唐小懿，梁迪，陳思敏

銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)屬于革蘭氏陰性菌，是一種常見(jiàn)的獲得性條件致病菌，廣泛存在于自然界中，可作為正常菌群或致病菌存在于人類(lèi)皮膚、胃腸道以及呼吸道；是最常見(jiàn)的院內(nèi)感染和呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎細(xì)菌[1]，占院內(nèi)感染死亡率的10%-20%[2]。銅綠假單胞菌因極易產(chǎn)生生物被膜而降低抗生素的治療效果[3,4]。近年來(lái)，伴隨抗生素的過(guò)度使用，銅綠假單胞菌耐藥性或多藥耐藥性的層出不窮，通過(guò)遺傳或獲得性耐藥機(jī)制對(duì)多種抗生素產(chǎn)生耐藥性，如喹諾酮類(lèi)、β‐內(nèi)酰胺類(lèi)和氨基糖苷類(lèi)[5]。由此導(dǎo)致臨床經(jīng)驗(yàn)性用藥變得困難和難以執(zhí)行。

中藥因其多成分，多靶點(diǎn)特性，可對(duì)抗菌效應(yīng)的多個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)揮作用，甚至延緩和逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。研究表明，眾多中藥有效成分能通過(guò)抑制群體感應(yīng)(QS)[6-9]、生物膜[10,11]以及直接殺菌作用[12,13]等途徑有效控制銅綠假單胞菌感染；以及促進(jìn)抗生素穿透生物膜，提高細(xì)菌對(duì)抗生素的敏感性[14]，增強(qiáng)抗生素對(duì)銅綠假單胞菌的抗菌作用[15-17]。安息香為芳香開(kāi)竅藥，具有開(kāi)竅醒神，活血行氣之功效。研究發(fā)現(xiàn)安息香提取物具有抗菌活性[18]；在研究中發(fā)現(xiàn)，安息香提取物具有通過(guò)抑制P-糖蛋白(P-gp)轉(zhuǎn)運(yùn)酶活性來(lái)提高藥物穿透血腦屏障，以及降低細(xì)胞膜通透性來(lái)促進(jìn)藥物內(nèi)流的特性[19,20]。

本研究通過(guò)對(duì)醫(yī)院臨床分離的銅綠假單胞菌進(jìn)行多藥耐藥株篩選和最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)測(cè)定，選取多藥耐藥性菌株進(jìn)行XCQ的抗菌增效研究，包括體外敏感性實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)保護(hù)性實(shí)驗(yàn)。采用牛津管法考察不同劑量的XCQ溶液對(duì)抗生素抗菌增效現(xiàn)象，以及結(jié)合感染小鼠的體內(nèi)保護(hù)性試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證此作用。為臨床抗生素聯(lián)合XCQ對(duì)抗銅綠假單胞菌的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥物與試劑

XCQ，含量>98.0%.，批號(hào)4UPIK-AU，購(gòu)自梯希愛(ài)（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；左氧氟沙星，含量>98.0%，批號(hào)F2110154，硫酸慶大霉素，批號(hào)E2128310，均購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；抗生素紙片(左氧氟沙星(5 μg/片，LVF)、頭孢曲松(30 μg/片，CRO)、頭孢噻肟(30 μg//片，CTX)、頭孢他啶(30 μg/片，CAZ)和氨曲南(30 μg/片，AZT))，均購(gòu)買(mǎi)于比克曼生物科技有限公司；0.9%氯化鈉注射液，批號(hào)H51021158，購(gòu)自四川科倫藥業(yè)股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)菌株及動(dòng)物

銅綠假單胞菌臨床株，由攀枝花市中心醫(yī)院提供。KM小鼠51只，8周齡，體重18-22 g，雌性，購(gòu)買(mǎi)于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

MHA、MHB培養(yǎng)基(均購(gòu)自O(shè)XOID公司)，MHA瓊脂培養(yǎng)基38 g于1000 mL純水中，加熱溶解；MHB液體培養(yǎng)基21 g于1000 mL純水中，加熱溶解。高壓滅菌鍋121℃，15 min進(jìn)行消毒殺菌，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 實(shí)驗(yàn)藥液的配制

電子分析天平準(zhǔn)確稱(chēng)取適量的XCQ、左氧氟沙星和慶大霉素粉末，用無(wú)菌純水分別配置成高濃度的母液，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，封口膠封口，保存于‐20℃冰箱，備用。實(shí)驗(yàn)前稀釋成所需溶液濃度。

