賈海棟，李 毅

(河北省邯鄲市中心醫(yī)院骨一科 056000)

軟骨主要分布于長骨末端，在關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)過程中參與減震的作用[1]。關(guān)節(jié)軟骨主要由軟骨細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)組成，缺乏血管、神經(jīng)纖維和淋巴管。關(guān)節(jié)軟骨損傷是臨床上比較常見的疾病，是導(dǎo)致關(guān)節(jié)疼痛和殘疾的主要原因[2]。研究表明，美國每年有大約10萬例的關(guān)節(jié)軟骨損傷需要手術(shù)治療[3]。由于軟骨特殊的結(jié)構(gòu)，氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的來源有限，因此當(dāng)軟骨發(fā)生損傷時(shí)，其自我修復(fù)能力十分有限。目前，軟骨損傷的常用治療手段主要有：物理治療、藥物治療、手術(shù)治療，常用的手術(shù)方式主要有微骨折術(shù)、骨髓刺激術(shù)、自體軟骨細(xì)胞移植術(shù)等[4-8]。雖然其在臨床上得到了廣泛的應(yīng)用，但是每種治療方式都很難達(dá)到患者預(yù)期的期望。因此，急需尋求新的手段來修復(fù)軟骨缺損。

組織工程技術(shù)的發(fā)展為臨床很多疾病的治療提供了新的思路，在軟骨損傷的研究也取得了不錯(cuò)的成績。組織工程技術(shù)包括三大核心要素：種子細(xì)胞，生長因子和支架材料[9]。目前常用的種子細(xì)胞主要是各種來源的干細(xì)胞，包括：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)[10]、脂肪MSCs[11]、外周血來源的MSCs[12]等。BMSCs是目前應(yīng)用最為廣泛的干細(xì)胞，已經(jīng)證實(shí)其能夠向骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化[13-15]。

支架材料是組織工程技術(shù)的又一核心要素，其能夠?yàn)榉N子細(xì)胞的生長、增殖、分化提供良好的微環(huán)境。HAAM支架來源于人胎盤的羊膜，通過將羊膜脫細(xì)胞處理制備而成。由于來源廣泛、成本較低，且具有抗炎作用，HAAM支架作為一種天然生物支架材料已經(jīng)廣泛應(yīng)用于組織工程技術(shù)[16-18]。因此，本實(shí)驗(yàn)的目的即探究HAAM支架復(fù)合BMSCs是否具有促進(jìn)兔關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

健康成年新西蘭大白兔15只，體重2.5～3.0 kg，雌雄不限。

1.2 方法

1.2.1HAAM支架的制備

取下羊膜，無菌條件下轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室超凈臺上，用磷酸鹽緩沖液(PBS)多次沖洗，用剪刀剪成合適的大小置于玻璃皿中(上皮面朝上)，用含有乙二胺四乙酸(EDTA)濃度為0.25%的胰酶在37 ℃培養(yǎng)箱中消化30 min。取出后用細(xì)胞刮將消化下來的細(xì)胞刮掉。將脫細(xì)胞處理后的羊膜剪成適當(dāng)?shù)拇笮〔⑵戒佋?孔板中，用三抗對HAAM進(jìn)行消毒約1 h，吸干三抗后用PBS沖洗數(shù)次并用紫外線再次消毒1 h，見圖1。

A:分離胎盤上的羊膜；B:將羊膜用0.25%的胰酶消化；C:將脫細(xì)胞處理后的羊膜(HAAM)平鋪在6孔板。

1.2.2BMSCs的分離培養(yǎng)

將新西南大白兔處死并進(jìn)行消毒處理。切開皮膚，暴露股骨，將股骨取下置于PBS中。將雙側(cè)骨骺端截取，暴露骨髓腔。用5 mL注射器吸取PBS，用PBS反復(fù)沖洗骨髓腔，將骨髓全部沖洗出。800 r/min離心2 min，棄去上清液，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，然后接種到培養(yǎng)瓶，置于37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)，每2～3天換液。

