陳林林，張佳欣，吳嘉樹，李偉，范天嬌，楊茜瑤，鄭鳳鳴

(哈爾濱商業(yè)大學(xué) 食品工程學(xué)院，哈爾濱 150028)

香薷全草可入藥，是一種藥食同源的植物，主要生長在丘陵和路邊[1]。香薷富含化合物，目前已鑒定出60多種，主要為萜烯、酯、醇、酚、醛等[2]。在食品中可以作為調(diào)味品、添香劑[3]。香薷通過萃取得到的精油能夠延緩甚至抑制微生物對(duì)食品的作用，可以作為一種天然抗菌劑，用于食品保鮮[4-5]。因香薷精油特有的風(fēng)味，可應(yīng)用于飲料、糕點(diǎn)等食品行業(yè)中[6]。

多酚作為香薷次生代謝產(chǎn)生的一類天然有機(jī)化合物，存在于香薷的各種組織中[7]，可以減少細(xì)胞和組織中的氧化損傷，是一種天然的抗氧化劑，主要應(yīng)用在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域[8]。郭彩慧等[9]測(cè)定了青花椒中多酚的抗氧化能力，結(jié)果表明多酚是一種有效的抗氧化劑。陳仕學(xué)等[10]從不同類型的茶葉中提取茶多酚，并對(duì)其抗氧化能力進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明不同茶葉中的茶多酚清除自由基的能力不同。

本文利用水蒸氣蒸餾提取香薷中的精油，并用有機(jī)溶劑提取殘?jiān)械亩喾印＠脷庀嗌V-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)技術(shù)分析精油成分組成，高效液相色譜法確定多酚溶液中成分組成并對(duì)精油以及殘?jiān)械亩喾舆M(jìn)行了抗氧化活性研究，為香薷的利用提供了依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

香薷：黑龍江省牡丹江市；乙酸鈉：天津市福晨化學(xué)試劑廠；冰醋酸：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；三氯化鐵：天津市雙船化學(xué)試劑廠；抗壞血酸(VC)：西隴化工股份有限公司；鄰苯三酚(焦性沒食子酸)：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)、2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ)：薩恩化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)：東京化成工業(yè)株式會(huì)社；三羥甲基氨基甲烷(Tris)：天津市泰興試劑廠；2，2-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)。

UV 5100B型紫外可見分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司；TU-1900型紫外分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；DHG-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科技有限公司；DC-2006型低溫恒溫槽 寧波海曙天恒儀器廠；GC7890B/MS5977B型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Agilent公司；Ultimate 3000型高效液相色譜儀 美國賽默飛世爾公司；XT 220A型精密電子天平 瑞士普利賽斯儀器公司；W501型升降恒溫水浴鍋 上海申勝生物技術(shù)有限公司；R-1001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鄭州長城科工貿(mào)有限公司。

1.2 香薷精油的提取

取干燥的香薷籽粒150 g放于3 L的三頸燒瓶中，通過水蒸汽蒸餾從香薷中提取精油。加入體積為2 L的蒸餾水，使其完全浸泡，并放置在油浴鍋中在115 ℃油浴加熱。加熱5～7 h，當(dāng)回流管中不再餾出精油，停止加熱，降至室溫后，收集從回流管蒸餾的精油，并將該混合物于4 ℃冷藏16 h，收集精油，稱取質(zhì)量，平行3次[11-12]，按公式(1)計(jì)算精油得率：

(1)

式中：m為收集的精油質(zhì)量，g；m0為香薷籽?？傎|(zhì)量，g。

1.3 殘?jiān)卸喾雍康挠?jì)算

用紗布包裹提取精油后的香薷殘?jiān)瑪D壓除去大部分水分，再置于烘箱中烘干，除去殘?jiān)械乃植⒂梅鬯闄C(jī)粉碎。取2 g粉碎后的殘?jiān)糜阱F形瓶中，采用超聲波輔助法，加入60%的乙醇溶液20 mL，采用層析分離法[13]使多酚溶液濃度為29.46 mg/mL。用預(yù)處理后的AB-8大孔樹脂并加入10 mL的多酚溶液，采用pH為6的50%乙醇對(duì)多酚純化，吸附時(shí)間為6 h，得到多酚提取液，于45 ℃在60 min時(shí)測(cè)定上層清液的吸光度。

