吳瓏婕，韓 培，郝 蘊，王 佳，楊文杰，田詠梅

1)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生化學(xué)教研室 鄭州 450001 2)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院精準營養(yǎng)創(chuàng)新中心 鄭州 450001 3)四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院檢驗科 成都 610072

鐵死亡是新發(fā)現(xiàn)的細胞死亡方式，其發(fā)生依賴于細胞中鐵離子蓄積和脂質(zhì)過氧化[1]。鐵死亡在細胞形態(tài)、基因表達、蛋白表達和代謝等方面的變化可以將其區(qū)別于其他類型的細胞死亡，如凋亡、壞死和自噬等。鐵死亡與人類健康息息相關(guān)：一方面鐵死亡調(diào)節(jié)細胞死亡的能力使其成為一種極有潛力的抗癌策略；另一方面，鐵死亡也存在于多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程中，包括缺血再灌注損傷、神經(jīng)退行性疾病和中風(fēng)等[2-3]。鐵死亡的發(fā)生受相關(guān)基因調(diào)控，代謝物發(fā)生多種變化[4]。

RSL3是鐵死亡經(jīng)典的誘導(dǎo)劑之一，它是谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)抑制劑，可直接與GPX4結(jié)合使其失活，誘導(dǎo)致死性脂質(zhì)過氧化物積累，從而引發(fā)鐵死亡。鐵抑素1(ferrostatin-1,Fer-1)是一種有效的鐵死亡抑制劑，能夠防止RSL3誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化物蓄積，抑制細胞鐵死亡。目前，RSL3和Fer-1已被國內(nèi)外許多學(xué)者用于鐵死亡誘導(dǎo)及抑制的相關(guān)研究[5-8]。

代謝組學(xué)是生物學(xué)研究中重要的組學(xué)技術(shù)之一[9]?；谝合嗌V-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的代謝組學(xué)由于靈敏度高、通用性強和不需化學(xué)衍生化等優(yōu)點，已成為篩選生物標志物和揭示藥物作用機制的重要工具。細胞代謝組學(xué)可以提供細胞瞬時代謝圖譜，有助于了解特定干預(yù)條件下細胞的整體代謝情況[10]。本研究分析了人纖維肉瘤細胞HT1080鐵死亡代謝特征，以期為鐵死亡的發(fā)生機制提供新線索。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器HT1080細胞由鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院精準營養(yǎng)創(chuàng)新中心贈送。RSL3、Fer-1購自美國Sigma-Aldrich公司。CCK-8試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所。DMEM高糖和DMEM高糖無酚紅培養(yǎng)基購自以色列Biological Industries公司。胎牛血清購自美國Gibco公司。DMSO、青鏈霉素雙抗購自北京索萊寶科技有限公司。超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜儀(ultra-performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC-QTOF MS)和ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱(2.1 mm×150 mm,1.8 μm)購自美國Waters公司。

1.2 RSL3染毒條件的篩選HT1080細胞用完全培養(yǎng)基(含有青鏈霉素雙抗和體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基)于37 ℃、體積分數(shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天傳代1次。細胞活性測定采用CCK-8法。將細胞以104個/孔接種于96孔板中，過夜貼壁后棄去培養(yǎng)基，加入含終濃度為0.125、0.250、0.500、1.000、2.000 μmol/L RSL3的完全培養(yǎng)基，分別染毒6、12、24 h后棄去培養(yǎng)基，每孔加入10 μL的CCK-8試劑及200 μL完全培養(yǎng)基孵育 1～4 h，用酶標儀測定450 nm處的吸光度(A)值，計算細胞存活率。細胞存活率=(A實驗孔-A空白孔)/(A對照孔-A空白孔)×100%，其中空白孔為不含細胞和藥物的培養(yǎng)基，對照孔為含細胞、不含藥物的培養(yǎng)基，每組設(shè)3個平行樣。

1.3 細胞分組取處于對數(shù)生長期、狀態(tài)良好的細胞接種于直徑10 cm的培養(yǎng)皿，加含體積分數(shù)1%胎牛血清的DMEM細胞培養(yǎng)基，過夜貼壁生長后分為3組：鐵死亡誘導(dǎo)組加入終濃度為1.000 μmol/L的RSL3；鐵死亡抑制組同時加入終濃度為1.000 μmol/L的RSL3和終濃度為0.500 μmol/L的Fer-1；溶劑對照組加入DMSO；均干預(yù)6 h。每組設(shè)8個重復(fù)，其中1皿用于細胞計數(shù)；剩余7皿用于提取細胞內(nèi)液，進行代謝組學(xué)分析。

