丁子媛，劉 順，王思婕，陸 雯，亓 魯，朱 龍，許星鴻

(江蘇海洋大學(xué) 海洋科學(xué)與水產(chǎn)學(xué)院，江蘇 連云港 222005)

雙酚A(bisphenol A，BPA)屬于環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，為制作環(huán)氧和酚醛樹脂、聚碳酸酯塑料和食品漆涂料的基礎(chǔ)原料[1]。BPA高度的生殖毒性和風險效應(yīng)使得其被歐盟列為應(yīng)引起高度重視的化合物之一。盡管BPA具有毒性，但它仍被廣泛用于日常生活用品(包括紙張、水管、電子設(shè)備等)[2]，甚至出現(xiàn)在食品材料中(包括食品包裝袋、飲用水瓶、罐頭包裝涂層等)[3]，對人類具有致癌、增加糖尿病和心臟病的風險等危害[4]。目前有關(guān)BPA毒性的研究多集中在哺乳類、兩棲類和淡水水生生物等方面，如張石磊[5]發(fā)現(xiàn)低濃度BPA長期脅迫孕鼠導(dǎo)致其胚胎發(fā)育中斷，二代小鼠生殖器官發(fā)育異常；李圓圓等[6]研究發(fā)現(xiàn)BPA對黑斑蛙(Pelophylaxnigromaculatus)胚胎的96 h-LC50為7.68 mg/L，對蝌蚪的96 h-LC50為9.00 mg/L；周家輝等[7]報道BPA暴露可延遲稀有鮈鯽(Gobiocyprisrarus)胚胎孵化，對仔魚的毒性效應(yīng)表現(xiàn)為死亡率升高、心包囊水腫、心率下降及魚鰾充氣率下降。BPA主要通過工業(yè)廢水排放、垃圾滲濾液或其他化合物的自然降解進入水生態(tài)系統(tǒng)，進而對水生生物產(chǎn)生毒性作用，如抑制魚類繁殖、干擾魚類行為以及抑制藻類細胞分裂和光合作用等。BPA由于分布廣、難降解、易蓄積，其對海洋底棲動物比陸生動物具有更高的毒性。

單環(huán)刺螠(Urechisunicinctus)俗稱海腸，屬于螠蟲動物門(Echiura)、螠綱(Echiurida)、無管螠目(Xenopneusta)、刺螠科(Urechidae)、刺螠屬(Urechis)，主要分布于中國、朝鮮、俄羅斯和日本等海域潮間帶[8]。單環(huán)刺螠體壁肌肉味鮮美、富含蛋白質(zhì)和不飽和脂肪酸，為消費者喜愛的海產(chǎn)品；其體腔液可提取纖溶酶、速激肽等藥用活性物質(zhì)[9]，具有較大的開發(fā)利用價值。有關(guān)BPA對單環(huán)刺螠的毒性效應(yīng)迄今尚未見報道。本文研究了BPA對單環(huán)刺螠的急性毒性及消化酶活力的影響，旨在為環(huán)境內(nèi)分泌干擾物對海洋底棲生物的毒性效應(yīng)研究提供數(shù)據(jù)參考，并可為海洋生態(tài)系統(tǒng)中環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的風險評價和漁業(yè)生物資源保護提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用單環(huán)刺螠購自江蘇省連云港市海寧中路水產(chǎn)品市場，平均體長為(11.5±1.3)cm，體質(zhì)量為(19.8±3.5)g，于實驗室暫養(yǎng)7 d后進行實驗。暫養(yǎng)條件為：鹽度25，pH 8，水溫(15±1)℃，自然光照，連續(xù)充氣，日投喂2次小球藻(Chlorellapacifica)，藻液密度1×106個/mL，投喂量10 mL/L。挑選體色鮮亮、大小均勻、活力較強的健康單環(huán)刺螠作為實驗對象。實驗用水為自來水和海水素配制成鹽度25的人工海水，經(jīng)過濾曝氣充氧處理后使用。

1.2 試劑配制

因BPA在水中溶解度低，采用無水乙醇為助溶劑，配置成質(zhì)量濃度為400 mg/L的母液，4 ℃避光保存。本研究所用BPA購自生工生物工程(上海)股份有限公司，為分析純。