1.2.3將BMSCs種植到HAAM支架上

將生長狀態(tài)良好的P3代BMSCs以1×105/cm2的密度種植到預(yù)先制備好的HAAM支架上，隔天在普通倒置相差顯微鏡下觀察BMSCs的生長情況，每2～3天更換培養(yǎng)基。

1.2.4鬼筆環(huán)肽染色

BMSCs種植到HAAM支架上后分別在1、3、7 d通過鬼筆環(huán)肽染色觀察細(xì)胞在支架上的生長情況，鬼筆環(huán)肽染色主要是觀察細(xì)胞的骨架。分別在1、3、7 d時(shí)選取在HAAM支架上生長情況良好的BMSCs進(jìn)行鬼筆環(huán)肽染色，吸掉培養(yǎng)基，PBS清洗細(xì)胞；用4%的多聚甲醛室溫固定10 min；再次用PBS清洗細(xì)胞；將配置好的鬼筆環(huán)肽工作液按照說明書劑量滴加到6孔板，室溫避光孵育30 min；用PBS清洗3次；然后用DAPI復(fù)染細(xì)胞核，約30 s；再次用PBS清洗3次。熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

所有動(dòng)物在手術(shù)前以0.75 mL/kg的劑量靜脈注射3%戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉。待麻醉起效后進(jìn)行備皮、消毒鋪巾，沿著左側(cè)膝關(guān)節(jié)正中切開皮膚，充分暴露膝關(guān)節(jié)腔，用環(huán)鉆在股骨滑車處鉆一直徑為3.5 mm,深度為3.0 mm的骨軟骨缺損(見圖2)。將15只新西南大白兔分為3組(每組5只)：空白對照組、HAAM組、HAAM+BMSCs組。復(fù)位髕骨，逐層縫合皮膚，傷口消毒，術(shù)后連續(xù)3 d肌內(nèi)注射青霉素20萬單位/只。術(shù)后3個(gè)月取關(guān)節(jié)標(biāo)本，大體上觀察軟骨缺損處的修復(fù)情況并進(jìn)行大體評分。

1.2.6組織學(xué)檢測

將標(biāo)本取下后立即用4%的多聚甲醛室溫固定24 h，然后用EDTA脫鈣液脫鈣約2周，然后進(jìn)行切片。首先將標(biāo)本脫水處理，然后石蠟包埋后切片。切片成功后進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)、甲苯胺藍(lán)觀察缺損處的修復(fù)情況。

1.2.7主要觀察指標(biāo)

BMSCs在HAAM支架上的生長情況及HAAM支架復(fù)合BMSCs對兔關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)作用。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 BMSCs的形態(tài)

倒置相差顯微鏡下觀察BMSCs的形態(tài)：P0代(原代)BMSCs多呈圓形或橢圓形貼壁生長；經(jīng)過多次傳代培養(yǎng)后BMSCs逐漸呈長梭形渦旋狀貼壁生長;P3代BMSCs形態(tài)最為典型，呈明顯的渦旋狀貼壁生長，見圖3。

2.2 鬼筆環(huán)肽染色

將BMSCs種到HAAM上后，再次分別在1、3、7 d后通過鬼筆環(huán)肽染色觀察細(xì)胞在支架上的生長情況。結(jié)果顯示：第1天，有少量的BMSCs在HAAM支架上生長，細(xì)胞的輪廓未發(fā)生明顯的改變，說明HAAM支架的空間結(jié)構(gòu)適合細(xì)胞的生長；第3天，BMSCs的數(shù)量明顯增加，幾乎呈倍數(shù)生長，說明BMSCs生長可能達(dá)到了對數(shù)期；第7天，BMSCs幾乎長滿整個(gè)HAAM支架，見圖4。

