楊術(shù)杰，孫曼曼，劉秀霞,2,3，楊艷坤,2,3，白仲虎,2,3*

（1.江南大學糧食發(fā)酵與食品生物制造國家工程研究中心，江蘇 無錫 214122；2.江南大學工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；3.江蘇省生物活性制品加工工程技術(shù)研究中心，江蘇 無錫 214122）

PCP 是由豬胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus.pleuropneumoniae）引起的高傳染性、致死性呼吸道疾病，已成為世界性工業(yè)化養(yǎng)豬五大疫病之一。豬胸膜肺炎放線桿菌對抗菌藥較敏感[1]，但抗菌藥長期使用易產(chǎn)生抗藥性及藥物殘留[2]。為響應國家飼料端“減抗”政策，接種疫苗以減少抗生素使用的有效措施。

目前，常用豬胸膜肺炎放線桿菌疫苗是致病性血清全菌體滅活疫苗[3]。豬胸膜肺炎放線桿菌致病性有關(guān)毒力因子包括莢膜多糖（CP）、脂多糖（LPS）、外膜蛋白（Omp）、細胞毒素（Apx）、轉(zhuǎn)鐵結(jié)合蛋白（Tbp）等[4]。其中，Omp、Apx、Tbp 是豬胸膜肺炎放線桿菌保護性抗原，可作為疫苗有效成分。Apx可破壞宿主細胞膜結(jié)構(gòu)，被認為是豬胸膜肺炎放線桿菌致病的主要毒力因子之一[5]，其存在被認為是引起組織嚴重損傷和保障病毒完整毒力前提，例如中和Apx的抗體可減少巨噬細胞或者嗜中性粒細胞壞死，接種Apx疫苗動物對細菌感染具有較好抵抗作用[6]。目前已識別的16種豬胸膜肺炎放線桿菌血清型產(chǎn)生的Apx 毒素主要有ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ、ApxⅣ[7-8]。其中ApxⅠ-Ⅲ被認為是主要毒力因子[3]，ApxⅡ是絕大部分血清型均表達的一類Apx毒素，被認為是最“有前途”的候選疫苗。目前，一些重組表達ApxⅡ案例已在大腸桿菌（Escherichia coli）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisi?ae）中成功表達，王春來等在大腸桿菌BL21中以包涵體形式表達rApxⅡA，但菌體細胞內(nèi)可能存在內(nèi)毒素，且無法將Apx 分泌表達[9]；Shin 等通過釀酒酵母2805生產(chǎn)ApxⅠ和ApxⅡ，但發(fā)酵周期長，生產(chǎn)成本高[10]。

谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）是革蘭氏陽性菌，自1957年被發(fā)現(xiàn)后廣泛應用于氨基酸生產(chǎn)，如谷氨酸、蘇氨酸等[11]。研究發(fā)現(xiàn)，谷氨酸棒桿菌在表達異源蛋白上同樣具有優(yōu)勢[12]，一是該菌種作為表達系統(tǒng)無內(nèi)毒素，是一種生物安全菌種，不會影響疫苗質(zhì)量[13-14]；二是該菌種具有較強分泌能力，具有發(fā)達蛋白分泌系統(tǒng)（Sec 和Tat分泌途徑），可高效分泌重組蛋白[15]；三是該菌種胞外蛋白酶少[16]，有利于異源蛋白穩(wěn)定表達；四是培養(yǎng)周期短，發(fā)酵過程成本低，下游純化工藝簡單。結(jié)合成熟培養(yǎng)工藝和遺傳操作技術(shù)，可極大縮減工業(yè)化生產(chǎn)靶蛋白成本。

本研究首次通過谷氨酸棒桿菌CGMCC1.15647分泌表達截短豬胸膜肺炎重組亞單位疫苗ApxⅡ，并通過篩選pXMJ19載體表達盒中啟動子、信號肽提高谷氨酸棒桿菌表達系統(tǒng)分泌表達截短ApxⅡ產(chǎn)量，也采用ELISA方法測定ApxⅡ活性，對谷氨酸棒桿菌作為宿主表達異源重組蛋白疫苗具有重要指導意義。