1.5 試驗(yàn)菌液制備

將保存在‐20℃冰箱的銅綠假單胞菌臨床株紙片在MHA培養(yǎng)基上復(fù)活，挑選長(zhǎng)勢(shì)良好的單一菌落重新接種于新的MHA平板，生長(zhǎng)過(guò)夜。挑取一定量的過(guò)夜細(xì)菌，用無(wú)菌生理鹽水重懸，得0.5麥?zhǔn)蠞舛染海?.5 ×108CFU﹒mL-1）；再用生理鹽水稀釋10倍，即我們實(shí)驗(yàn)所需菌液濃度。

1.6 體外敏感性實(shí)驗(yàn)

1.6.1 銅綠假單胞菌臨床株多藥耐藥菌的篩選 采用5種含藥抗生素紙片（左氧氟沙星（5 μg）、頭孢曲松（30 μg）、頭孢噻肟（30 μg）、頭孢他啶（30 μg）和氨曲南（30 μg））對(duì)9株銅綠假單胞菌臨床株進(jìn)行體外敏感性檢測(cè)。將9種銅綠假單胞菌臨床株菌液均勻涂布于MHA平板上，并放置不同含藥抗生素紙片，用鑷子輕輕按壓紙片，使其緊密貼合培養(yǎng)基，倒置于37℃培養(yǎng)箱，過(guò)夜培養(yǎng)（18-24 h），用直尺測(cè)量抑菌圈直徑大小，以抑菌圈最長(zhǎng)邊作為我們的測(cè)量直徑。藥物敏感度判定參考NCCLS。

1.6.2 MIC值測(cè)量 采用瓊脂對(duì)倍稀釋法[21]，將硫酸慶大霉素、左氧氟沙星、XCQ用無(wú)菌純水配置成15個(gè)不同濃度的藥液，分別取1 mL于90 mm無(wú)菌培養(yǎng)皿中，加入14 mL MHA培養(yǎng)基，混勻，使得最終濃度分別為：硫酸慶大霉素/左氧氟沙星/XCQ(128，64，32，16，8，4，2，1，0.5，0.25，0.125，0.0.6，0.03，0.015，0.008 μg.mL-1)。

將臨床株均配置成0.5麥?zhǔn)蠞舛鹊木?，稀?0倍后，各吸取1 mL于石英小試管，并放置于多點(diǎn)接種儀中，在不同含藥培養(yǎng)基平板表面進(jìn)行接種；為了檢驗(yàn)測(cè)試菌的生長(zhǎng)活性和在接種過(guò)程中是否被污染，在接種前和接種后分別點(diǎn)種一個(gè)不含抗生素的空白MHA培養(yǎng)基。待菌液吸收干燥后，將培養(yǎng)板倒置，37度培養(yǎng)過(guò)夜(18-24 h)后觀察是否有菌斑產(chǎn)生。以無(wú)菌斑生長(zhǎng)的最低藥物濃度作為最小抑菌濃度(MIC)。

1.6 XCQ聯(lián)合慶大霉素的體外抗菌活性 按照1.5操作步驟，將所配菌液均勻涂布于MHA平板后，放置5個(gè)相同規(guī)格的已滅菌牛津管，其中一管只加200 μL慶大霉素溶液，另三管加入100 μL慶大霉素溶液和100 μL ⅩCQ藥液；根據(jù)文獻(xiàn)[19]，我們采用XCQ最高濃度為100 μM，再按照對(duì)倍稀釋方式，共獲取3個(gè)濃度梯度溶液，依次為100 μM、50 μM和25 μM；最后一管加入200 μL的100 μM ⅩCQ藥液。慶大霉素我們采用NCCLS藥敏實(shí)驗(yàn)的推薦劑量10 μg。使得最終劑量分別為慶大霉素：10 μg， XCQ：1.5215、0.76和0.38 μg。于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18-24 h,觀察結(jié)果并測(cè)量抑菌圈直徑。

1.7 XCQ聯(lián)合慶大霉素的體內(nèi)保護(hù)試驗(yàn)

1.7.1 MLD100感染濃度測(cè)定 將銅綠2019-32菌株配制成不同濃度菌液，分別為0.5、1、2、3、4麥?zhǔn)蠞舛?，菌濃度分別為1.5×108、3×108、6×108、9×108、12×108CFU﹒mL-1。每個(gè)菌濃度為一組，共5組，每組3只動(dòng)物。分別尾靜脈注射0.2 mL菌液，觀察5 d（120 h）內(nèi)各組小鼠的存活情況，并計(jì)算菌株對(duì)感染小鼠的MLD100。

