田 雪，車 前，嚴(yán)偉敏，歐全宏，時(shí)有明，劉 剛*

1.云南師范大學(xué)物理與電子信息學(xué)院，云南 昆明 650500 2.曲靖師范學(xué)院物理與電子工程學(xué)院，云南 曲靖 655011

引 言

小米，又稱為粟，是世界上最古老的農(nóng)作物之一，源于中國(guó)黃河流域，主要分布在華北，東北、西北等地區(qū)[1]。小米營(yíng)養(yǎng)豐富，含有多種維生素、蛋白質(zhì)、脂肪、糖類，以及鈣、鐵等人體所必需的微量元素，具有健胃消食安神、滋陰養(yǎng)血和催乳補(bǔ)身的功效，被視為產(chǎn)婦、嬰兒及老人的滋補(bǔ)佳品[2]。我國(guó)小米產(chǎn)出豐富，不同品種和不同產(chǎn)地的小米，雖然外觀無明顯差別，但口感及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值存在差異。例如，李星等[1]研究發(fā)現(xiàn)不同品種小米的蛋白和淀粉含量存在顯著差異，同一產(chǎn)區(qū)(山西)不同品種小米營(yíng)養(yǎng)成分也存在差異；梁克紅等[3]研究結(jié)果表明地域因素對(duì)小米營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的影響作用更大，主要對(duì)小米中的蛋白質(zhì)、脂肪和膳食纖維含量產(chǎn)生影響，而品種因素主要對(duì)蛋白質(zhì)和脂肪含量產(chǎn)生影響；馮耐紅等[4]研究結(jié)果表明山西產(chǎn)的不同品種小米的營(yíng)養(yǎng)成分(水分、蛋白、脂肪、碳水化合物等)含量存在差異，并對(duì)氨基酸組分進(jìn)行分析，得出其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的高低變化情況?？梢姴煌贩N、不同產(chǎn)地生長(zhǎng)環(huán)境可以造成小米品質(zhì)的差異。因此，對(duì)不同品種及產(chǎn)地小米的鑒別對(duì)消費(fèi)者有重要的參考意義。

目前，常用的分析方法，有感官方法、高效液相色譜法(HPLC)[5]、紫外-可見光譜法[6]、熒光光譜法[7]等；感官方法存在主觀性，其余方法則存在破壞性，且操作繁瑣、成本高、耗時(shí)長(zhǎng)。因此，需要建立一種可靠、準(zhǔn)確、快速的小米品種及產(chǎn)地的鑒別方法。

傅里葉變換紅外光譜(FTIR)具有用樣少、制樣快速、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，已應(yīng)用于天然產(chǎn)物的鑒別研究[8-10]。但采用紅外光譜技術(shù)分析鑒別不同品種、不同產(chǎn)地小米的報(bào)道較少。由于各產(chǎn)地種植的小米品種眾多，很難尋求品種的統(tǒng)一性，我們由此選擇各地區(qū)最為廣泛種植且具有當(dāng)?shù)靥禺愋缘钠贩N進(jìn)行分析。利用FTIR、二維相關(guān)紅外光譜(2D-IR)結(jié)合曲線擬合和主成分分析(PCA)，對(duì)山東濟(jì)南市的三種代表性小米進(jìn)行品種鑒別及九個(gè)不同產(chǎn)區(qū)的代表性小米進(jìn)行產(chǎn)地分類，以期發(fā)展為區(qū)分不同品種不同產(chǎn)地小米的快速方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器

美國(guó)Perkin Elmer公司產(chǎn)的Frontier型傅里葉變換紅外光譜儀，配備DTGS探測(cè)器，壓片模具為天津諾雷信達(dá)科技有限公司的YP-2型壓片機(jī)。動(dòng)態(tài)光譜使用的溫度控制儀型號(hào)為Eurotherm公司的SYD-TC-01型溫控儀。

1.2 樣品及制備

樣品品種及產(chǎn)地信息見表1，其中a—c分別表示山東濟(jì)南市的三個(gè)品種濟(jì)谷25號(hào)、濟(jì)谷1165號(hào)和金粟4號(hào)，d—k分別表示小米主要產(chǎn)區(qū)的代表性品種：河北懷安的大白谷、河北蔚縣的8311號(hào)、山西沁縣的沁黃2號(hào)、山西呂梁的汾州香、山西太原的富硒黃、陜西榆林的米脂小米、陜西延安的軟黃米和遼寧朝陽的大金苗，所有小米樣品均于2020年收獲。

