李昊 曾珊 邱茜 肖游君 徐思琪 王競男 石茂華 許韓師 梁柳琴

中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院風(fēng)濕免疫科（廣州 510080）

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）是一種累及多系統(tǒng)、多器官的異質(zhì)性自身免疫性疾病，以自身反應(yīng)性B淋巴細(xì)胞多克隆增殖活化及產(chǎn)生大量致病性自身抗體為特點(diǎn)［1］。體內(nèi)B 細(xì)胞的平衡被破壞，是SLE疾病活動的特點(diǎn)，包括幼稚B 細(xì)胞減少、IgD/CD27雙陰性細(xì)胞增加、記憶性B 細(xì)胞增加及漿母細(xì)胞及漿細(xì)胞增加［2］。目前有多種以B 細(xì)胞為靶向的治療策略，如清除B 細(xì)胞及漿細(xì)胞（如利妥昔單抗）［3］、選擇性清除活性B 細(xì)胞（貝利尤單抗）［4］、阻斷病致病性抗體［abetimus（LJP?394）］［5］及阻止B細(xì)胞活化等（抗IFN［6］、抗IL?6［7］）。這些治療策略的有效性提示B 細(xì)胞是SLE 的重要治療靶細(xì)胞。

BET（bromodomain and extraterminal）家族蛋白是包含溴區(qū)蛋白（bromodomain?containing proteins，BRD）的一類，包括BRD2、BRD3、BRD4 和BRDT 四個(gè)成員，作為表觀遺傳閱讀器，參與調(diào)控多種免疫反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)。BET 家族成員的異常，往往導(dǎo)致生理及病理過程的失調(diào)，在免疫及炎癥性疾病中具有重要的致病作用。因而以其為治療靶點(diǎn)，可調(diào)控免疫系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而可能在免疫相關(guān)性疾病中發(fā)揮治療作用［8］。BRD4 作為研究最為廣泛的BET 蛋白，調(diào)節(jié)不同的生物過程，包括細(xì)胞周期［9］、炎癥［10-11］、維持高級染色質(zhì)結(jié)構(gòu)［12］和DNA損傷信號［13］，在多種刺激下于多種固有免疫細(xì)胞及非免疫細(xì)胞中表達(dá)升高，主要通過激活多種免疫和炎癥基因轉(zhuǎn)錄發(fā)揮促炎作用，進(jìn)而促進(jìn)自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展［14-15］。筆者既往的研究證實(shí)BRD4 參與調(diào)控SLE 外周血漿細(xì)胞分化過程，抑制劑PFI?1 在狼瘡腎炎模型中具有重要的治療作用［16］，但第一代合成的BET 抑制劑JQ1，以模擬乙?；嚢彼岵糠峙cBET 蛋白家族成員的溴結(jié)構(gòu)域結(jié)合發(fā)揮抑制BET 蛋白尤其是BRD4 蛋白活性的作用［10，17］，目前尚未見其對SLE作用的文獻(xiàn)報(bào)道。

本研究擬探討B(tài)RD4 蛋白在SLE 外周血B 細(xì)胞分化中的作用，擬進(jìn)一步明確BET 蛋白抑制劑JQ?1 對SLE 外周血B 細(xì)胞功能的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 樣本來源 本研究使用的46 例SLE 患者外周血標(biāo)本來源于中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院?；颊呒{入標(biāo)準(zhǔn)：（1）女性，年齡19～38 歲；（2）符合1997年修訂的美國風(fēng)濕病學(xué)會（American College of Rheuma?tology，ACR）SLE 分類標(biāo)準(zhǔn)；（3）初發(fā)未經(jīng)激素和/或免疫抑制劑治療，或病情穩(wěn)定小量激素維持治療的患者即經(jīng)SLE 疾病活動性指數(shù)（SLE disease activity index，SLEDAI［18］）?2000 評估為基本無活動或低度活動的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)SLE 疾病活動性指數(shù)（SLE disease activity index，SLEDAI［18］）?2000 評估為中度或高度活動的患者；（2）存在其他自身免疫病，心、肝、血液及腫瘤疾病，感染性疾病及其他代謝疾病；（3）妊娠期、哺乳期婦女。實(shí)驗(yàn)符合1975年赫爾辛基宣言（The Declaration of Helsinki）的相關(guān)規(guī)定，并得到中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會及提供標(biāo)本的醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)?；颊咴\斷明確，符合各項(xiàng)納入標(biāo)準(zhǔn)，并無排除標(biāo)準(zhǔn)各項(xiàng)情況，自愿同意，簽署知情同意書后納入本項(xiàng)研究，經(jīng)肘部靜脈采血收集其外周靜脈血標(biāo)本于肝素抗凝管中。