1.7.2 藥物對(duì)感染小鼠的體內(nèi)保護(hù)性 將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按照體重均勻隨機(jī)分為3組（每組12只）：模型組（M）、慶大霉素組（GM）和慶大霉素聯(lián)合XCQ（GM+XCQ）組。通過(guò)小鼠尾靜脈注射MLD100 0.2 mL進(jìn)行感染，在注射前3 h GM+XCQ組通過(guò)灌胃方式給與每只小鼠XCQ 140 mg﹒kg-1，菌液注射完成后立馬灌胃給與GM溶液31.2 mg﹒kg-1，GM組在造模后灌胃給與GM溶液31.2 mg﹒kg-1，M組在造模后灌胃給與純水。定時(shí)觀察5 d（120 h）內(nèi)感染小鼠的生存率。利用GraphPad 8.0.1軟件繪制生存曲線。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 多藥耐藥菌篩選結(jié)果

由表1，選擇了喹諾酮類(lèi)抗生素、β‐內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素和頭孢菌類(lèi)抗生素進(jìn)行銅綠假單胞菌臨床株的多藥耐藥菌篩選。其中同一種藥物對(duì)不同臨床株表現(xiàn)出不同的抑菌活性。可以看出，對(duì)于左氧氟沙星(LVF)而言，除了銅綠2019-32之外，所有菌株都表現(xiàn)為敏感性；對(duì)于頭孢菌素類(lèi)抗生素，無(wú)敏感性菌株，耐藥率達(dá)100%。對(duì)于氨曲南(AZT)，除銅綠2019-13和2019-32兩株菌表現(xiàn)為耐藥外，其余都表現(xiàn)為敏感性。綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，只有銅綠2019-32菌株滿(mǎn)足該試驗(yàn)多藥耐藥菌的評(píng)選標(biāo)準(zhǔn)。

表1 5種抗菌藥物對(duì)9種銅綠假單胞菌臨床株的體外敏感性(抑菌圈直徑/mm)

2.2 抗菌藥物對(duì)9種銅綠假單胞菌臨床株的MIC

試驗(yàn)抗菌藥物對(duì)9種銅綠臨床株的MIC見(jiàn)表2，由表可見(jiàn)，左氧氟沙星(LVF)對(duì)9株菌的MIC最低，在0.03‐0.125 μg﹒mL-1之間，有較好的抑菌效果；慶大霉素（GM）對(duì)9株菌的MIC均≥1 μg﹒mL-1，且對(duì)2019-13的MIC超過(guò)了128 μg﹒mL-1，對(duì)2019-32的MIC為1 μg﹒mL-1，由該試驗(yàn)設(shè)計(jì)的XCQ最高濃度均未表現(xiàn)出抑菌活性。

表2 最小抑菌濃度（MIC）測(cè)量結(jié)果（μg﹒mL-1）

2.3 XCQ聯(lián)合慶大霉素的體外抗菌活性

根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)，銅綠2019-32對(duì)三類(lèi)抗生素都表現(xiàn)出耐藥現(xiàn)象，且對(duì)慶大霉素的MIC最低，因此，我們選用該菌株進(jìn)行后續(xù)的敏感性實(shí)驗(yàn)。采用牛津管法來(lái)探討慶大霉素聯(lián)合XCQ的體外抗菌活性。由表3可知，GM對(duì)于所有試驗(yàn)臨床株來(lái)說(shuō)抑菌圈直徑大小存在明顯差異，范圍由12-23 mm，表現(xiàn)為敏感性不同。當(dāng)與XCQ聯(lián)合應(yīng)用后，對(duì)大多數(shù)菌株來(lái)說(shuō)抑菌圈直徑明顯增大，增效作用可高達(dá)77.78%；且對(duì)銅綠2019-1、銅綠2019-13和銅綠2019-32三種菌株的抑菌作用存在明顯的量效關(guān)系（見(jiàn)表4）。表明XCQ在體外能加強(qiáng)慶大霉素的抗菌作用。

表3 XCQ聯(lián)合慶大霉素對(duì)銅綠假單胞菌臨床株的抑菌圈直徑/mm

表4 XCQ聯(lián)合慶大霉素后對(duì)銅綠假單胞菌臨床株的抗菌增效百分比（%）

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2.4 XCQ聯(lián)合抗菌藥物對(duì)感染小鼠的體內(nèi)保護(hù)作用