表1 實(shí)驗(yàn)用小米品種及產(chǎn)地信息

將小米置于室溫下干燥處理，去除外殼破損、顏色暗沉的小米。之后，利用瑪瑙研缽將其研磨成粉備用。

1.3 光譜測(cè)量與數(shù)據(jù)處理

利用溴化鉀(KBr)壓片法進(jìn)行紅外光譜檢測(cè)，樣品與KBr比約為1∶15。紅外光譜儀參數(shù)設(shè)置：分辨率為4 cm-1，波數(shù)范圍為4 000～400 cm-1，掃描次數(shù)為16次；動(dòng)態(tài)光譜測(cè)溫范圍為50～120 ℃，每隔1 min升溫2 ℃，每隔10 ℃測(cè)試一次動(dòng)態(tài)紅外光譜。

采用OMNIC 8.2軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)所得原始光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行基線校正、5點(diǎn)平滑、平均譜圖、縱坐標(biāo)歸一化和導(dǎo)數(shù)譜圖等預(yù)處理；運(yùn)用Origin 9軟件對(duì)光譜數(shù)據(jù)處理、繪圖，以及利用其Peak Analyzer功能進(jìn)行曲線擬合分析；利用 Spectrum 10.03軟件對(duì)動(dòng)態(tài)光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行基線修正處理，采用清華大學(xué)分析中心編制的TD 4.2軟件對(duì)動(dòng)態(tài)光譜進(jìn)行二維相關(guān)紅外光譜處理分析；采用The Unscrambler X 10.4軟件，以導(dǎo)數(shù)光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 小米的原始紅外光譜分析

圖1 11種不同小米的FTIR光譜

表2 小米的主要特征峰及歸屬

2.2 小米的二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜分析

二階導(dǎo)數(shù)光譜能夠顯示更多的信息。圖2為小米樣品的二階導(dǎo)數(shù)光譜。從圖中可以看出不同樣品的光譜在峰數(shù)、峰位和峰強(qiáng)上存在一定的差異。在3 012 cm-1(不飽和碳的C—H的反對(duì)稱伸縮振動(dòng)[14])、2 962 cm-1(—CH3的反對(duì)稱伸縮振動(dòng)[14])附近，g和f出現(xiàn)了近似等強(qiáng)度的吸收峰，與其他樣品相比明顯較強(qiáng)，a和j的吸收峰較不明顯，而b沒有出現(xiàn)這個(gè)吸收峰；2 928和2 856 cm-1附近峰強(qiáng)有明顯差異，g的吸收峰強(qiáng)度與其他樣品相比較強(qiáng)，b較弱；1 748 cm-1附近g的吸收峰強(qiáng)度與其他樣品相比較強(qiáng)，b的吸收峰不明顯，j沒有出現(xiàn)這個(gè)吸收峰；1 548 cm-1(蛋白質(zhì)酰胺Ⅱ帶)附近a，c，d和g吸收峰與其他樣品相比明顯較強(qiáng)?；谝陨戏治觯@些峰強(qiáng)度的差異可能與不同種小米的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的含量不同有關(guān)，可以用于對(duì)小部品種及產(chǎn)地進(jìn)行部分區(qū)分。