本研究納入的健康志愿者（HC）為中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院的健康志愿者，其性別、年齡均與納入的SLE 患者匹配，所有參與志愿者均已簽署知情同意書，并得到中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會及提供標(biāo)本的醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 SLE 外周血PBMC 的提取 采取密度梯度離心（Ficoll?Paque）法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞。取SLE 患者外周靜脈血15～20 mL，PBS（Gibco，美國）稀釋，加入淋巴細(xì)胞分離液（GE Healthcare，瑞典）離心，收集白色窄帶層于離心管中，PBS 洗滌2 次，用RMPI?1640 培養(yǎng)基（Gibco，美國）將細(xì)胞重懸并定容。

1.2.2 人外周血CD19+B 淋巴細(xì)胞磁珠分選純化（陰選） 根據(jù)Human B Lymphocyte Enrichment Set?DM（BD，美國）說明書操作，使用BD IMagTMbuffer（BD，美國）重懸細(xì)胞，加入Biotinylated Human B Lymphocyte Enrichment Cocktail（BD，美國），室溫孵育15 min，用10 倍體積的BD IMagTMbuffer 洗滌，加入BD IMagTMStreptavidin Particles Plus?DM（BD，美國），室溫孵育30 min，過磁力架6 ～ 8 min，吸取上清（enriched fraction）放入新的流式管，加入1 mL BD IMagTMbuffer 重懸positive?fraction，重新置于磁力架6 ～ 8 min，吸取上清，與enriched fraction 合并，將combined enriched fraction 再過一遍磁力架6 ～ 8 min，吸取上清，放入新的流式管中，為twice?enriched fraction，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 SLE B 細(xì)胞體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn) 將分離純化的B 細(xì)胞懸液（1 × 106/mL）以2 × 105/200 μL/孔接種于96 孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板中，按實(shí)驗(yàn)分組在培養(yǎng)體系中加入（co?stimulate）或不加入（nil）Goat anti?IgM F（ab′）fragment（Jackson，美 國）（5 μg/mL）、Monoclonal mouse anti?CD40L（RD，美 國）（1 μg/mL）、CpG ODN2006（Invivogen，美國）（5 μmol/L）、Recombinant Human IL?4（Pepro Tech，美國）（40 ng/mL），Recombinant Human IL?2（Pepro Tech，美國）（10 ng/mL）共刺激，按實(shí)驗(yàn)分組在co?stimulate 培養(yǎng)體系中不加入（control 組）或加入JQ1（300 nmol/L）（JQ1 組）分別培養(yǎng)7 d 后收集細(xì)胞備用。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 根據(jù)凋亡試劑盒（BD，美國）說明書操作，將B 細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，收集于5 mL 流式管中，每個(gè)樣品加入Annexin V/PI 各50 μL，室溫避光孵育15 min，加入200 μL binding buffer 重懸，30 min 內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測（Cyto FLEX，BD，美國）。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞增殖 在避光條件下加入CFSE（eBioscience，美國），孵育15 min，終止染色，離心棄上清，保留沉淀，重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.6 人外周血漿母細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化 將分離純化的B 細(xì)胞接種于96 孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板，按實(shí)驗(yàn)分組加入或不加入Goat anti?IgM F（ab′）fragment（Jackson，美國）（5 μg/mL）、Monoclonal mouse anti?CD40L（RD，美國）（1 μg/mL）、CpG ODN2006（Invi?vogen，美國）（5 μmol/L）、Recombinant Human IL?10（Pepro Tech，美國）（50 ng/mL），Recombinant Hu?man IL?15（Pepro Tech，美國）（10 ng/mL）共刺激分別培養(yǎng)7 d 后收集細(xì)胞備用。

1.2.7 流式細(xì)胞術(shù)表面分子染色 收集單細(xì)胞懸液，PBS 洗滌，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分別加入0.5 μL Anti?human CD19?APC（Biolegend，美國）、Anti?human IgD?PE?Cy7（Biolegend，美國）、Anti?human CD27?PE（Biolegend，美國）、Anti?human CD38?FITC（Bioleg?end，美國）、Anti?human CD138?Brilliant Violet510（Biolegend，美國），于4 ℃避光孵育30 min，終止染色，離心棄上清，保留沉淀，重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.2.8 RT?qPCR 總RNA的提取采用Takara Prime?Script RT Reagent Kit（Takara Bio，日本），并在LC480系統(tǒng)中完成RT?qPCR（Roche，美國）。用2?△△CT檢測目的基因相對于甘油醛?3?磷酸脫氫酶（GAPDH）的表達(dá)。BRD4 及GAPDH 引物序列見表1。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所得數(shù)據(jù)用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用（）表示，兩組間計(jì)量資料比較使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組之間使用單因素方差分析，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BRD4 蛋白在健康對照組（HC）及SLE 患者外周血B 細(xì)胞中的表達(dá) 利用RT?qPCR 對HC 及SLE 患者B 細(xì)胞中BRD4 蛋白的mRNA 水平進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示SLE 外周血B 細(xì)胞中BRD4 的表達(dá)水平顯著高于HC 組（圖1）。