1.4 細胞內(nèi)液的提取取藥物干預(yù)6 h后的3組細胞，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗3次，加入2 mL體積分數(shù)25%的冷甲醇溶液，抑制代謝反應(yīng)，用細胞刮刀收集細胞并重懸于2 mL冷甲醇溶液中，液氮速凍，-80 ℃冰箱儲存。取出凍存細胞，4 ℃水融溶3 min，渦旋混勻，重復(fù)4次后于-20 ℃靜置 0.5 h，取出后4 ℃、14 000 r/min離心15 min。取全部上清均勻分裝到兩個EP管中，分別用于正離子模式和負離子模式檢測。氮氣吹干溶劑后用800 μL體積分數(shù)50%的乙腈溶液復(fù)溶，4 ℃、14 000 r/min離心 15 min，取600 μL上清液用于分析。

1.5 代謝組學(xué)檢測采用UPLC-QTOF MS和ACQUITY UPLC-HSS T3色譜柱進行分析。

正離子模式。柱溫40 ℃。流動相A：含體積分數(shù)0.1%甲酸的純水，流動相B：含體積分數(shù)0.1%甲酸的乙腈，梯度洗脫條件見表1。樣品室溫度為10 ℃，毛細管電壓3.2 kV，脫溶劑氣溫度500 ℃，源溫度120 ℃。脫溶劑氣流速為800 L/h，錐孔氣流速為50 L/h。掃描范圍為50～1 000 m/z，掃描時間為0.2 s。進樣量為2 μL。

表1 細胞內(nèi)液梯度洗脫條件

負離子模式。柱溫40 ℃。流動相 A：純水加入體積分數(shù)0.1%的氨水，使溶液呈堿性(pH 8.5～9.5)。流動相 B:體積分數(shù)95%的乙腈(LC-MS級)，加入體積分數(shù)5%的流動相A。流動相梯度洗脫條件同正離子模式。

1.6 代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理將UPLC-QTOF MS產(chǎn)生的總離子流色譜圖(TIC)導(dǎo)入Progensis QI 2.0進行去噪、峰強度提取等數(shù)據(jù)預(yù)處理，再將峰強度數(shù)據(jù)導(dǎo)入MetaboAnalyst 5.0網(wǎng)站(https://www.metaboanalyst)，根據(jù)細胞數(shù)量標準化后進行分析。采用無監(jiān)督模型的主成分分析(principal component analysis，PCA)對各組分布情況進行可視化觀察；采用有監(jiān)督模型的偏最小二乘法判別分析增強組間分離并篩選差異代謝物；采用正交偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA)進行組間分析，模型質(zhì)量用R2Y和Q2兩個參數(shù)進行評估，其中R2Y表示模型解釋能力，Q2表示模型預(yù)測能力。熱圖用于進行差異代謝物的篩選。根據(jù)變量重要性投影值(variable importance in the projection，VIP)>1，變化倍數(shù)(fold change，F(xiàn)C)>1.5，P<0.05篩選差異代謝物。采用人類代謝組數(shù)據(jù)庫HMDB(https://hmdb.ca/)對差異代謝物進行鑒定。代謝通路采用Pathways analysis模塊進行分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 20.0進行分析，細胞存活率的比較采用5×3析因設(shè)計的方差分析。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 RSL3染毒條件的篩選結(jié)果見表2。選擇1.000 μmol/L的RSL3作用6 h進行下一步實驗。

表2 不同濃度RSL3染毒不同時間后HT1080細胞存活率比較(n=3)

2.2 溶劑對照組、鐵死亡誘導(dǎo)組和鐵死亡抑制組典型的TIC見圖1。3組正離子模式下細胞內(nèi)液代謝物TIC均存在差異(圖1)。正離子模式下得到640個m/z，負離子模式下得到250個m/z。

A：溶劑對照組；B：鐵死亡誘導(dǎo)組；C：鐵死亡抑制組

2.3 OPLS-DA模型分析得分圖見圖2。鐵死亡誘導(dǎo)組和溶劑對照組、鐵死亡誘導(dǎo)組和鐵死亡抑制組數(shù)據(jù)判別分析結(jié)果顯示兩對數(shù)據(jù)兩種模式下均表現(xiàn)為聚類分離，鐵死亡誘導(dǎo)組和溶劑對照組，鐵死亡誘導(dǎo)組和鐵死亡抑制組細胞的代謝譜均發(fā)生了明顯改變。鐵死亡誘導(dǎo)組和溶劑對照組正離子模式下R2Y=0.829，Q2=0.758；負離子模式下R2Y=0.788，Q2=0.713；鐵死亡誘導(dǎo)組和鐵死亡抑制組正離子模式下R2Y=0.743，Q2=0.675；負離子模式下R2Y=0.774，Q2=0.725，模型擬合較好，解釋率和預(yù)測能力都較高。

A、C：正離子模式；B、D：負離子模式

2.4 潛在生物標志物的篩選聚類熱圖分析結(jié)果見圖3，最后共篩選出來60個差異代謝物。篩選出的差異代謝物在鐵死亡誘導(dǎo)組變化顯著，并且在鐵死亡抑制組中這些變化逆轉(zhuǎn)。取60個差異代謝物中上調(diào)和下調(diào)變化最明顯的各5個代謝物，得到代表性鐵死亡差異代謝物，主要包括脂質(zhì)和類脂質(zhì)分子、有機氧化合物、有機酸及其衍生物、苯類等幾大類(表3)。