制備濃度為0.1 mg/mL的沒食子酸溶液，隨后稱取0.25 g硫酸亞鐵和1.25 g酒石酸鈉，用蒸餾水溶解定容至250 mL，得到酒石酸亞鐵顯色劑。準(zhǔn)確稱量0.1362 g磷酸二氫鈉，2.0315 g磷酸氫二鈉，溶解稀釋至100 mL，制得pH為7.5的緩沖溶液[14]。

量取0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL的沒食子酸溶液，加入2 mL著色劑和5 mL緩沖液，定容至10 mL，并于540 nm處測(cè)量吸光值，按公式(2)計(jì)算多酚得率：

(2)

式中：C0為多酚濃度，mg/mL；V0為提取后溶液體積，mL；m0為加入殘?jiān)|(zhì)量，g。

1.4 GC-MS分析香薷精油成分組成

采用GC-MS對(duì)香薷精油的組成成分及對(duì)應(yīng)的含量進(jìn)行分析檢測(cè)，方法測(cè)定的條件如下：

GC分析條件：色譜柱：彈性石英毛細(xì)管柱HP-5MS(30 m×250 μm×0.25 μm)；載氣為氦氣，氦氣流量：1 mL/min；進(jìn)樣口的溫度為250 ℃，進(jìn)樣分流，進(jìn)樣分流比為100∶1；程序升溫：柱溫在60 ℃保持1 min，隨后以8 ℃/min升至240 ℃，并保持5 min。

MS分析條件：電離方式為EI離子源；離子源溫度是230 ℃；質(zhì)量掃描范圍：33～550 amu；四級(jí)桿溫度：150 ℃；電離電壓：70 eV[15]。

1.5 HPLC確定多酚提取液的成分組成

對(duì)殘?jiān)卸喾拥奶崛∫哼M(jìn)行液相色譜分析，分析條件：色譜柱：XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相是色譜級(jí)別的甲醇(A)-純水(B)進(jìn)行梯度洗脫：0～10 min：26% A，74% B；10～10.1 min：50% A，50% B；10.1～25 min：50% A，50% B。流速為1 mL/min；柱溫為25 ℃；檢測(cè)波長為280 nm；每次進(jìn)樣10 μL[16]。

1.6 香薷精油及多酚提取液抗氧化能力測(cè)定

1.6.1 清除DPPH自由基能力

以無水乙醇為溶劑，制備不同濃度梯度的香薷精油溶液，制得的香薷精油質(zhì)量濃度分別為0.1，0.5，1，3，5，7，9 mg/mL，以同樣濃度的VC溶液和BHT溶液作為樣品對(duì)照溶液。將無水乙醇作為對(duì)照溶液，量取1 mL待測(cè)液，4 mL DPPH溶液(2×10-4mol/L)，放于避光處，室溫下靜置30 min，于517 nm測(cè)吸光度A。同樣條件下測(cè)定1 mL待測(cè)液，4 mL無水乙醇的吸光度記為A0；1 mL無水乙醇，4 mL DPPH的吸光度記為A1[17]，按公式(3)計(jì)算清除率：

(3)

1.6.2 清除超氧陰離子自由基能力

量取體積為0.1 mL不同濃度梯度的待測(cè)液，添加0.5 mL吐溫80溶液和6 mL Tris鹽酸緩沖溶液(50 mmol/L，pH 8.2)，25 ℃反應(yīng)20 min后加入體積為0.1 mL 25 ℃的鄰苯三酚溶液(10 mmol/L)反應(yīng)4 min，再加入6 mol/L的鹽酸溶液。將待測(cè)溶液放于420 nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)，用蒸餾水替代樣品，取同組的相同樣品溶液，加入6 mL緩沖溶液，加蒸餾水使體積與樣品組一致，然后測(cè)量其吸光度A1。將VC、BHT配成濃度梯度與待測(cè)樣品一樣的溶液，替代香薷精油和多酚提取液加入試管中，其他具體操作步驟相同，分別測(cè)得A、A0、A1[18-19]，按公式(3)計(jì)算清除率。