圖1 BRD4 蛋白在HC 及SLE 患者外周血B 細(xì)胞中的表達(dá)Fig.1 Expression of BRD4 in human peripheral B cells of HC and patients with SLE

2.2 BET 蛋白抑制劑JQ?1 對SLE 外周血B 細(xì)胞凋亡的影響 體外培養(yǎng)SLE 外周血B 細(xì)胞，通過Annexin V/PI 染色流式細(xì)胞術(shù)，檢測B 細(xì)胞中早期凋亡細(xì)胞（Annexin V+PI?）的比例。觀察到在培養(yǎng)7 d 時(shí)與陰性對照組（nil）相比，給予共刺激培養(yǎng)條件下B 細(xì)胞的早期凋亡細(xì)胞的比例同樣明顯減少，而加入300 nmol/L JQ1對細(xì)胞的凋亡無影響（圖2）。提示抑制BRD4 蛋白同樣對SLE 外周血活化的B細(xì)胞凋亡無影響。

圖2 BET 蛋白抑制劑JQ?1 對SLE 外周血B 細(xì)胞凋亡的影響Fig.2 Effect of JQ?1 on the apoptosis of human peripheral activated CD19+B cells

2.3 抑制BRD4 蛋白對SLE 外周血B 細(xì)胞增殖的影響 在培養(yǎng)7 d 時(shí)與陰性對照組（nil）相比，給予共刺激培養(yǎng)條件下B 細(xì)胞的增殖率明顯增加，JQ1處理組對細(xì)胞的增殖率無影響（圖3），提示抑制BRD4 蛋白對SLE 外周血活化的B 細(xì)胞增殖同樣無影響。

圖3 BET 蛋白抑制劑JQ?1 對SLE 外周血B 細(xì)胞增殖的影響Fig.3 Effect of JQ?1 on the proliferation of human peripheral activated CD19+B cells

2.4 BET蛋白抑制劑JQ?1對SLE外周血B細(xì)胞各亞群分化的影響 體外培養(yǎng)SLE 外周血B 細(xì)胞，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測B 細(xì)胞各亞群細(xì)胞（幼稚B 細(xì)胞、記憶B 細(xì)胞、漿母細(xì)胞及漿細(xì)胞）的百分比。觀察到在培養(yǎng)7 d 時(shí)與陰性對照組（nil）相比，給予共刺激培養(yǎng)條件下CD19+IgD+CD27-幼稚B 細(xì)胞、CD19+IgD-CD27+記憶B 細(xì)胞、CD19+IgD-CD27++漿母細(xì)胞、CD19+CD38++CD138+漿細(xì)胞亞群的比例均有所升高，而JQ?1 組使升高的漿母細(xì)胞、漿細(xì)胞亞群的比例受到抑制，且顯著抑制記憶性B 細(xì)胞分化，使幼稚性B 細(xì)胞亞群的比例顯著增加（圖4），提示抑制BRD4 蛋白同樣能顯著穩(wěn)定地抑制SLE 外周血漿母細(xì)胞途徑介導(dǎo)的漿細(xì)胞的分化。

圖4 BET 蛋白抑制劑JQ?1 對SLE 外周血B 細(xì)胞各亞群分化的影響Fig.4 Effect of Brd4 inhibition on the percentages of na?ve，memory，plasmablast，and plasma cells in CD19+B cells from patients with SLE

2.5 抑制BRD4 蛋白對SLE 外周血漿細(xì)胞分化的影響 為了進(jìn)一步闡述抑制BRD4 蛋白對SLE 外周血漿細(xì)胞分化的研究，利用外周血B 細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化為大量漿母細(xì)胞，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測CD19+IgD-CD38hi漿母細(xì)胞產(chǎn)生的比例。觀察到在培養(yǎng)7 d 時(shí)與陰性對照組（nil）相比，加入共刺激培養(yǎng)條件后導(dǎo)致SLE 中CD19+IgD-CD38hi漿母細(xì)胞比例大量增加，而JQ1 組使?jié){母細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用受到顯著抑制（圖5），進(jìn)一步提示抑制BRD4 蛋白可以顯著地抑制SLE 外周血漿母細(xì)胞途徑介導(dǎo)的漿細(xì)胞分化。