圖2 11種不同小米的二階導(dǎo)數(shù)光譜

2.3 小米的二維紅外光譜分析

二維相關(guān)紅外光譜能獲取微弱和重疊的特征光譜信息。

圖中等高線所形成的紅色相關(guān)峰為正相關(guān)峰，等高線所形成的藍(lán)色相關(guān)峰為負(fù)相關(guān)峰。根據(jù)二維相關(guān)紅外光譜理論，同步相關(guān)紅外光譜是關(guān)于主對(duì)角線對(duì)稱，位于對(duì)角線上的峰是動(dòng)態(tài)光譜信號(hào)自身相關(guān)得到，稱為自動(dòng)峰，總是正峰，代表化學(xué)基團(tuán)對(duì)溫度微擾的敏感程度，自動(dòng)峰越強(qiáng)，說明對(duì)溫度的熱微擾越敏感。處于非對(duì)角線上的峰為交叉峰，有正負(fù)之分，如果2個(gè)不同的官能團(tuán)在溫度變化中振動(dòng)方向一致(信號(hào)相差為0)，出現(xiàn)一組正交叉峰；若2個(gè)不同的官能團(tuán)在溫度變化中振動(dòng)方向相反(信號(hào)相差為π)，出現(xiàn)一組負(fù)交叉峰[11]。從二維相關(guān)光譜圖中可以看出，在1 200～860 cm-1(圖3)、1 700～1 180 cm-1(圖4)范圍內(nèi)自動(dòng)峰和交叉峰的數(shù)目、強(qiáng)度和位置都有明顯的差異。

圖3 不同小米1 200～860 cm-1的二維相關(guān)紅外光譜

圖4 不同小米1 700～1 180 cm-1的二維相關(guān)紅外光譜

圖3為11種小米在1 200～860 cm-1范圍內(nèi)的二維相關(guān)紅外光譜，其自動(dòng)峰的情況如表3所示。b和h的自動(dòng)峰數(shù)目最多，均為10個(gè)，但b的自動(dòng)峰強(qiáng)度相比h更強(qiáng)，峰位也存在差異；其中，b出現(xiàn)9個(gè)負(fù)交叉峰，1 010 cm-1與其他自動(dòng)峰均形成負(fù)交叉峰，其余交叉峰為正，h有21個(gè)負(fù)交叉峰，1 000，1 020和1 050 cm-1分別與其他自動(dòng)峰形成負(fù)交叉峰，其余交叉峰為正。k出現(xiàn)9個(gè)清晰的自動(dòng)峰，所有交叉峰均為正交叉峰。c，e和j出現(xiàn)8個(gè)強(qiáng)自動(dòng)峰，但是弱自動(dòng)峰和次強(qiáng)峰的位置不同；c在(1 010, 1 040 cm-1)處的交叉峰為負(fù)，其余交叉峰為正，e有7個(gè)負(fù)交叉峰，1 000 cm-1與其他自動(dòng)峰均形成負(fù)交叉峰，j的交叉峰均為正交叉峰。a，d，g和i出現(xiàn)7個(gè)強(qiáng)自動(dòng)峰，但是最強(qiáng)自動(dòng)峰、弱自動(dòng)峰和次強(qiáng)峰的位置存在差異；其中a和i的交叉峰均為正交叉峰，但是正交叉峰的位置和強(qiáng)度存在顯著差異，d和g均出現(xiàn)了1 000 cm-1與其他自動(dòng)峰形成的6個(gè)負(fù)交叉峰，g交叉峰的強(qiáng)度明顯強(qiáng)于d。f只出現(xiàn)6個(gè)自動(dòng)峰，所有交叉峰均為正交叉峰。表3總結(jié)了不同品種樣品光譜的自動(dòng)峰數(shù)目、位置和強(qiáng)度差異。結(jié)果表明，不同地域及品種因素可能影響小米中淀粉和多糖結(jié)構(gòu)或含量的變化。

