蔣四強,李雄波,鄧維琴,楊梅,項超,范智義,李恒,3,李潔芝,陳功,3*

1(四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設計院有限公司，四川 成都，611130)2(四川省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所，四川 成都，610066) 3(四川東坡中國泡菜產(chǎn)業(yè)技術研究院，四川 眉山，620030)4(成都大學 食品與生物工程學院，四川 成都，610106)

郫縣豆瓣是我國有名的傳統(tǒng)發(fā)酵調(diào)味品，擁有悠久的歷史，因其色澤紅亮、酯香濃厚、味道鮮美，是經(jīng)典川菜必不可少的調(diào)味品之一，被譽為“川菜之魂”[1]。豆瓣曲是郫縣豆瓣生產(chǎn)重要的半成品之一，是以蠶豆、面粉為原料，接種米曲霉培養(yǎng)得到的富含多種微生物及酶類的曲料。豆瓣曲采用生料制作，自然發(fā)酵的制曲方式，具有微生物數(shù)量豐富、菌群結構復雜、高酶活性的特點。制曲是郫縣豆瓣生產(chǎn)必不可少的工序之一，目的是利用微生物在原料上生長代謝，達到各類微生物及生物酶富集的作用，便于后續(xù)發(fā)酵的啟動，因此制曲是郫縣豆瓣生產(chǎn)的關鍵控制點。

原料是影響傳統(tǒng)發(fā)酵食品品質的重要因素之一，目前國內(nèi)外相關研究報道較多。如成林等[2]、張清文等[3]對酒曲的研究表明不同糧食釀造的酒曲對酒的品質會有不同程度的影響。同時沈馨等[4]研究發(fā)現(xiàn)不同原料釀造黃酒的滋味品質存在顯著差異，其中以秈糯米、粳糯米為原料釀造的黃酒品質優(yōu)于大米。LEE等[5]在關于原料對醪糟品質特征影響的研究中發(fā)現(xiàn)，粳米制得的醪糟乙醇和總酸含量高于其他原料，小麥粉和大麥制得的醪糟分別含總糖與還原糖最高。喬鑫[6]發(fā)現(xiàn)不同品種大豆對黃豆醬中的揮發(fā)性物質有不同程度的影響，其中湖北孝感大豆(XG-01)和湖北漢南大豆(HN-01)釀造的黃豆醬風味更好。YAMANA等[7]在有關原料對谷物類和豆類醬油調(diào)味品成分和鮮味影響的研究中顯示，谷物原料制成的醬油調(diào)味料糖類含量高，豆類原料制成的醬油調(diào)味料氨基酸含量高。目前國內(nèi)關于豆瓣曲的研究主要集中在制曲工藝、菌種、有害代謝產(chǎn)物調(diào)控等方面，關于原料對豆瓣曲品質的影響還未見報道，因此開展相關研究十分有必要。

本研究對相同工藝下不同品種蠶豆制備豆瓣曲的理化、酶活性及微生物數(shù)量等品質指標進行差異分析，旨在通過探究不同品種蠶豆對豆瓣曲品質的影響，考察不同品種蠶豆對豆瓣醬生料制曲的適應性，篩選適宜加工郫縣豆瓣的蠶豆品種，為今后郫縣豆瓣釀造專用蠶豆品種的選擇提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：曲精購自濟寧玉園生物有限公司；蠶豆由四川省農(nóng)業(yè)科學院作物所提供，具體信息見表1。

試劑：碳酸鈉、三氯乙酸、鹽酸、氫氧化鈉、乳酸、乳酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、干酪素、福林酚試劑、硫酸銅、硫酸鉀、硫酸、對硝基苯酚、乙酸鈉、無水乙酸鈉、乙酸、37%甲醛、乙酰丙酮、濃硫酸，均為分析純，L-酪氨酸(生化試劑)，成都市科隆化學品有限公司；乙腈，色譜純，美國Sigma-Aldrich公司；平板計數(shù)瓊脂、孟加拉紅培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術有限責任公司。

表1 蠶豆品種信息Table 1 Broad bean cultivars information

1.2 儀器與設備

752G紫外可見分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司；DZKW-4恒溫水浴鍋，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；pHSJ-4F型pH計，梅特勒型-托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司；LC-2030 型高效液相色譜儀(配紫外檢測器)、RID-20A型示差折光檢測器，日本島津制作所；Carbomix H-NP10色譜柱， 美國賽分科技有限公司；TGL-20bR冷凍離心機、TGL-20bR冷凍離心機，上海安亭科學儀器廠;VORTEX-2旋渦混合器，美國GENE公司;Agilent 1260 Infinity II高效液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司；Ultimate Amino Acid(4.6 mm×250 mm, 5 μm)，月旭科技(上海)股份有限公司;TP-214型分析天平，美國Denver公司;KQ-500DE型超聲波清洗儀，昆山市超市儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 豆瓣曲的制備