圖5 BET 蛋白抑制劑JQ?1 對SLE 外周血漿細(xì)胞分化的影響Fig.5 Effect of JQ?1 on differentiation of plasmablasts and plasma cells from SLE patients

3 討論

系統(tǒng)性紅斑狼瘡是一個(gè)異質(zhì)性很強(qiáng)的自身免疫性疾病，其免疫耐受被打破，多種因素導(dǎo)致固有免疫和適應(yīng)性免疫不同程度障礙，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)異常激活及大量致病性自身抗體產(chǎn)生［19］。既往曾有文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，在SLE 患者妊娠晚期存在外周血淋巴細(xì)胞亞群的比例失調(diào)，SLEDAI 分?jǐn)?shù)與B 細(xì)胞比率具有顯著相關(guān)性，但與T 淋巴細(xì)胞的比率并不具有顯著相關(guān)性，提示B 細(xì)胞在SLE 發(fā)病機(jī)制中具有獨(dú)特的重要作用［20］；此外亦有研究表明SLE風(fēng)險(xiǎn)等位基因主要在髓系或B 細(xì)胞中表達(dá)，在B細(xì)胞靶向療法中，尤其是阻斷漿細(xì)胞分化，可能可使SLE 患者獲得長期效益［1］。因此以B 細(xì)胞作為靶向細(xì)胞是SLE 未來治療的重要方向。

近年研究發(fā)現(xiàn)，抑制BRD4 蛋白已被證實(shí)在多種腫瘤的臨床前小鼠和異種移植模型中具有顯著的抗癌活性［17，21-22］。除了對腫瘤的調(diào)控作用，最近發(fā)現(xiàn)BRD4蛋白參與調(diào)控人和小鼠體內(nèi)Th17細(xì)胞的分化及活化，調(diào)節(jié)Th17 相關(guān)的細(xì)胞因子產(chǎn)生［23-24］。這些研究提示BRD4 蛋白很可能參與調(diào)控免疫細(xì)胞的活化和分化。但關(guān)于BRD4 是否參與B 細(xì)胞功能的調(diào)控目前研究甚少，曾有學(xué)者提出BRD2 蛋白促進(jìn)小鼠B 細(xì)胞擴(kuò)增和有絲分裂［25］；筆者曾發(fā)現(xiàn)BRD4 蛋白參與調(diào)控SLE 患者外周血B 細(xì)胞分化，且抑制劑PFI 對狼瘡腎炎具有治療作用［16］；這些提示BET 蛋白尤其是BRD4 蛋白可能在B 細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病發(fā)病機(jī)制中具有重要的作用，但是BET 蛋白抑制劑JQ?1 對SLE 外周血B 細(xì)胞的調(diào)控作用，目前尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。

筆者前期結(jié)果發(fā)現(xiàn)SLE 患者外周血B 細(xì)胞中BRD4 的表達(dá)顯著高于健康對照組（HC），提示BRD4 可能參與SLE 的發(fā)病機(jī)制。為此進(jìn)一步探討SLE 外周血B 細(xì)胞中異常升高的BRD4 蛋白在SLE 漿細(xì)胞的分化過程中的作用，觀察發(fā)現(xiàn)BET蛋白抑制劑JQ1，對B 細(xì)胞的增殖及凋亡沒有顯著的抑制作用，但其可有效降低SLE 外周血漿母細(xì)胞和漿細(xì)胞的比例，提示JQ?1 可調(diào)控SLE 中漿母細(xì)胞途徑介導(dǎo)的漿細(xì)胞分化過程。

本研究不足之處在于：盡管JQ?1 抑制劑對BRD4 活性的抑制作用具有一定偏好，但其仍可對BRD2、BRD3 及BRDT 蛋白發(fā)揮作用，因此不排除JQ?1 通過調(diào)控其它BET 蛋白活性發(fā)揮作用，因此選擇BRD4 高選擇性抑制劑具有重要意義；此外沒有探究JQ?1 對SLE 外周血B 細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制，且未通過動物模型進(jìn)一步證實(shí)其可能的潛在治療作用。

總之，BRD4 在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血B細(xì)胞中表達(dá)增加，提示BRD4 蛋白在SLE 的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用，JQ?1 可抑制SLE 外周血漿細(xì)胞分化，從而發(fā)揮對系統(tǒng)性紅斑狼瘡的治療作用，但精確的調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究，JQ?1 有望成為SLE 新的潛在治療藥物。