2.3 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

術(shù)后3個(gè)月，空白對照組缺損處未見明顯的修復(fù)組織，仍可見缺損的存在;HAAM組可見缺損處有修復(fù)組織的填充，但是缺損處表面不光滑，與周圍正常組織在色澤上有明顯的差異;HAAM+BMSCs組修復(fù)組織幾乎完全填滿了的缺損處，且表面光滑，色澤與正常軟骨相似，與正常軟骨組織連接的邊界幾乎完全消失，見圖5。對術(shù)后3個(gè)月的標(biāo)本進(jìn)行HE、甲苯胺藍(lán)染色，觀察各組軟骨的修復(fù)效果?？瞻讓φ战MHE染色顯示缺損仍有較大的缺口存在，未見明顯的再生組織，與正常組織交界明顯；甲苯胺藍(lán)染色呈陰性，說明沒有軟骨的再生，修復(fù)效果較差;HAAM組HE染色可見大量的新生組織，缺損處可見修復(fù)組織的填充，但是缺損處表面不光滑、不規(guī)則，與正常軟骨組織差異明顯；甲苯胺藍(lán)染色染色呈弱陽性，雖然有部分的新生軟骨的存在，但是其與正常的軟骨有一定的差異;HAAM+BMSCs組HE染色結(jié)果顯示缺損的關(guān)節(jié)軟骨部分被大量的新生組織填充，幾乎完全填滿，并且與周圍的軟骨正常組織結(jié)構(gòu)幾乎相同；甲苯胺藍(lán)染色呈強(qiáng)陽性，有大量新生軟骨的存在，見圖6。

3 討 論

關(guān)節(jié)軟骨損傷的修復(fù)是臨床上的一大難題，盡管目前有很多種治療軟骨損傷的方法，但是其遠(yuǎn)期效果均不是很理想。目前常用手術(shù)方式包括：自體軟骨細(xì)胞移植、骨軟骨移植、微骨折技術(shù)等[19-23]。雖然自體軟骨細(xì)胞移植在前瞻性隨機(jī)試驗(yàn)中取得了好的結(jié)果，但也存在一些問題，如需要兩次手術(shù)和高治療成本[19-21]；骨軟骨移植在短期內(nèi)具有良好的效果，但是與自體軟骨細(xì)胞移植相比，骨軟骨移植術(shù)后10年的失敗率(55%vs.17%)明顯增加[22]；微骨折的短期癥狀改善效果較好，但術(shù)后2年可見纖維組織再生，而且有臨床癥狀復(fù)發(fā)的情況出現(xiàn)[23]。