1.3 實驗方法

1.3.1 急性毒性實驗 采用半靜態(tài)水質(zhì)接觸法(GB/T 27861—2011)進行急性毒性實驗[10]。根據(jù)BPA預(yù)實驗得出96 h無死亡發(fā)生的最高濃度和導(dǎo)致100%死亡的最低濃度，兩濃度間按照等對數(shù)間距設(shè)置7個質(zhì)量濃度梯度：3.000，3.830，4.891，6.246，7.976，10.186和13.000 mg/L，另設(shè)海水空白組和無水乙醇溶劑組作為對照，溶劑組中無水乙醇含量與最高濃度組中無水乙醇含量相同。每組設(shè)置3個重復(fù)，每個重復(fù)隨機放置10條單環(huán)刺螠，于17 cm×19 cm×30 cm養(yǎng)殖箱中飼養(yǎng)，養(yǎng)殖條件與暫養(yǎng)時相同，每24 h全量更換海水并維持各組BPA質(zhì)量濃度，及時清除分泌物、排泄物以及死亡個體，實驗期間不投餌，以消除餌料影響。實驗共處理96 h，觀察形態(tài)特征變化，并記錄24，48，72和96 h的死亡個數(shù)。蟲體顏色發(fā)白、用玻璃棒觸碰時無明顯收縮反應(yīng)即為死亡[11]。采用概率單位法計算出不同暴露時間的死亡率、半致死濃度LC50以及安全濃度SC(safe concentration)。SC=96 h×LC50×0.1[12]。根據(jù)96 h的LC50評定污染物的毒性等級[13]。

1.3.2 BPA對單環(huán)刺螠消化酶活力的影響 根據(jù)“1.3.1”急性毒性實驗所得BPA對單環(huán)刺螠的安全濃度以及BPA在水環(huán)境中的實際污染水平[1]，設(shè)置對照組和3個BPA濃度組：0.07，7，700 μg/L。每組設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)隨機放置20條單環(huán)刺螠，于17 cm×19 cm×30 cm養(yǎng)殖箱中飼養(yǎng)15 d，養(yǎng)殖條件與暫養(yǎng)時相同，每日全量更換海水并維持各組BPA質(zhì)量濃度。在取材前一天停止投餌，以消除消化道內(nèi)殘餌的影響。于實驗0.5，1，3，5，10和15 d，每組隨機取3條單環(huán)刺螠，置冰盤內(nèi)解剖，取出消化道，放掉呼吸腸中水分，以100 g/L加入預(yù)冷蒸餾水，于冰浴中勻漿10 min。取部分勻漿液直接用于測定脂肪酶活力，其余勻漿液于10 000 r/min，1 ℃離心30 min。取上清液于-80 ℃保存，用于測定其他消化酶活力。蛋白酶活力測定采用福林—酚法，淀粉酶活力測定采用淀粉—碘顯色法，纖維素酶活力測定采用3，5-二硝基水楊酸顯色法[14]，脂肪酶活力測定采用NaOH滴定法[15]。酶液蛋白濃度測定采用考馬斯亮藍G-250法，以牛血清蛋白為標準物進行測定。

蛋白酶活性單位定義為：在一定溫度和pH下，1 min水解酪蛋白生成1 μg酪氨酸作為1個酶活性單位(U)。淀粉酶活性單位定義為：在35 ℃下，30 min內(nèi)，100 mL酶液中的淀粉酶能完全水解淀粉10 mg為1個酶活性單位(U)。纖維素酶活性單位定義為：在pH 4.4，65 ℃下，1 min催化纖維素生成1 μg葡萄糖為1個酶活性單位(U)。脂肪酶活性單位定義為：1 mL酶液在一定溫度和pH條件下，1 min水解底物產(chǎn)生1 μmol的可滴定脂肪酸為1個酶活性單位(U)。各酶的活力均定義為：1 mg酶液蛋白所具有的酶活性單位數(shù)(U/mg)。

1.4 數(shù)據(jù)處理和評價方法

實驗結(jié)果以“平均數(shù)±標準差”表示，利用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行單因子方差分析(One-Way ANOVA)，LSD(least significant difference)多重比較和Duncan氏檢驗，顯著水平設(shè)為0.05；并得出BPA對單環(huán)刺螠急性毒性效應(yīng)的概率單位與濃度對數(shù)的回歸方程，以及48,72,96 h的LC50和95%置信區(qū)間。