1.6.3 清除ABTS+自由基能力

準(zhǔn)確稱取0.1921 g ABTS與0.0331 g過硫酸鉀混合，并用蒸餾水稀釋體積至50 mL，ABTS溶液為7 mmol/L，室溫條件下避光靜置12～16 h后加入磷酸鹽緩沖液(0.01 mol/L，pH 7.4)，734 nm處該混合溶液的吸光值為0.70。隨后，將1 mL不同濃度的待測(cè)溶液和5 mL制得的ABTS反應(yīng)液振蕩使其混合均勻，放置在室溫下靜置10 min后在734 nm處測(cè)吸光值記為As。在相同條件下，以不加入樣品的ABTS溶液為對(duì)照組，測(cè)其吸光值記為A0[20-21]，按公式(4)計(jì)算清除率：

(4)

1.6.4 FRAP總抗氧化能力

準(zhǔn)確稱取4.0678 g乙酸鈉，加4 mL冰醋酸，定容至250 mL；準(zhǔn)確稱取0.0781 g TPTZ粉末，加83 μL濃鹽酸，并用蒸餾水定容至25 mL；精準(zhǔn)稱取0.1621 g的FeCl3，加入30 mL蒸餾水，充分搖晃使其均勻。將制備的溶液按照10∶1∶1進(jìn)行混合，得到FRAP溶液。量取1 mL不同梯度濃度的待測(cè)液加入FRAP溶液6 mL，在37 ℃的水浴中搖勻，加熱10 min，并在593 nm處測(cè)量吸光值A(chǔ)[22]。

2 結(jié)果與討論

2.1 GC-MS分析香薷精油成分

采用水蒸氣蒸餾法對(duì)香薷籽粒進(jìn)行蒸餾，共計(jì)3次，結(jié)果見表1。

表1 香薷中精油得率Table 1 The extraction rate of essential oils from Elsholtzia ciliata

由表1可知，通過水蒸氣蒸餾法從香薷中得到的精油平均得率為0.4135%。香薷精油相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.7400%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%，說明精油產(chǎn)率數(shù)據(jù)符合實(shí)驗(yàn)要求，實(shí)驗(yàn)操作誤差小，重復(fù)性好，收集的精油可以用于接下來抗氧化活性的研究。

2.2 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按照1.3中的步驟在沒食子酸濃度和吸光度值之間建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1。

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of gallic acid

回歸方程為Y=0.0141X+0.0006，r=0.9981，濃度范圍在0～10 μg/mL，線性關(guān)系良好，可以將沒食子酸用作對(duì)照，用于計(jì)算提取液中多酚的濃度。

2.3 GC-MS測(cè)定香薷精油成分

圖2 香薷精油的GC-MS總離子流譜圖Fig.2 GC-MS total ion chromatogram of Elsholtzia ciliataessential oils

由圖2可知，在香薷精油中檢測(cè)到25種成分。使用NIST 98質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫作為對(duì)照，定性分析這25種成分，并使用峰面積歸一化方法定量分析了香薷精油的成分，結(jié)果見表2。

表2 香薷精油成分GC-MS解析結(jié)果Table 2 GC-MS analysis results of Elsholtzia ciliataessential oil components

續(xù) 表

由表2可知，所鑒定的香薷精油共有25種成分，其中，香薷酮相對(duì)含量最高(46.50%)，其次是1-甲基-3-(1-甲基乙烯基)環(huán)己烯(43.08%)，蛇麻烯的相對(duì)含量為2.79%，芳樟醇為1.61%。通過計(jì)算得知，這4種物質(zhì)占香薷精油總含量的93.98%，可以認(rèn)為是香薷精油香氣的主要成分。