本實(shí)驗(yàn)通過組織工程技術(shù)的方式從支架材料和種子細(xì)胞方向入手，旨在為關(guān)節(jié)軟骨的修復(fù)提供新的思路。支架材料具有負(fù)載種子細(xì)胞、為細(xì)胞提供生長微環(huán)境的作用，是組織工程的一大關(guān)鍵。因此，本實(shí)驗(yàn)通過使用一種天然的支架材料來探究其對軟骨損傷修復(fù)的作用。人羊膜是一種透明的薄膜，具有豐富的細(xì)胞外基質(zhì)成分，主要有透明質(zhì)酸、纖連蛋白、膠原蛋白等。由于其具有抗炎性、來源廣泛等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究甚至臨床。HAAM通過人羊膜脫細(xì)胞處理而成，其細(xì)胞外基質(zhì)仍被保留，具有較好的生物相容性。相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究也證實(shí)了HAAM支架具有良好的生物相容性[24]。此外，也有研究證實(shí)了HAAM對軟骨的損傷修復(fù)具有一定的促進(jìn)作用，這都為本次實(shí)驗(yàn)提供了理論基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)采用了一種簡單、快速的方法成功制備了HAAM支架，雖然之前也有相關(guān)研究報(bào)告通過不同的方法將人羊膜脫細(xì)胞處理，從而制備HAAM支架，但是本實(shí)驗(yàn)通過對以前的方法進(jìn)行改進(jìn)，縮短了胰酶對新鮮羊膜的作用時(shí)間，從而最大限度地保留了羊膜的細(xì)胞外基質(zhì)成分，為細(xì)胞的種植提供了較好的微環(huán)境[25]。HAAM支架較其他支架而言具有獨(dú)特的優(yōu)勢，例如：來源廣泛、價(jià)格低廉、不存在道德倫理爭議、制備過程簡單等。因此，本實(shí)驗(yàn)選取了操作簡單、價(jià)格低廉、來源廣泛的方法成功制備并提取了組織工程的支架材料和種子細(xì)胞。將種子細(xì)胞種植到支架材料上通過掃描電鏡和鬼筆環(huán)肽染色觀察到細(xì)胞在支架上生長較好，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長細(xì)胞在支架上不斷增殖，說明支架材料適合細(xì)胞的生長。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)通過將種子細(xì)胞在HAAM支架上培養(yǎng)后移植到兔股骨滑車軟骨缺損處，觀察其對軟骨損傷的修復(fù)效果。結(jié)果提示：HAAM有一定的軟骨修復(fù)效果，但是HAAM+BMSCs的修復(fù)效果較HAAM組有明顯的差異。分析產(chǎn)生該結(jié)果的原因可能有以下幾點(diǎn)：(1)HAAM支架能夠?yàn)槿睋p處細(xì)胞的募集和生長提供較好的微環(huán)境，從而有利于軟骨的修復(fù)；(2)HAAM支架復(fù)合BMSCs對軟骨損傷修復(fù)有明顯作用，說明BMSCs在軟骨損傷的修復(fù)的過程中扮演著重要的角色；(3)HAAM支架可能對關(guān)節(jié)腔內(nèi)的干細(xì)胞及軟骨下骨的BMSCs有一定的招募作用，使周圍的干細(xì)胞遷徙到受損的部位從而起到一定的修復(fù)作用。當(dāng)軟骨損傷后，關(guān)節(jié)內(nèi)或周圍的BMSCs立即調(diào)動(dòng)，參與內(nèi)源性修復(fù)[26]，具體是何種BMSCs發(fā)揮最明顯的作用目前還不能明確，雖然有研究已經(jīng)證實(shí)損傷后的骨髓BMSCs是軟骨損傷后修復(fù)的主要細(xì)胞來源[26]。但可以肯定的是軟骨損傷后BMSCs對其損傷的修復(fù)有一定的作用。因此，本實(shí)驗(yàn)支架負(fù)載細(xì)胞組其修復(fù)效果最好，說明BMSCs確實(shí)發(fā)揮了作用。后續(xù)的實(shí)驗(yàn)還需進(jìn)一步通過HAAM支架負(fù)載不同的間充質(zhì)來觀察其對軟骨損傷的修復(fù)效果。

本實(shí)驗(yàn)未設(shè)置單純的BMSCs組，因?yàn)閱渭儗⒓?xì)胞移植到受損的關(guān)節(jié)軟骨缺損處很難保證細(xì)胞在局部發(fā)揮作用，可能在關(guān)節(jié)液的影響下流失。本實(shí)驗(yàn)有以下幾點(diǎn)不足：(1)本實(shí)驗(yàn)觀察的軟骨修復(fù)時(shí)間為3個(gè)月，軟骨損傷修復(fù)是一個(gè)緩慢的過程，因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)還需進(jìn)一步延長觀察時(shí)間，從遠(yuǎn)期觀察HAAM復(fù)合BMSCs對軟骨損傷修復(fù)的作用；(2)本實(shí)驗(yàn)僅僅觀察了一個(gè)時(shí)間點(diǎn)的軟骨修復(fù)情況，軟骨損傷修復(fù)是一個(gè)動(dòng)態(tài)的、逐漸變化的過程，因此，還需要進(jìn)一步完善相關(guān)實(shí)驗(yàn)，設(shè)置多個(gè)時(shí)間點(diǎn)動(dòng)態(tài)的觀察軟骨的修復(fù)情況；(3)本實(shí)驗(yàn)雖然證實(shí)了HAAM+BMSCs具有促進(jìn)軟骨修復(fù)的作用，但其具體機(jī)制不明確，還需要進(jìn)一步的研究明確其機(jī)制。