2 結(jié)果

2.1 BPA對單環(huán)刺螠的急性毒性

單環(huán)刺螠接觸不同濃度BPA后活力均受到一定影響，暴露24 h各處理組未出現(xiàn)死亡，但體形變細長、活力下降并伴有輕微吐臟現(xiàn)象。隨暴露時間延長，單環(huán)刺螠體表粘液增多，體壁變薄、出現(xiàn)痤瘡，褶皺增多呈串珠狀；伸縮頻率下降，受外界刺激時應(yīng)激減弱；死亡個體多表現(xiàn)為黑色淤血、癱軟漂浮，或呈現(xiàn)紅色腫脹、硬結(jié)下沉(見圖1)。

a 體形細長或體表褶皺呈串珠狀

暴露于不同濃度BPA后單環(huán)刺螠的死亡率結(jié)果見表1。無水乙醇溶劑組與海水空白組96 h內(nèi)均無死亡，表明以無水乙醇作為助溶劑在個體水平對本實驗的毒性結(jié)果無影響。24 h各濃度組未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，隨著BPA濃度的升高和暴露時間的延長，單環(huán)刺螠死亡率逐漸上升，48 h高濃度組(質(zhì)量濃度10.186 mg/L，13.000 mg/L)開始出現(xiàn)死亡，死亡率存在顯著差異(P<0.05)，13.000 mg/L濃度組96 h全部死亡。

表1 暴露于不同濃度BPA溶液后單環(huán)刺螠的死亡率

BPA對單環(huán)刺螠急性毒性效應(yīng)的回歸統(tǒng)計結(jié)果見表2。在處理24 h內(nèi)，各濃度組均未出現(xiàn)死亡，因此，24 h時BPA的LC50>13.000 mg/L。48，72，96 h時BPA的LC50(95%置信區(qū)間)分別為13.297 mg/L(12.455～14.993 mg/L)，10.487 mg/L(9.711～11.487 mg/L)，7.515 mg/L(7.000～8.098 mg/L)，BPA對單環(huán)刺螠的安全濃度SC為0.752 mg/L。根據(jù)BPA對單環(huán)刺螠急性毒性效應(yīng)的概率單位與濃度對數(shù)的回歸方程，48，72，96 h的相關(guān)系數(shù)R2分別為0.981 2，0.970 4，0.954 4，表明單環(huán)刺螠在BPA中的死亡率與質(zhì)量濃度之間存在顯著的相關(guān)性(P<0.05)，具有明顯的劑量—效應(yīng)關(guān)系。根據(jù)GB 30000.28—2013《化學(xué)品分類和標簽規(guī)范 第28部分：對水生環(huán)境的危害》[13]對受試物的急性水環(huán)境毒性的分級標準(96 h的LC50≤1 mg/L為Ⅰ級，1 mg/L

表2 BPA對單環(huán)刺螠急性毒性效應(yīng)的回歸統(tǒng)計

2.2 BPA對單環(huán)刺螠消化道消化酶活力的影響

2.2.1 BPA對蛋白酶活力的影響 BPA對單環(huán)刺螠消化道胃蛋白酶活力的影響如圖2所示。

圖2 BPA對單環(huán)刺螠消化道胃蛋白酶活力的影響

在BPA暴露下，低質(zhì)量濃度0.07 μg/L組胃蛋白酶活力呈現(xiàn)明顯的誘導(dǎo)效應(yīng)，處理0.5 d時升高至最大值(P<0.05)，但隨脅迫時間延長逐漸下降，至處理15 d與對照組相近；中質(zhì)量濃度7 μg/L組胃蛋白酶活力在BPA脅迫下雖略有上升，但與對照組差異不顯著(P>0.05)；高質(zhì)量濃度700 μg/L組胃蛋白酶活力呈現(xiàn)波動的變化，處理0.5 d時即顯著低于對照組(P<0.05)，隨暴露時間延長有所回升后又逐漸下降，整體呈現(xiàn)抑制效應(yīng)。

BPA對單環(huán)刺螠消化道胰蛋白酶活力的影響如圖3所示。

圖3 BPA對單環(huán)刺螠消化道胰蛋白酶活力的影響

BPA暴露的一定時間內(nèi)，對單環(huán)刺螠胰蛋白酶活力呈現(xiàn)顯著的誘導(dǎo)效應(yīng)。以高質(zhì)量濃度700 μg/L組誘導(dǎo)最快，在處理0.5 d時胰蛋白酶活力即達到最大值，隨后逐漸下降。0.07 μg/L和7 μg/L兩組胰蛋白酶活力呈現(xiàn)先降后升再降的趨勢，分別于處理5 d和1 d達到最大值。至處理15 d，實驗組胰蛋白酶活力均顯著低于對照組(P<0.05)，且呈現(xiàn)一定的劑量—效應(yīng)關(guān)系。