參考李潔芝等[8]的方法，將蠶豆瓣放入沸水中漂燙3 min后立即撈出，冷水冷卻至常溫，瀝干水分與15%和0.003%的曲精均勻混合(以蠶豆瓣質量計)，平鋪于簸箕內(nèi)，鋪上棉布，在30 ℃曲房內(nèi)制曲48 h，每12 h翻1次，即得豆瓣曲。

1.3.2 豆瓣曲理化指標的測定

pH的測定：采用pHSJ-4F型pH計直接測定。

總酸及氨基酸態(tài)氮含量：根據(jù)GB 5009.235—2016《食品中氨基酸態(tài)氮測定》進行測定。

還原性糖含量：采用3,5-二硝基水楊酸法[9]進行測定。

酸性、中性蛋白酶活性：參照GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》進行測定。

細菌總數(shù)的測定：根據(jù)GB 4789.2—2016《食品微生物學檢驗 菌落總數(shù)測定》中方法進行。

霉菌、酵母菌總數(shù)的測定：根據(jù)GB 4789.15—2016《食品微生物學檢驗 霉菌和酵母菌計數(shù)》測定。

水分含量：根據(jù)GB 5009.3—2016《食品中水分的測定》進行測定。

游離氨基酸和有機酸含量：根據(jù)李雄波[10]所建立的方法進行測定。

1.4 感官品質評價

對豆瓣曲進行感官評定，由10名具有品評經(jīng)驗的人員組成評品小組，對豆瓣曲的氣味、顏色各方面進行感官評價，滿分40分，具體感官評價標準見表2。

表2 豆瓣曲感官評價指標Table 2 Sensory evaluation index of bean paste koji

1.5 數(shù)據(jù)處理

每次數(shù)據(jù)采集分別選擇3個制曲平行樣，對指標進行平行檢測，采用Excel 2016 進行原始數(shù)據(jù)處理，結果采用“平均值±標準差”表示。用Origin 2108、SIMCA14.1作圖，IBM SPSS Statistics 23對數(shù)據(jù)進行S-N-K兩兩比較和LSD單因素差異分析，顯著水平定為0.05，置信區(qū)間為95%。

2 結果與分析

2.1 不同品種蠶豆成曲微生物數(shù)量差異分析

細菌、霉菌和酵母菌是制曲過程中的重要微生物，同時也是郫縣豆瓣發(fā)酵過程中主要菌種，對甜瓣子發(fā)酵階段影響較大。由圖1可知，豆瓣曲中細菌、霉菌和酵母菌數(shù)量差異明顯(P<0.05)，不同品種蠶豆成曲中細菌是主要微生物，與前人研究中細菌的數(shù)量特征一致[11]；SCZG、CH23、TCX和CH19豆瓣曲中細菌數(shù)量較高，YD和CDDB豆瓣曲中細菌數(shù)量相對較低；豆瓣曲中霉菌數(shù)量較多，不同品種間霉菌數(shù)量差異較??；不同品種蠶豆成曲中酵母菌數(shù)量存在顯著差異，其中YD和SCZG豆瓣曲中酵母菌數(shù)量顯著低于其他品種豆瓣曲。有資料顯示碳源是限制微生物生長的第一因素，其主要為微生物生長提供能量，而侯美玲等[12]研究發(fā)現(xiàn)可溶性淀粉為最佳碳源，不同品種豆瓣曲中微生物數(shù)量出現(xiàn)差異，可能與蠶豆中可溶性淀粉、葡萄糖含量有直接關系，從而導致豆瓣曲的風味、色澤出現(xiàn)差異。

圖1 不同品種蠶豆制曲成曲微生物指標Fig.1 Microbial indexes of different cultivars of broad bean into koji 注：不同字母表示差異顯著(下同)

2.2 不同品種蠶豆成曲酶活性差異分析

制曲的主要目的就是利用各種微生物在原料基質上生長繁殖，積累淀粉酶，蛋白酶等重要生物酶，這些生物酶對甜瓣子發(fā)酵階段風味物質的形成有重要影響。由圖2-A所示，各豆瓣曲中淀粉酶活性差異明顯，CH19豆瓣曲淀粉酶活性最高，CH23、CDDB和TCX豆瓣曲淀粉酶活性差異不明顯；SCZG和YD豆瓣曲的淀粉酶活性最低，這與王翠玲等[13]有關淀粉酶活性差異分析結果一致。