2.4 高效液相色譜法確定多酚提取液成分

圖3 多酚提取液的液相色譜圖Fig.3 The liquid chromatogram of polyphenol extract

根據(jù)圖3中峰面積的計(jì)算，多酚提取液中多酚的相對(duì)含量為41.24%。其中保留時(shí)間為8.870 min的組分峰值最高，故而可認(rèn)為該組分為香薷多酚的主要組成成分。計(jì)算出多酚提取液中的多酚含量為45.5125 mg/mL。

2.5 香薷精油及多酚提取液抗氧化能力測(cè)定

2.5.1 清除DPPH自由基能力

圖4 清除DPPH自由基能力Fig.4 The DPPH free radical scavenging ability

由圖4可知，在0～9.0 mg/mL的濃度范圍內(nèi)，每個(gè)樣品的DPPH自由基的清除率均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)(P<0.05)，其中VC的上升趨勢(shì)相對(duì)平緩。在該濃度范圍內(nèi)VC的最大清除率為65.16%，BHT的最大清除率為63.09%。多酚提取液清除率在濃度為5 mg/mL時(shí)超過BHT，當(dāng)濃度超過7 mg/mL時(shí)，多酚提取液清除率超過VC，在9.0 mg/mL時(shí)，達(dá)到最大值68.36%，隨著濃度的繼續(xù)增加，對(duì)DPPH自由基的清除能力保持上升的趨勢(shì)(P<0.01)；對(duì)于DPPH自由基的清除能力，香薷精油小于VC、多酚提取液和BHT，清除率在濃度為9.0 mg/mL時(shí)達(dá)到最大值60.59%，是同濃度下BHT的96.04%，香薷精油隨著濃度的增加，清除率接近BHT(P<0.01)。

2.5.2 清除超氧陰離子自由基能力

圖5 超氧陰離子自由基清除能力Fig.5 The superoxide anion free radical scavenging ability

由圖5可知，樣品濃度在0～1.0 mg/mL范圍內(nèi)時(shí)，每個(gè)樣品都呈現(xiàn)出急劇上升的趨勢(shì)(P<0.05)，在1.0～5.0 mg/mL濃度范圍內(nèi)VC、香薷精油和BHT的清除能力逐漸趨于平緩，多酚提取液的清除率保持上升的趨勢(shì)(P<0.05)。在該濃度范圍中VC的最大清除率為91.55%，BHT的最大清除率為90.57%。當(dāng)濃度超過1.0 mg/mL時(shí)，多酚提取液對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力開始超過BHT，并在3 mg/mL時(shí)超過VC，在5.0 mg/mL時(shí)清除率最高，達(dá)到95.54%，而且多酚提取液的清除能力隨著濃度的增加而增大(P<0.01)；對(duì)于超氧陰離子自由基的清除能力，香薷精油低于VC、多酚提取液和BHT，在5.0 mg/mL可達(dá)到最大值89.82%，是同濃度下BHT清除率的99.17%，隨著濃度的增加，清除能力逐漸接近于BHT(P<0.01)。

2.5.3 清除ABTS+自由基能力

圖6 ABTS+自由基清除能力Fig.6 The ABTS+ free radical scavenging ability

由圖6可知，當(dāng)濃度在0～0.5 mg/mL范圍內(nèi)，各樣品對(duì)ABTS+自由基清除能力均有明顯增強(qiáng)的趨勢(shì)(P<0.05)，當(dāng)濃度高于0.1 mg/mL時(shí)各樣品的抗氧化能力增加的趨勢(shì)變得緩慢。在該濃度范圍中VC的最大清除率為87.40%，BHT的最大清除率為69.20%。對(duì)于ABTS+自由基的清除能力，多酚提取液>VC>BHT>香薷精油。多酚提取液的最大清除率在0.5 mg/mL時(shí)達(dá)到最大值，是同濃度下VC的104.92%，BHT的132.51%；香薷精油的最大清除能力在0.5 mg/mL時(shí)達(dá)到最大值，是同濃度下BHT清除能力的94.94%，隨著濃度的增加，清除能力逐漸接近BHT(P<0.05)。