2.2.2 BPA對單環(huán)刺螠消化道淀粉酶活力的影響 BPA脅迫對單環(huán)刺螠消化道淀粉酶活力呈現(xiàn)明顯的抑制效應(yīng)(見圖4)。脅迫0.5 d和1 d時，0.07 μg/L和7 μg/L質(zhì)量濃度組淀粉酶活力與對照組差異不顯著，高質(zhì)量濃度700 μg/L組淀粉酶活力顯著低于其他實驗組(P<0.05)。脅迫3 d時，各實驗組淀粉酶活力均顯著低于對照組，隨脅迫時間延長雖略有回升，但至處理15 d，各實驗組淀粉酶活力仍顯著低于對照組(P<0.05)。

圖4 BPA對單環(huán)刺螠消化道淀粉酶活力的影響

2.2.3 BPA對纖維素酶活力的影響 在BPA脅迫下，單環(huán)刺螠消化道纖維素酶活力呈現(xiàn)先降后升再降的變化趨勢(見圖5)。脅迫0.5 d和3 d，各實驗組纖維素酶活力均持續(xù)下降，但實驗組間差異不顯著(P>0.05)。處理5 d時，實驗組纖維素酶活力有所回升，但隨后又呈現(xiàn)出下降趨勢。至處理15 d時，各實驗組纖維素酶活力均顯著低于對照組(P<0.05)，脅迫濃度越高纖維素酶活力越低，呈現(xiàn)一定的劑量—效應(yīng)關(guān)系。

圖5 BPA對單環(huán)刺螠消化道纖維素酶活力的影響

2.2.4 BPA對脂肪酶活力的影響 由圖6可見，BPA對單環(huán)刺螠消化道脂肪酶活力有顯著誘導(dǎo)作用。處理0.5 d時，各實驗組脂肪酶活力均顯著升高，以中質(zhì)量濃度7 μg/L組誘導(dǎo)幅度最大。隨脅迫時間延長，各實驗組脂肪酶活力均呈現(xiàn)先降后升再降的趨勢，至處理10 d，低質(zhì)量濃度0.07 μg/L組脂肪酶活力仍顯著高于對照組，但至處理15 d，各實驗組脂肪酶活力均顯著低于對照組(P<0.05)。

圖6 BPA對單環(huán)刺螠消化道脂肪酶活力的影響

3 討論

3.1 BPA對單環(huán)刺螠的急性毒性

已有研究表明，BPA能對水生生物的生長發(fā)育產(chǎn)生毒性效應(yīng)，導(dǎo)致畸形且行為異常等。李楠[16]報道高濃度BPA可導(dǎo)致斑馬魚(Barchydaniorerio)中毒，表現(xiàn)出側(cè)游、沉底以及反應(yīng)遲鈍等中毒癥狀。牛海崗等[17]發(fā)現(xiàn)BPA使中國林蛙(Ranachensinensis)蝌蚪身體蜷縮、黏液增多、游泳速度減慢并失去平衡，高濃度BPA會導(dǎo)致林蛙蝌蚪死亡。本研究中，在BPA暴露下，單環(huán)刺螠體形變得細長、伸縮頻繁，隨著暴露時間延長，其活力降低，伸縮頻率下降，受外界刺激時反應(yīng)遲鈍，身體僵硬，體表潰爛甚至癱軟死亡，與重金屬鎘[18]和鹽度等脅迫[19]下單環(huán)刺螠的表現(xiàn)一致，屬于外界環(huán)境變化時的機體應(yīng)激反應(yīng)。

單環(huán)刺螠的死亡率與BPA濃度呈正相關(guān)，并具有一定的時間—效應(yīng)關(guān)系。24 h內(nèi)各濃度組均未出現(xiàn)死亡，表明單環(huán)刺螠對短時間內(nèi)較高濃度BPA暴露具有一定的耐受能力。但隨暴露時間的延長，各實驗組死亡率上升，96 h時13.000 mg/L質(zhì)量濃度組單環(huán)刺螠全部死亡。BPA對單環(huán)刺螠48,72,96 h的LC50分別為13.297,10.487和7.515 mg/L，具有明顯的劑量—效應(yīng)關(guān)系。根據(jù)GB 30000.28—2013的分級標準，BPA對單環(huán)刺螠的毒性為Ⅱ級。BPA對日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)幼蝦24,48 h的LC50分別為25.68,12.03 mg/L[20]；對稀有鮈鯽胚胎和仔魚的96 h LC50分別為10.096,4.237 mg/L[7]；對明線瓶螺(Pomacealineata)成體48,96 h的LC50分別為22.80,11.09 mg/L[21]；對河蜆(Corbiculafluminea)96 h的LC50為6.34 mg/L[22]；對東亞三角渦蟲(Dugesiajaponica)48,72 h的LC50分別為8.49,6.43 mg/L[23]。由此可見，單環(huán)刺螠對BPA的耐受能力高于河蜆和東亞三角渦蟲，而低于明線瓶螺。關(guān)于BPA對海洋底棲動物的毒性效應(yīng)研究文獻非常有限，需要進一步積累該領(lǐng)域基礎(chǔ)資料。