圖3 鐵死亡相關(guān)差異代謝物聚類熱圖分析

表3 代表性鐵死亡相關(guān)差異代謝物

2.5 代謝通路分析將鐵死亡誘導(dǎo)組與溶劑對照組的差異代謝物進行代謝通路分析，結(jié)果見圖4。差異代謝物主要集中在甘油磷脂代謝、鞘脂類代謝、谷胱甘肽代謝等通路，其中圓點顏色越深說明代謝差異性越顯著，圓圈越大代表對代謝通路的重要性越大。

圖4 鐵死亡誘導(dǎo)組與溶劑對照組細胞內(nèi)液差異代謝通路分析

3 討論

鐵死亡作為一種新型的程序性細胞死亡方式，已被證明與多種疾病的病理生理過程密切相關(guān)[11]。因此，探究鐵死亡機制，為調(diào)控疾病發(fā)生發(fā)展過程中的鐵死亡具有重要意義。本研究用UPLC-QTOF MS技術(shù)對鐵死亡誘導(dǎo)組、鐵死亡抑制組和溶劑對照組進行了非靶向代謝組學(xué)分析，篩選出60個鐵死亡相關(guān)差異代謝物，并發(fā)現(xiàn)甘油磷脂代謝、谷胱甘肽代謝、鞘脂類代謝等代謝通路與鐵死亡密切相關(guān)。

7-酮基膽固醇是細胞在氧化應(yīng)激條件下膽固醇非酶促氧化的產(chǎn)物，被認為是氧化應(yīng)激的生物標志物[12]。本研究結(jié)果顯示7-酮基膽固醇在鐵死亡誘導(dǎo)組上調(diào)高達95倍。而氧化應(yīng)激是鐵死亡的重要表現(xiàn)之一，7-酮基膽固醇大幅升高可能提示鐵死亡發(fā)生過程中存在膽固醇非酶促氧化，但仍有待于進一步探究。此外，有文獻[13]報道7-酮基膽固醇在尼曼匹克病C1型患者血漿中顯著升高，是其新興的生物標志物。尼曼匹克病主要致病原因是與清除細胞中的膽固醇和脂質(zhì)相關(guān)的基因發(fā)生突變。而該疾病中發(fā)生的脂質(zhì)蓄積是鐵死亡的特征之一，這提示尼曼匹克病C1型可能有鐵死亡的參與。也有研究[14]表明鐵死亡是神經(jīng)退行性疾病潛在機制之一，而7-酮膽固醇是參與改變神經(jīng)元脂質(zhì)代謝的主要毒性成分之一，可導(dǎo)致炎癥和神經(jīng)細胞損傷并可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、影響細胞膜通透性。以上結(jié)果提示7-酮膽固醇與鐵死亡的發(fā)生密切相關(guān)，是一種有潛力的鐵死亡生物標志物。

維生素D被證明具有抗氧化作用[15]。本研究結(jié)果顯示維生素D3在鐵死亡誘導(dǎo)組上調(diào)55倍。由于本研究選擇的是鐵死亡發(fā)生早期的細胞內(nèi)液，以上結(jié)果提示鐵死亡早期細胞針對氧化應(yīng)激的反饋作用可能導(dǎo)致維生素D3上調(diào)，但具體機制仍有待于進一步探究。

植烷酸是過氧化物酶體中α氧化的活化劑[16]，對細胞脂質(zhì)代謝有重要作用。研究[17]表明植烷酸處理后的卵母細胞GSH水平顯著增加，同時ROS水平顯著降低，表明植烷酸對細胞過氧化物酶體的抗氧化防御有積極影響。而鐵死亡發(fā)生過程中伴隨著ROS上升和GSH下降。本研究結(jié)果表明鐵死亡誘導(dǎo)組的植烷酸水平顯著降低，提示細胞發(fā)生鐵死亡可能與植烷酸水平降低導(dǎo)致的抗氧化防御系統(tǒng)被破壞有關(guān)。

脂質(zhì)是細胞膜的結(jié)構(gòu)成分，對細胞的增殖、分化、代謝調(diào)節(jié)等都有重要作用。脂質(zhì)過氧化物的積累是鐵死亡的重要特征[18]。以往研究[19]表明，脂質(zhì)代謝在鐵死亡發(fā)展過程中起著非常重要的作用，這與本研究發(fā)現(xiàn)的甘油磷脂代謝通路和鞘脂類代謝通路兩個脂質(zhì)代謝通路在鐵死亡發(fā)生過程中具有重要意義相一致。

總之，本研究以HT1080細胞為研究對象，篩選出60個鐵死亡相關(guān)差異代謝物，并發(fā)現(xiàn)甘油磷脂代謝、谷胱甘肽代謝、鞘脂類代謝與鐵死亡密切相關(guān)，為進一步探討鐵死亡機制提供線索。