2.4.1 MLD100試驗(yàn)結(jié)果 5個(gè)預(yù)試菌液濃度中，在觀察時(shí)間內(nèi)9×108和12×108CFU﹒mL-1兩個(gè)濃度滿(mǎn)足感染要求，因此我們選擇較低的菌液濃度作為我們的MLD100，即9×108CFU﹒mL-1。

表5 MLD100預(yù)試試驗(yàn)結(jié)果（n=3）

2.4.2 XCQ對(duì)感染小鼠的體內(nèi)保護(hù)作用 為了進(jìn)一步了解XCQ在體內(nèi)是否也具有同樣的協(xié)同增效作用，我們選用氨基糖苷類(lèi)抗生素慶大霉素聯(lián)合XCQ來(lái)進(jìn)行探討。通過(guò)小鼠最小致死量MLD尾靜脈注射方式進(jìn)行造模，在進(jìn)行不同的藥物干預(yù)后，觀察5 d內(nèi)小鼠的生存率，并繪制生存曲線。由圖1可知，在觀察時(shí)間內(nèi)，模型小鼠死亡率達(dá)100%；與模型組相比，慶大霉素對(duì)感染小鼠的保護(hù)作用提高了16.7%，而聯(lián)用XCQ后，保護(hù)作用提高到41.7%。說(shuō)明XCQ在體內(nèi)也能提高抗菌藥物的治療作用。

3 討論

藥敏實(shí)驗(yàn)檢測(cè)中，針對(duì)試驗(yàn)的5種抗菌藥物，銅綠2019-32的耐藥率達(dá)到100%；通過(guò)MIC值測(cè)定顯示，銅綠2019-32對(duì)慶大霉素的敏感性最高，MIC值為1 μg﹒mL-1，根據(jù)NCCLS判斷標(biāo)準(zhǔn)，判定為敏感，即具有較好的抗菌效應(yīng)。目前，從臨床感染患者中分離出來(lái)的多藥耐藥性銅綠假單胞菌越來(lái)越多，這也是治療失敗的主要原因[22]。慶大霉素屬于氨基糖苷類(lèi)藥物，氨基糖苷類(lèi)抗生素也是國(guó)內(nèi)外臨床常用藥之一，且對(duì)對(duì)多種革蘭氏陰性菌具有較強(qiáng)的抗菌活性。慶大霉素作用方式與細(xì)菌核糖體30S亞基結(jié)合從而抑制細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成有關(guān)[23,24]，但隨著長(zhǎng)期使用，耐藥性問(wèn)題也相繼出現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)，16S rRNA甲基轉(zhuǎn)移酶通過(guò)特異性甲基化A1408，造成該類(lèi)抗生素與細(xì)菌核糖體的結(jié)合能力大幅度降低，從而引發(fā)致病菌對(duì)該類(lèi)抗生素的高度耐藥性[25,26]。

在體外敏感性實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)，對(duì)不同試驗(yàn)菌株來(lái)說(shuō)，僅用慶大霉素可產(chǎn)生大小不一的抑菌圈直徑，表現(xiàn)為耐藥到敏感，這可能與分離株的基因型不同有關(guān)。當(dāng)聯(lián)合XCQ作用后，對(duì)大部分菌株來(lái)說(shuō)都有明顯的增效現(xiàn)象。有研究已表明，XCQ具有促進(jìn)細(xì)胞膜流動(dòng)性，增加膜通透性和促進(jìn)藥物內(nèi)流的特性[19]。因此，我們猜測(cè)XCQ對(duì)抗菌藥物的協(xié)同增效作用可能與增加細(xì)胞壁滲透性有關(guān)，從而促進(jìn)抗菌藥物的內(nèi)流。

本文選取多藥耐藥菌2019-32進(jìn)行XCQ聯(lián)合抗菌藥物的體內(nèi)協(xié)同增效研究。建立小鼠血液銅綠假單胞菌感染模型，通過(guò)給與慶大霉素或慶大霉素和XCQ溶液考察藥物對(duì)感染小鼠的治療作用。本次實(shí)驗(yàn)中慶大霉素31.2 mg﹒kg-1劑量相當(dāng)于臨床人體用藥240 mg。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著藥物干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)，治療組動(dòng)物存活數(shù)高于模型組；且聯(lián)用XCQ后對(duì)小鼠的保護(hù)作用進(jìn)一步提高。這與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。因此我們認(rèn)為芳香開(kāi)竅藥安息香提取物XCQ在體內(nèi)、外均能促進(jìn)慶大霉素對(duì)銅綠假單胞菌的抗菌作用。