表3 不同小米的二維相關(guān)紅外光譜在1 200～860 cm-1的自動(dòng)峰

圖4為小米在1 700～1 180 cm-1范圍的二維相關(guān)紅外光譜，這個(gè)范圍為蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂質(zhì)振動(dòng)區(qū)[11]，其自動(dòng)峰的情況見表4。k出現(xiàn)10個(gè)清晰的自動(dòng)峰，9個(gè)1 640 cm-1與其他自動(dòng)峰形成的負(fù)交叉峰，其余交叉峰均為正，數(shù)目最多。i和j均有7個(gè)自動(dòng)峰，其中，j的自動(dòng)峰強(qiáng)度較強(qiáng)，有6個(gè)負(fù)交叉峰，i有5個(gè)負(fù)交叉峰，其余交叉峰為正。e和h自動(dòng)峰數(shù)目均為6，但是e的自動(dòng)峰強(qiáng)度明顯強(qiáng)于h，次強(qiáng)峰的位置不同，e出現(xiàn)5個(gè)負(fù)交叉峰，h出現(xiàn)4個(gè)負(fù)交叉峰，其余交叉峰為正。a，b，c，d，f和g均出現(xiàn)了5個(gè)強(qiáng)自動(dòng)峰，4個(gè)負(fù)交叉峰，其余交叉峰為正，但是a的負(fù)交叉峰是1 650 cm-1與其他自動(dòng)峰形成的，c在(1 230, 1 640 cm-1)處的負(fù)交叉峰是a，b，d，f和g樣品沒有出現(xiàn)的，其他4個(gè)樣品的自動(dòng)峰和交叉峰的位置和強(qiáng)度存在差異。11種小米樣品自動(dòng)峰和交叉峰的位置、強(qiáng)度和數(shù)目的不同，說明這些差異可能與小米間蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和多糖結(jié)構(gòu)含量的不同有關(guān)，這與梁克紅等[3]認(rèn)為品種及地域因素主要影響小米中蛋白質(zhì)和脂肪含量變化的觀點(diǎn)一致。

表4 不同小米的二維相關(guān)紅外光譜在1 700～1 180 cm-1的自動(dòng)峰

由以上分析結(jié)果表明，11種不同小米的二維相關(guān)光譜在1 200～860 cm-1范圍的自動(dòng)峰和交叉峰位置、數(shù)目和強(qiáng)度都有明顯不同，說明不同地域及品種小米間所含的碳水化合物含量存在較大的差異；在1 700～1 180 cm-1范圍的強(qiáng)自動(dòng)峰的位置整體相近，但是交叉峰的數(shù)目和強(qiáng)度、弱自動(dòng)峰的位置和最強(qiáng)自動(dòng)峰的強(qiáng)度存在差異，這些差異說明樣品中的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和多糖含量或結(jié)構(gòu)存在不同，因此利用這些差異能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)不同品種及產(chǎn)地小米的有效鑒別。

2.4 曲線擬合分析

曲線擬合基于Lorentzian-Gaussian函數(shù)對(duì)特定波數(shù)范圍的FTIR光譜進(jìn)行疊加峰分離擬合的分析方法，能簡(jiǎn)單、快速地分離出光譜中重疊的子峰，并獲得子峰的面積比例，從而初步估算出子峰的化學(xué)成分的相對(duì)含量。當(dāng)擬合結(jié)果的相關(guān)系數(shù)R2值大于0.999時(shí)，則結(jié)果有效可信[15]。

選取山東省3個(gè)常見品種在1 700～1 600 cm-1范圍的原始紅外光譜進(jìn)行曲線擬合分析，子峰的峰位和面積比例如表5所示。分析可得，3種小米都擬合出了9個(gè)子峰，吸收頻率的位置基本沒有多大差別，但各個(gè)子峰的峰面積和峰面積的百分比存在明顯差別。a峰面積百分比最大的出現(xiàn)在子峰5：1 661 cm-1；b峰面積百分比最大的出現(xiàn)在子峰4：1 645 cm-1；c峰面積百分比最大的出現(xiàn)在子峰4：1 656 cm-1。其中，在1 640，1 648，1 661和1 673 cm-1處子峰有明顯的差別。在1 640 cm-1附近，c的峰面積百分比最高(16.62%)，b峰面積百分比最低(0.15%)；1 648 cm-1附近，b峰面積百分比最高(29.75%)，a峰面積百分比最低(14.51%)；1 661 cm-1附近，a峰面積百分比最高(30.28%)，c的峰面積百分比最低(18.57%)；1 673 cm-1附近，b峰面積百分比最高(16.10%)，c的峰面積百分比最低(8.95%)，結(jié)果說明不同品種小米間蛋白質(zhì)含量不同。因此利用曲線擬合分析能夠有效地對(duì)小米品種進(jìn)行分類。