1 材料與方法

1.1 菌株、生長條件和質(zhì)粒

大腸桿菌JM109用于構(gòu)建表達載體；谷氨酸棒桿菌作為蛋白表達宿主，均由實驗室保存。氯霉素終濃度在大腸桿菌為30 mg·L-1，在谷氨酸棒桿菌為10 mg·L-1。JM109和CGMCC1.15647在LBB培養(yǎng)基表達重組蛋白（胰蛋白胨10 g，酵母膏5 g，氯化鈉10 g，腦心浸出液10 g，水1 L）中培養(yǎng)，溫度30 ℃，轉(zhuǎn)速220 r·min-1。選用LBHIS 培養(yǎng)基（胰蛋白胨5 g，酵母膏2.5 g，氯化鈉5 g，腦心浸出液18.5 g，山梨醇91 g，水1 L）對CGMCC 1.15647 活化。所用質(zhì)粒見表1。

表1 本研究所用質(zhì)粒Table 1 Plasmid in this study

1.2 主要儀器和試劑

質(zhì)粒提取試劑盒，膠回收試劑盒及PCR 產(chǎn)物回收試劑盒購自美國Axygen 公司；T4PNK 酶、DNA 連接酶和限制性內(nèi)切酶購自日本TaKaRa 公司；重組酶購自中國武漢ABclonal 公司；氯霉素購自生工生物工程（上海）股份有限公司；HRPconjugated anti-His購自美國Proteintech公司，顯色液購自中國上海Yeason 公司；豬胸膜肺炎抗體陽性血清購自中國武漢純度生物科技公司；其余試劑為國產(chǎn)或進口分析純。儀器包括高速冷凍離心機、PCR熱循環(huán)儀、Synergy H4酶標儀、恒溫金屬浴、核酸和蛋白電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、紫外分光光度計、熒光分光光度計、純化儀等。

1.3 引物和基因合成

試驗所用引物、豬胸膜肺炎放線桿菌ApxⅡ由蘇州金唯智生物科技有限公司構(gòu)建合成。將文獻[6]報道的ApxⅡ全長氨基酸序列，對其優(yōu)化密碼子，在C 端加上His 標簽，在兩端加上5'BamHⅠ和3'EcoRⅠ酶切位點，由金唯智合成序列。所用引物見表2。

表2 本研究所用引物Table 2 Primers in this study

1.4 表達載體構(gòu)建

ApxⅡ全長表達載體構(gòu)建：以BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ分別酶切pXMJ19 質(zhì)粒以及ApxⅡ全長基因，并用T4DNA連接酶連接基因和載體，得到ApxⅡ全長表達載體pXMJ19-ApxⅡ，并在C端添加His-tag以便后續(xù)純化和分析（見圖1a）。

截短ApxⅡ#5 表達載體構(gòu)建：以F-apx-JD 和R-apx-JD為引物，pXMJ19-ApxⅡ為模板擴增截短ApxⅡ#5 基因序列（見圖1b）。PCR 產(chǎn)物純化后經(jīng)BamHⅠ和EcoRⅠ酶切，T4DNA 連接酶連接至同樣經(jīng)BamHⅠ和EcoRⅠ酶切后pXMJ19 載體上，得到pXMJ19-ApxⅡ#5-His。

啟動子篩選表達載體構(gòu)建：以F-EGFP-0 和R-EGFP-0 為引物，以HT11-EGFP 為模板擴增報告蛋白EGFP基因序列。PCR產(chǎn)物純化后與經(jīng)BamH 和EcoRⅠ酶切后pXMJ19 載體用同源重組酶進行同源重組，得到pXMJ19-tac-EGFP（見圖1c）；以F-H36 和R-H36 為引物，雙引物互為模板擴增全合成啟動子H36 基因序列。PCR 產(chǎn)物純化后與經(jīng)KasⅠ和XhoⅠ酶切后的pXMJ19-tac-EGFP 進行酶切連接，得到pXMJ19-H36-EGFP，剩下的全合成啟動子均用上述方法構(gòu)建。

信號肽篩選表達載體構(gòu)建：以F-cspB 和RcspB為引物，從谷氨酸棒桿菌基因組中擴增cspB基因序列。PCR 產(chǎn)物純化后經(jīng)XhoⅠ和BamHⅠ酶切，與同樣經(jīng)XhoⅠ和BamHⅠ酶切后pXMJ19-ApxⅡ#5 載體上，得到pXMJ19-cspB-ApxⅡ#5（見圖1d），剩下的信號肽均用上述方法構(gòu)建。

圖1 pXMJ19表達載體構(gòu)建Fig.1 Plasmids construction of pXMJ19

1.5 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化

上述載體通過電轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入谷氨酸棒桿菌CGMCC1.15647[17]。