2.5.4 FRAP總抗氧化能力

圖7 FRAP總抗氧化能力Fig.7 FRAP total antioxidant capacity

由圖7可知，當(dāng)濃度在0～0.09 mg/mL范圍內(nèi)，各樣品FRAP總抗氧化能力隨濃度增長明顯增強(qiáng)(P<0.05)；多酚提取液的FRAP總抗氧化能力高于BHT，小于VC和香薷精油，在0.09 mg/mL時(shí)對(duì)FRAP總抗氧化能力最強(qiáng)，是同濃度下BHT的102.21%，VC的95.15%，并且隨濃度的升高呈現(xiàn)穩(wěn)定上升的趨勢(shì)；在濃度大于0.03 mg/mL時(shí)，香薷精油的FRAP總抗氧化能力>VC>多酚提取液>BHT，在0.09 mg/mL時(shí)FRAP總抗氧化能力是VC的100.31%，BHT的107.75%。

2.5.5 抗氧化活性間的相關(guān)性分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0進(jìn)行相關(guān)性分析，采用Pearson進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，以P<0.05為顯著性檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

表3 香薷精油的4種抗氧化性評(píng)價(jià)方法的相關(guān)性Table 3 The correlation of four antioxidant evaluation methods of Elsholtzia ciliata essential oils

由表3可知，在測(cè)定香薷精油的抗氧化活性中，香薷精油對(duì)DPPH自由基的清除能力與超氧陰離子自由基、ABTS+自由基的清除能力、FRAP的總還原能力之間的線性關(guān)系非常顯著(P<0.01)；對(duì)于超氧陰離子自由基的清除能力和FRAP的總還原能力之間同樣存在非常顯著的線性關(guān)系(P<0.01)，香薷精油對(duì)于其他抗氧化活性基團(tuán)指標(biāo)之間的相關(guān)程度并不明顯。

表4 香薷多酚提取液的4種抗氧化性評(píng)價(jià)方法的相關(guān)性Table 4 The correlation of four antioxidant evaluation methods of Elsholtzia ciliata polyphenol extract

由表4可知，在4種用于測(cè)定香薷殘?jiān)卸喾犹崛∫嚎寡趸钚缘脑u(píng)價(jià)方法中，多酚對(duì)于DPPH自由基與超氧陰離子自由基、ABTS+自由基、FRAP總還原能力存在的線性關(guān)系非常顯著(P<0.01)；超氧陰離子自由基的清除能力與FRAP總還原能力之間線性關(guān)系非常顯著(P<0.01)，超氧陰離子自由基還與ABTS+自由基呈現(xiàn)線性相關(guān)(P<0.05)；對(duì)于ABTS+自由基的清除能力與FRAP總還原能力線性關(guān)系顯著(P<0.05)，多酚提取液對(duì)于其他抗氧化活性基團(tuán)指標(biāo)之間的相關(guān)程度并不明顯。

3 結(jié)論

利用水蒸氣蒸餾法提取香薷中的精油并對(duì)殘?jiān)械亩喾舆M(jìn)行有機(jī)溶劑提取，分別采用GC-MS和HPLC分析精油和多酚提取液的組分。所鑒定的香薷精油4種主要成分是香薷酮(46.5%)、1-甲基-3-(1-甲基乙烯基)環(huán)己烯(43.08%)、葎草烯(2.79%)和芳樟醇(1.61%)。這4種物質(zhì)占香薷精油總含量的93.98%，可以認(rèn)為是香薷精油香氣的主要來源。研究發(fā)現(xiàn)香薷精油和多酚提取液清除DPPH·與O2-·、ABTS+·、FRAP的總還原能力線性關(guān)系呈現(xiàn)非常顯著相關(guān)(P<0.01)，對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力與FRAP的總還原能力的線性關(guān)系同樣非常顯著(P<0.01)。香薷精油及香薷殘?jiān)械亩喾泳哂幸欢ǖ目寡趸芰?，可以作為食品防腐劑與抗氧化劑，為香薷的開發(fā)和利用提供了一定的理論依據(jù)。