圖5 3種小米樣品在1 700～1 600 cm-1范圍曲線擬合譜

表5 三種小米在1 700～1 600 cm-1范圍的特征峰峰面積百分比

2.5 主成分分析

主成分分析(PCA)是通過線性變換從多個(gè)變量中選出較少個(gè)數(shù)重要變量的一種多元統(tǒng)計(jì)分析方法。特征向量也稱為主成分，每個(gè)主成分對(duì)應(yīng)于數(shù)據(jù)矩陣的每一個(gè)方差源。第一主成分?jǐn)M合數(shù)據(jù)中的最大方差，其他主成分以此類推[16]。選取9個(gè)不同產(chǎn)地小米樣品1 800～800 cm-1范圍的導(dǎo)致光譜進(jìn)行主成分分析，得到主成分得分圖與主要成分(PC-1)載荷圖，如圖6所示。PC-1占總方差貢獻(xiàn)率為78%，PC-2占總方差貢獻(xiàn)率為17%，PC-3占總方差貢獻(xiàn)率為2%，3個(gè)主成分累積貢獻(xiàn)率達(dá)到了97%。圖6(a)為三維得分圖，9個(gè)產(chǎn)地的小米分別聚合在9個(gè)不同的區(qū)域，并且它們分別各自聚在一起。河北蔚縣的小米樣品對(duì)于其他的樣品而言，較為分散；山西沁縣和山西呂梁的小米樣品距離較近，說明其化學(xué)成分及含量較近；陜西和河北的小米樣品有較好的聚類效果。結(jié)果表明，利用PCA能夠?qū)?個(gè)不同產(chǎn)地的小米進(jìn)行準(zhǔn)確分類。同時(shí)，通過圖6(b)PC-1的載荷圖，發(fā)現(xiàn)在1 748，1 666，1 465，1 178和975 cm-1附近出現(xiàn)較強(qiáng)的吸收峰，對(duì)應(yīng)飽和脂肪酸、蛋白質(zhì)和多糖的伸縮振動(dòng)吸收峰。由此推斷小米中脂肪、蛋白質(zhì)和多糖含量的差異是主成分判別的主要依據(jù)，在PC-1的產(chǎn)地分類中承擔(dān)主要貢獻(xiàn)。

圖6 不同產(chǎn)地的小米在1 800～800 cm-1范圍的主成分分析

3 結(jié) 論

將FTIR、二階導(dǎo)數(shù)光譜(SD-IR)、2D-IR和統(tǒng)計(jì)分析方法相結(jié)合，對(duì)不同品種小米樣品進(jìn)行鑒別研究。結(jié)果顯示，F(xiàn)TIR吸收峰主要由蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和碳水化合物的吸收峰組成，光譜總體基本相似。SD-IR在3 100～1 700 cm-1范圍內(nèi)，不同樣品的光譜在峰數(shù)、峰位和峰強(qiáng)上存在一定的差異。2D-IR在1 200～860 cm-1范圍內(nèi)，所有樣品自動(dòng)峰和交叉峰的位置、數(shù)目和強(qiáng)度都存在明顯差異；在1 700～1 180 cm-1范圍內(nèi)主要體現(xiàn)出自動(dòng)峰和交叉峰的強(qiáng)度、數(shù)目和弱自動(dòng)峰的位置不同。曲線擬合選取1 700～1 600 cm-1(蛋白質(zhì)的酰胺Ⅰ區(qū))范圍內(nèi)進(jìn)行分析，以其子峰面積比例及蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)成分的變化能夠區(qū)分山東省3種不同品種的小米，蛋白質(zhì)的差異可能與品種內(nèi)在的基因有關(guān)。利用PCA可以達(dá)到9個(gè)不同產(chǎn)地小米的獨(dú)立聚類，且發(fā)現(xiàn)PCA主要依據(jù)脂肪、蛋白質(zhì)和糖類的差異實(shí)現(xiàn)小米產(chǎn)地的分類鑒別，而導(dǎo)致這些差異的原因有很多，包括氣溫、水分、光照、海拔、經(jīng)緯和土壤等，其中適宜的溫度能促進(jìn)谷子中蛋白質(zhì)的合成，并且與土壤中礦質(zhì)元素含量關(guān)系密切；脂肪和多糖含量均與溫度、降水量和日照時(shí)數(shù)密切相關(guān)。結(jié)果表明，將 FTIR與統(tǒng)計(jì)分析方法相結(jié)合，能夠有效、快速的區(qū)分不同品種和產(chǎn)地的小米，以期為小米的開發(fā)利用和深入研究提供參考。