1.6 熒光強度測定

EGFP 檢測不同啟動子表達強度。將成功構(gòu)建具有不同啟動子的表達載體轉(zhuǎn)化至谷氨酸棒桿菌中，分別從平板上取3 個轉(zhuǎn)化子將其轉(zhuǎn)染至24 孔板中（每孔含2 mL LBB 培養(yǎng)基）。30 ℃以200 r·min-1培養(yǎng)約12 h，將谷氨酸棒桿菌轉(zhuǎn)接至新24 孔板（每孔含2 mL LBB 培養(yǎng)基），以初始OD600=0.05，二次活化培養(yǎng)2 h后，在含有誘導性啟動子的每個孔中添加1 mmol·L-1誘導劑IPTG，添加IPTG 誘導劑后繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后測量熒光強度，組成型啟動子中不添加任何誘導劑。

首先用培養(yǎng)基將酶標儀標零，去培養(yǎng)后菌液加入培養(yǎng)基充分稀釋，稀釋后終濃度OD600=0.4～0.7，利用酶標儀測定菌液OD600濃度并記錄，同時利用熒光計測定稀釋后菌液熒光強度（激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長507 nm），計算單位OD600熒光強度以指示不同啟動子表達強度。每個載體轉(zhuǎn)化后選取的3個轉(zhuǎn)化子作為生物學重復。

1.7 ApxⅡ#5 純化分析及SDS-PAGE 和Western blot

將帶有質(zhì)粒pXMJ19-ApxⅡ#5的谷氨酸棒桿菌置于LBB 培養(yǎng)基中，30 ℃過夜培養(yǎng)，然后以1∶50轉(zhuǎn)接至新鮮培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3 h 后當OD600為0.6 時加入1 mmol·L-1IPTG。培養(yǎng)24 h 后，通過離心和過濾收集培養(yǎng)上清液。用AKATA 系統(tǒng)中His Trap HP 色譜柱純化ApxⅡ#5-His 蛋白。蛋白純度通過SDS-PAGE分析測定，分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為4%。電泳電壓為120 V，結(jié)束后用考馬斯亮藍染色，脫色后置于凝膠成像儀拍照。Western bolt操作參照文獻[18]，以HRP-conjugated anti-His為抗體檢測。

1.8 BSA蛋白濃度及ELISA活性測定

蛋白濃度測定采用BSA 定量方法，將BSA 標品定量30、40、50、100、200 mg·L-1，利用SDSPAGE 分析蛋白純度，結(jié)束后利用Image J 計算灰度值，根據(jù)不同濃度BSA 繪制標準曲線，定量蛋白ApxⅡ#5。取發(fā)酵表達ApxⅡ#5 的發(fā)酵上清液，嚴格按照ELISA 說明書操作，檢測ApxⅡ#5活性。

續(xù)表

2 結(jié)果與分析

2.1 ApxⅡ在谷氨酸棒桿菌體系中的表達

將構(gòu)建好質(zhì)粒轉(zhuǎn)入谷氨酸棒桿菌CGMCC 1.15647中表達，IPTG 誘導24 h后收集發(fā)酵上清液作為胞外分泌表達樣品，將離心沉淀菌體作超聲破碎，收集破碎上清液和破碎沉淀分別作為胞內(nèi)可溶蛋白樣品及包涵體形式蛋白樣品。如圖2a 所示，SDS-PAGE和Western blot試驗結(jié)果表明，與對照組相比，不管是胞外分泌、胞內(nèi)可溶或胞內(nèi)包涵體形式，ApxⅡ全長蛋白質(zhì)（約100 ku）均未在谷氨酸棒桿菌CGMCC 1.15647 中表達。推測可能是谷氨酸棒桿菌內(nèi)部翻譯系統(tǒng)導致全長ApxⅡ并未被完整翻譯。針對全長ApxⅡ在谷氨酸棒桿菌中不表達情況，截短全長ApxⅡ。