由圖2-B可知，豆瓣曲中性蛋白酶活性遠遠高于酸性蛋白酶活性，表明制曲過程中米曲霉主要分泌中性蛋白酶，這與李峰等[14]研究結果一致。不同品種蠶豆制備的豆瓣曲之間中性蛋白酶活性差異顯著(P<0.05)，其中CH23、CDDB豆瓣曲的中性蛋白酶活性相對較高，其次是CH19和YD豆瓣曲，TCX、SCZG豆瓣曲的中性蛋白酶活性較低；豆瓣曲中酸性蛋白酶活性整體較低，而郫縣豆瓣發(fā)酵處于低酸狀態(tài)下，因此酸性蛋白酶可能在后續(xù)發(fā)酵過程中發(fā)揮較大的作用。

2.3 不同品種蠶豆成曲有機酸含量

有機酸作為豆瓣重要的風味物質，通常由微生物代謝和大分子物質水解產(chǎn)生，但制曲的環(huán)境、體系中微生物種類以及原料對有機酸的生成有影響[15]。由圖3可知，豆瓣曲中主要檢測出6種有機酸，包括草酸、檸檬酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸以及乙酸。其中檸檬酸、琥珀酸、乳酸以及乙酸是豆瓣中的主要呈酸物質[16]，蘋果酸為豆瓣曲中主要有機酸，在CH23豆瓣曲中含量最高，CH19和SCZG豆瓣曲次之，TCX最少；酒石酸、檸檬酸、草酸含量相對較高，在各豆瓣曲中均有檢測出，但CH19豆瓣曲不含酒石酸，資料顯示檸檬酸與蘋果酸以及酒石酸共同作用可使豆瓣味道更渾厚飽滿[17]；豆瓣曲中乳酸和乙酸含量相對較少，乙酸只在CH19和TCX豆瓣曲中檢測出，有機酸含量有較大差異，其主要與豆瓣曲發(fā)酵過程中各微生物的生存活動狀態(tài)[18]以及原料中碳源物質含量[19]有關。

A-淀粉酶活性；B-蛋白酶活性圖2 不同品種蠶豆制曲成曲淀粉酶活性和蛋白酶活性Fig.2 The activity of amylase and proteaseof different cultivars of broad bean into koji

圖3 不同品種蠶豆制曲成曲有機酸含量Fig.3 Organic acid content of different cultivars of broad bean into koji

2.4 不同品種蠶豆制曲游離氨基酸含量

氨基酸是一種重要的呈味物質，其種類反應了原料中蛋白質的組成，小分子呈味肽賦予豆瓣獨特的風味和口感，以鮮味、甜味、苦味為主的游離氨基酸影響著豆瓣的風味[20]。由圖4可知，在豆瓣曲中檢測出17種氨基酸，且含量差異較明顯；豆瓣曲中谷氨酸、亮氨酸以及精氨酸含量較高，資料顯示谷氨酸、精氨酸和亮氨酸是豆瓣發(fā)酵過程中主要氨基酸[21]，其中谷氨酸被認為是郫縣豆瓣風味的主要來源[22]，在CDDB豆瓣曲中含量最多，其次為CH23、TCX豆瓣曲；賴氨酸、絲氨酸、脯氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、丙氨酸與豆瓣的甜鮮味、苦味有關，在各豆瓣曲中含量相對較高；組氨酸、異亮氨酸、門冬氨酸、酪氨酸、胱氨酸、甘氨酸也是風味物質的來源，含量相對較低；蛋氨酸含量最少，但對產(chǎn)品呈香呈味以及增鮮有良好的輔助作用。不同豆瓣曲中氨基酸的含量和種類有較明顯的差異，除了微生物與酶以外，蠶豆中蛋白質的含量及組成也會影響游離氨基酸的產(chǎn)生[23]。

圖4 不同品種蠶豆制曲成曲氨基酸含量Fig.4 Amino acid content of different cultivars of broad beans into koji

2.5 不同品種蠶豆成曲的理化指標差異分析

對6種不同品種豆瓣曲理化指標進行統(tǒng)計分析，結果如表3所示，水分和pH的相對標準偏差<10%，品種間差異較小；總酸、氨基酸態(tài)氮和還原糖含量均>10%，品種間差異明顯，其中CH19、CH23、CDDB和SCZG蠶豆制備的豆瓣曲總酸含量較高，TCX和YD豆瓣曲總酸含量較低；TCX豆瓣曲的氨基酸態(tài)氮含量最高，其次為CH19、CH23、CDDB豆瓣曲，SCZG與YD豆瓣曲含量最低；CH23和CH19豆瓣曲還原糖含量較高，TC豆瓣曲的含量最低，其他豆瓣曲還原糖含量無明顯差異。值得注意的是，CH系列和CDDB豆瓣曲各項指標之間無較大差異，表現(xiàn)出相似的品質特征。

