較采用Tukey檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 β-胡蘿卜素對(duì)心臟指數(shù)的影響 與對(duì)照組比較，在模型組心臟指數(shù)較高（P＜0.05），說(shuō)明模型建成后心臟發(fā)生MF 使心臟肥厚；β-胡蘿卜素組心臟指數(shù)與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠心臟指數(shù)比較

表1 各組大鼠心臟指數(shù)比較

與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05。

2.2 β-胡蘿卜素對(duì)大鼠MF范圍的影響 觀察大鼠心臟樣本Masson 染色顯示MF 范圍主要在心肌內(nèi)膜，模型組的MF 程度顯著，說(shuō)明建模成功，β-胡蘿卜素組MF程度明顯減少，見(jiàn)圖1。

圖1 大鼠心臟組織肉眼觀及Masson染色結(jié)果

2.3 β-胡蘿卜素能夠降低MF 大鼠NLRP3 和caspase-1-p20 的表達(dá) 與對(duì)照組比較，模型組NLRP3和caspase-1-p20的蛋白表達(dá)量增加（均P＜0.05）；與模型組比較，β-胡蘿卜素組NLRP3 和caspase-1-p20的蛋白表達(dá)量降低（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠心肌組織中NLRP3、procaspase-1、caspase-1-p20的表達(dá)情況

2.4 β-胡蘿卜素對(duì)大鼠MF 中IL-1β、IL-18、Collagen Ⅰ、CollagenⅢ因子的影響 與對(duì)照組比較，模型組大鼠的IL-1β、IL-18、Collagen Ⅰ、CollagenⅢ表達(dá)量升高（均P＜0.05）；與模型組比較，β-胡蘿卜素組大鼠的IL-1β、IL-18、Collagen Ⅰ、CollagenⅢ蛋白表達(dá)量降低（均P＜0.05），見(jiàn)圖3、圖4。

圖3 大鼠心肌組織中IL-1β、IL-18的免疫組化結(jié)果

圖4 各組大鼠心肌組織中Collagen Ⅰ、CollagenⅢ的免疫組化結(jié)果

3 討論

炎性疾病中，NLRP3炎性小體是一種多蛋白復(fù)合物，由一個(gè)受體、一個(gè)接頭蛋白和procaspase-1 組成，誘導(dǎo)IL-1β、IL-18 成熟并分泌[17]。許多研究發(fā)現(xiàn)，一些NLRP3抑制劑能夠有效減少炎癥的發(fā)生發(fā)展。在心肌梗死引起強(qiáng)烈炎癥，IL-1β 和IL-18 是此反應(yīng)的關(guān)鍵因素，MCC950 選擇性抑制NLRP3，減少剪切體的形成，抑制IL-1β、IL-18 的成熟，減少心肌梗死及纖維化范圍[18]。MF常與NLRP3的過(guò)量表達(dá)息息相關(guān)。如糖尿病型心肌病中MF是其主要心臟病理變化之一，Wang等[19]研究者發(fā)現(xiàn)雜色云芝能夠抑制NLRP3 的表達(dá)，可使caspase-1、IL-1β 以及IL-18分泌減少，從而降低MF的程度。

β-胡蘿卜素作為類(lèi)或蘿卜素的一種，被證實(shí)能夠抑制炎癥反應(yīng)和炎癥因子。如Rodríguez 等[20]研究中發(fā)現(xiàn)，缺乏β-胡蘿卜素的兒童體內(nèi)炎癥因子IL-6的水平高于正常攝入β-胡蘿卜素的兒童。痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的研究中發(fā)現(xiàn)，β-胡蘿卜素與NLRP3-PYD的直接結(jié)合干擾了NLRP3-PYD 和ASC-PYD 之間的相互作用，從而抑制痛風(fēng)晶石誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體的激活，減少了膝關(guān)節(jié)組織隨后的炎癥癥狀[13]。

為探索β-胡蘿卜素在MF 中是否存在相似作用，本實(shí)驗(yàn)中采用了與痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎研究中相同的β-胡蘿卜素的劑量30 mg/kg對(duì)MF模型的大鼠進(jìn)行灌胃治療，從Masson染色的結(jié)果來(lái)看模型組因ISO作用心肌細(xì)胞排列混亂，細(xì)胞間質(zhì)纖維蛋白增加，而經(jīng)β-胡蘿卜素治療后，心肌細(xì)胞排列緊密有序，細(xì)胞間質(zhì)纖維蛋白減少，且免疫組化結(jié)果顯示β-胡蘿卜素組中MF 的主要標(biāo)志物纖維蛋白CollagenⅠ、CollagenⅢ的表達(dá)量相較于模型組減少（均P＜0.05）。針對(duì)NLRP3 進(jìn)行Western blotting 發(fā)現(xiàn)NLRP3 在模型組中表達(dá)量增加（均P＜0.05），表明MF與NLRP3表達(dá)增加有關(guān)，而β-胡蘿卜素治療后其表達(dá)量下降，并且caspase-1-p20 的表達(dá)量也有下降（均P＜0.05）。有研究表明，NLRP3 與caspase-1 結(jié)合產(chǎn)生caspase-1-p20，即NLRP3 表達(dá)增加將使caspase-1-p20表達(dá)增加，作為一種剪切體caspase-1-p20能夠?qū)⑶绑wIL-18 及前體IL-1β 剪切為成熟體,激活后的IL-1β、IL-18則釋放到細(xì)胞外，引起組織細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[21]。免疫組化結(jié)果則發(fā)現(xiàn)β-胡蘿卜素組細(xì)胞間炎癥介質(zhì)IL-1β、IL-18的表達(dá)量低于模型組（均P＜0.05），說(shuō)明β-胡蘿卜素可能通過(guò)減少NLRP3繼而抑制剪切體caspase-1-p20的表達(dá)從而減少I(mǎi)L-18、IL-1β的表達(dá)。

綜上所述，β-胡蘿卜素可減少心肌組織中NLRP3 的表達(dá)進(jìn)而減少細(xì)胞間質(zhì)中炎癥指標(biāo)IL-1β、IL-18 以及膠原纖維指標(biāo)Collagen Ⅰ、CollagenⅢ的表達(dá)延緩MF的發(fā)展。但研究尚未能探索到更深入的分子結(jié)構(gòu)機(jī)制，仍有待進(jìn)一步研究，期望為MF的治療提供新藥物治療方向。