2.2 截短ApxⅡ在谷氨酸棒桿菌中的分泌表達

針對全長ApxⅡ表達困難問題，對ApxⅡ進行截短，其中文獻[6]中報道截短ApxⅡ#5片段具有和全長一樣的免疫效果，因此選取ApxⅡ#5片段作分泌表達，如圖1b 所示。通過引物和酶切驗證pX?MJ19-ApxⅡ#5質(zhì)粒（見圖2b），測序正確后將其轉(zhuǎn)化入谷氨酸棒桿菌CGMCC1.15647 中表達，誘導24 h 后收集發(fā)酵上清液，破碎上清液和破碎沉淀，如圖2c下圖，Western blot顯示，泳道L4和L7與對照組L1相比，在50 ku出現(xiàn)明顯條帶，說明截短ApxⅡ可在谷氨酸棒桿菌中分泌表達。同時，SDS-PAGE中泳道L4和L7并無明顯條帶，說明截短ApxⅡ#5分泌到胞外的產(chǎn)量較低，并不能在SDS-PAGE上直接看出。綜上，截短ApxⅡ蛋白大小在50 ku，能成功在谷氨酸棒桿菌中分泌表達，但蛋白產(chǎn)量較低。因此進一步優(yōu)化表達宿主谷氨酸棒桿菌中表達元件增強pXMJ19載體表達強度，提高ApxⅡ#5產(chǎn)量。

圖2 全長和截短ApxⅡ表達Fig.2 Expression of full length and truncated ApxⅡ

2.3 ApxⅡ#5啟動子篩選

在谷氨酸棒桿菌CGMCC1.15647成功分泌表達ApxⅡ#5 后，參照文獻[19]選取8 種低、中、高不同表達強度全合成組成型啟動子（見圖3a），與目前表達ApxⅡ#5 所用誘導型啟動子tac比較，找到表達強度最強啟動子。將不同啟動子構(gòu)建至表達載體pXMJ19-EGFP 中并用KasⅠ和XhoⅠ酶切驗證（見圖3b）。EGFP檢測不同啟動子表達強度，將成功構(gòu)建具有不同啟動子的表達載體pXMJ19-EGFP 轉(zhuǎn)化至谷氨酸棒桿菌CGMCC1.15646 中表達。以含pXMJ19的CGMCC 1.15646 轉(zhuǎn)化子作為陰性對照，利用EGFP熒光強度對比不同啟動子表達強度。如圖3c所示，組成型啟動子中，H36熒光強度最高，但與對照組tac啟動子相比，組成型H36啟動子強度僅為tac啟動子63.23%，因此繼續(xù)選用誘導型tac啟動子作為ApxⅡ#5 表達載體中啟動子。通過圖2c中SDS-PAGE 可見，ApxⅡ#5分泌表達量過少，很難在SDS-PAGE上清晰看出具體條帶，為進一步提高ApxⅡ#5分泌表達產(chǎn)量，篩選表達元件中信號肽。

圖3 ApxⅡ#5啟動子篩選Fig.3 Screening of promoters of the truncated protein ApxⅡ#5

2.4 ApxⅡ#5信號肽篩選

在成功選用tac作為谷氨酸棒桿菌表達載體啟動子后，如圖4a 所示，挑選谷氨酸棒桿菌基因組中五種不同信號肽Cg1514、CspA、CgR0949、PorB 和CspB 進行蛋白表達強度篩選，并成功構(gòu)建不同信號肽表達載體pXMJ19-ApxⅡ#5-His。通過對比蛋白質(zhì)純度來檢測不同信號肽對ApxⅡ#5在谷氨酸棒桿菌中分泌表達的影響。將成功構(gòu)建具有不同信號肽的表達載體轉(zhuǎn)化至谷氨酸棒桿菌CGMCC1.15647分泌表達。對比不同信號肽表達載體的SDS-PAGE 及Western blot（見圖4b），用Im?age J進行灰度分析，以相對表達量最低的CgR0949信號肽作為相對表達量為1的對照組，其中相對表達較高的是信號肽Cg1514、CspA及CspB，分泌表達強度分別為對照組4.08、5.03 及5.48 倍。最后，選擇信號肽CspB 作為表達載體pXMJ19-ApxⅡ#5-His 信號肽，得到表達載體pXMJ19-tac-CspB-ApxⅡ#5。

圖4 ApxⅡ#5信號肽篩選Fig.4 Screening of the signal peptides of ApxⅡ#5

2.5 ApxⅡ#5 在谷氨酸棒桿菌CGMCC1.15647 的發(fā)酵表達及免疫活性

目前具有最強表達能力的載體組合（pXMJ19-tac-CspB-ApxⅡ#5）在搖瓶中發(fā)酵表達ApxⅡ#5（50 ku）并檢測ApxⅡ#5 免疫活性。純化結(jié)果如圖5a 所示，純化后ApxⅡ#5 蛋白在45 ku 降解，通過在SDS-PAGE 用BSA 標品進行蛋白定量（見圖5b、c），ApxⅡ#5在搖瓶中蛋白產(chǎn)量為51.1 mg·L-1。一抗為豬胸膜肺炎抗體陽性血清，二抗為HRP羊抗豬IgG，ELISA檢測ApxⅡ#5活性并測量反應后A450吸光值，吸光值（ApxⅡ#5）＞2.1吸光值（Control對照），說明ApxⅡ#5具有活性（見圖5d、e）。