深圳市近海海域海水中BPA污染質(zhì)量濃度在3.2～776.6 ng/L的范圍內(nèi)[24]，渤海南部海域與國內(nèi)部分海域相比BPA質(zhì)量濃度較低，范圍為1.5～275 ng/L[25]，新加坡近海部分區(qū)域(如樟宜、實龍崗)BPA質(zhì)量濃度達500 ng/L[26]。本研究結(jié)果表明BPA對單環(huán)刺螠的安全濃度為0.752 mg/L，雖遠高于目前海水中所檢測的BPA含量，但可通過食物鏈造成的富集效應(yīng)對生物尤其是底棲動物帶來一定的危害，其潛在的生態(tài)風險不可忽視。

3.2 BPA對單環(huán)刺螠消化道消化酶活力的影響

單環(huán)刺螠的生長發(fā)育依賴養(yǎng)分的攝入，與單環(huán)刺螠消化道中的消化酶密切相關(guān)。消化酶是具有促消化功能的蛋白質(zhì)，參與機體能量轉(zhuǎn)化，可分為蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶和脂肪酶等，是評估毒理效應(yīng)的有效參數(shù)[27]。因此，研究BPA對單環(huán)刺螠消化酶活力的影響，對人工養(yǎng)殖水質(zhì)調(diào)控及海域水環(huán)境污染物危險評估具有重要意義。

在本研究中，短時間、低質(zhì)量濃度的BPA脅迫可誘導(dǎo)單環(huán)刺螠蛋白酶和脂肪酶活力，但隨脅迫時間延長和質(zhì)量濃度增加，酶活力受到抑制。在內(nèi)分泌干擾物PBDEs對褶皺臂尾輪蟲(Brachionusplicatilis)消化酶的影響[28]、重金屬(Cu2+,Zn2+)對日本囊對蝦(Marsupenaeusjaponicus)幼蝦消化酶活力的影響[29]以及苯酚脅迫下多刺裸腹溞(Moinamacrocopa)腸道消化酶活力的變化[30]等研究中均得到了與本研究類似的“低促高抑”效應(yīng)。這種“低促高抑”效應(yīng)在早在19世紀就已被學(xué)者發(fā)現(xiàn)，又稱Hormesis效應(yīng)[31]。單環(huán)刺螠機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)受低濃度BPA的干擾，啟動應(yīng)激反應(yīng)，通過提高其消化酶活力能夠供給較多的能量，以維持正常的生理代謝，但隨著脅迫濃度的增大和脅迫時間的延長，超過了其耐受能力，消化酶活力亦受到抑制。

本研究結(jié)果顯示BPA對淀粉酶和纖維素酶活力具有顯著的抑制效應(yīng)，與王書揚等[18]關(guān)于鎘脅迫下單環(huán)刺螠體腔液淀粉酶的活力顯著下降的報道相一致。毛姍姍[32]發(fā)現(xiàn)植物雌激素——金雀異黃素能顯著降低金魚(CarassiusauratusLinnaeus)肝臟及腸道淀粉酶、蛋白酶的活性。BPA被認為是一種類雌激素和內(nèi)分泌干擾物，對斑馬魚胚胎發(fā)育具有生殖毒性[33]；BPA能通過損傷胰島素信號通路、誘導(dǎo)代謝重編程、改變DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的表達、誘導(dǎo)組蛋白修飾并改變miRNA的表達等途徑以及損傷抗氧化系統(tǒng)導(dǎo)致機體代謝紊亂[34]。Wang等[35]報道BPA對小鼠表現(xiàn)出強烈的腸道毒性，可引起腸道屏障功能障礙。單環(huán)刺螠為濾食性，以藻類和有機碎屑為食[36-37]，其食物富含植物多糖和纖維素，因此淀粉酶和纖維素酶活力處于較高水平。BPA脅迫可造成單環(huán)刺螠淀粉酶和纖維素酶活力迅速下降，表明BPA對其消化能力影響較大。關(guān)于BPA對單環(huán)刺螠消化機能影響的機制有待進一步研究。