表3 不同品種蠶豆成曲理化指標Table 3 The physical and chemical indexes of different cultivars of broad beans′ koji

2.6 不同品種蠶豆成曲理化風味指標PCA

PCA通過降維的方法，將多個指標轉化為幾個綜合指標，從而能更好地反應樣品間的差異性，呈現(xiàn)樣品間集群與離群的特點[24]。由圖5-A可知，6種不同品種蠶豆制曲成曲分布在不同象限，被分成三類，表明不同品種蠶豆制曲成曲間品質存在差異。CDDB、CH23、SCZG以及CH19主要集中分布在第二象限，被分成一類，說明該4種豆瓣曲的品質相似。TCX與YD豆分別位于一、四象限，被分成二類，說明豆瓣曲品質與其他品種豆瓣曲有明顯的差異。由圖5-B可知，TCX和YD豆瓣曲主要受乳酸和pH的影響，游離氨基酸對CDDB、CH23、SCZG以及CH19豆瓣曲的影響最大。

1-氨酸;2-異亮氨酸;3-纈氨酸;4-蘇氨酸;5-絲氨酸;6-脯氨酸; 7-門冬氨酸;8-亮氨酸;9-酪氨酸;10-賴氨酸;11-精氨酸;12-胱氨酸; 13-谷氨酸;14-甘氨酸;15-蛋氨酸;16-丙氨酸;17-苯丙氨酸 A-不同品種豆瓣曲聚類PCA圖;B-為理化風味指標載荷矩陣圖圖5 基于PCA不同品種蠶豆成曲及風味理化指標Fig.5 Based on PCA of different cultivars of broad beans′koji and flavor physical and chemical indicators

2.7 不同品種蠶豆成曲感官品質分析

由表4可知，不同品種豆瓣曲的顏色評分無明顯差異，其他評分項得分有較明顯的差異，其中CH19、CH23、和CDDB豆瓣曲整體得分較高，均在40.0分以上；SCZG和TCX豆瓣曲的質地、氣味和孢子/菌絲狀態(tài)不佳，感官評分在37.25分左右；YD豆瓣曲整體的分較低，僅34.0分。CH19、CH23和CDDB豆瓣曲的感官得分在40.0分以上，說明使用成胡系列蠶豆可能更適于制作豆瓣曲；TCX、YD和SCZG豆瓣曲感官得分分別為36.0、34.0、38.5，可作為良性豆瓣曲，與PCA結果一致。

表4 不同品種蠶豆曲成曲感官得分 單位：分

3 結論

對6種不同品種蠶豆豆瓣曲的各項質量指標進行分析，發(fā)現(xiàn)不同品種蠶豆豆瓣曲的各項質量指標存在較明顯的差異，其中CH19、CH23和CDDB豆瓣曲的微生物總數(shù)、酶活性、還原糖、游離氨基酸和有機酸含量等豆瓣曲重要質量指標綜合表現(xiàn)優(yōu)于其他品種，說明其豆瓣曲具有良好的質量品質，適宜作為發(fā)酵郫縣豆瓣的蠶豆品種；TCX豆瓣曲水分、pH和氨基酸態(tài)氮含量最高，SCZG豆瓣曲具有較高的還原糖和最高的總酸含量，而TCX和SCZG豆瓣曲的微生物總數(shù)、酶活活性、有機酸、游離氨基酸等重要質量指標不及CH19、CH23和CDDB豆瓣曲，前者后期發(fā)酵得到甜瓣子和豆瓣醬品質可能也劣于后者；YD豆瓣曲各項指標均偏低，說明其制備的豆瓣曲質量差，不適于制備郫縣豆瓣。通過PCR發(fā)現(xiàn)CH19、CH23、CDDB和SCZG豆瓣曲品質相似，與YD和TCX豆瓣曲有明顯的區(qū)別；最后結合感官評價發(fā)現(xiàn)CH19、CH23、和CDDB豆瓣曲整體得分均在40.0分以上；SCZG和TCX豆瓣曲的質地、氣味和孢子/菌絲狀態(tài)不佳，感官評分在37.25分左右；YD豆瓣曲整體得分較低，僅34.0分，與PCA結果一致。綜上所述，在實際豆瓣曲的生產(chǎn)中，可選用CH19、CDDB和CH23蠶豆作為制作郫縣豆瓣的原料；YD蠶豆質地較硬，成曲品質差，不適于制作郫縣豆瓣；而氨基酸態(tài)氮含量較高的TCX豆瓣曲和還原糖含量較高的SCZG豆瓣曲具有產(chǎn)生多種風味物質的基礎，因此TCX和SCZG蠶豆適宜制備香味濃郁的老豆瓣。