圖5 ApxⅡ#5在谷氨酸棒桿菌中胞外分泌表達及活性測定Fig.5 Extracellualr secretion expression and activity of truncated protein ApxⅡ#5 in C.glutamicum

3 討論與結(jié)論

豬胸膜肺炎疫苗主要分為活疫苗、亞單位疫苗和基因工程疫苗。其中滅活疫苗抗體效價低且交叉保護性差，Liao等制作豬胸膜肺炎滅活口服疫苗進行免疫試驗，發(fā)現(xiàn)滅活口服疫苗組感染概率為40%，且不同血清型之間缺少交叉保護，需根據(jù)地區(qū)流行性制備多價滅活疫苗[20]。單一亞單位疫苗成本過高，Oishi 等通過測試體外培養(yǎng)豬胸膜肺炎三種血清型制備的抗原，發(fā)現(xiàn)其可提供高達90%～100%同源保護率，但體外培養(yǎng)成本較高[21]?；蚬こ桃呙缈蓪⑻囟乖砦豢寺”磉_并減少多余片段，最大限度保留亞單位疫苗免疫原性。因此，重組亞單位疫苗結(jié)合兩者，是工業(yè)化不二之選，Seah等通過截取ApxⅠ細胞毒素N端40-388號氨基酸制成重組亞單位疫苗，成功提供免疫保護[22]；Wang 等將單個或多個不同的細胞毒素ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ和外膜蛋白Omp 制成多組分重組亞單位疫苗，對不同血清型豬胸膜肺炎均具備保護作用[23]。目前，豬胸膜肺炎亞單位疫苗Apx主要由大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)。李鵬通過大腸桿菌BL21生產(chǎn)ApxⅢA和ApxⅣA亞單位疫苗，但得到Apx蛋白樣品為包涵體，增加工業(yè)化純化成本[24]。利用谷氨酸棒桿菌分泌表達重組疫苗蛋白ApxⅡ，是一種全新疫苗生產(chǎn)微生物體系。谷氨酸棒桿菌多用于生產(chǎn)氨基酸[25]，用于疫苗蛋白生產(chǎn)較少，未充分利用其分泌表達異源蛋白潛力。通過谷氨酸棒桿菌分泌表達豬胸膜肺炎疫苗不僅可規(guī)避大腸桿菌表達體系內(nèi)毒素問題，還可大幅減少疫苗蛋白下游純化過程，降低疫苗生產(chǎn)成本。

本研究通過谷氨酸棒桿菌分泌表達截短豬胸膜肺炎重組亞單位疫苗ApxⅡ并篩選表達載體中啟動子tac和信號肽CspB 提高產(chǎn)量。最終ApxⅡ#5在搖瓶中誘導發(fā)酵24 h表達量為51.1 mg·L-1，通過ELISA試劑盒檢測到抗原活性。使用谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)的豬胸膜肺炎亞單位疫苗ApxⅡ相較大腸桿菌具有無內(nèi)毒素、胞外分泌等特點，結(jié)合成熟培養(yǎng)工藝和遺傳操作技術(shù)，可快速構(gòu)建表達高效、生產(chǎn)成本低的豬胸膜肺炎疫苗生產(chǎn)體系。但在研究中發(fā)現(xiàn)，ApxⅡ#5 在胞外分泌過程中產(chǎn)生約20 ku蛋白（見圖5b），經(jīng)質(zhì)譜鑒定，該肽段由ApxⅡ#5降解產(chǎn)生，后續(xù)可通過減少ApxⅡ#5降解進一步提高產(chǎn)量。

目前，谷氨酸棒桿菌分泌表達豬胸膜肺炎亞單位疫苗ApxⅡ研究較少，限制豬胸膜肺炎疫苗生產(chǎn)多樣性。研究谷氨酸棒桿菌分泌表達截斷豬胸膜肺炎亞單位疫苗ApxⅡ，對未來豬胸膜肺炎疫苗研制具有指導意義，為國家疫苗產(chǎn)業(yè)提供可用、低成本微生物表達體系。