段棟棟， 李聰， 李夢雨， 李欣， 王克君， 李秀領(lǐng)， 韓雪蕾， 喬瑞敏， 李新建

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河南 鄭州 450046)

同源盒(homeobox, HOX)家族是高度保守的調(diào)節(jié)基因超家族，是與細(xì)胞發(fā)育相關(guān)的重要轉(zhuǎn)錄因子，廣泛存在于高等真核生物體內(nèi)，在調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、遷移和凋亡等方面發(fā)揮著重要作用[1]。BRIDGES等[2]最早于1923年在果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了HOX基因。在脊椎動(dòng)物中，根據(jù)HOX基因在染色體上的位置將其分為HOXA、HOXB、HOXC和HOXD這4個(gè)基因簇，共計(jì)39個(gè)基因[3-4]。HOX基因不僅與傷口修復(fù)等生理功能有關(guān)[5]，還與急性白血病[6]和癌癥[7]等一系列疾病有關(guān)，而且在脂肪組織代謝中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[8]。KALYPSO等[9]研究認(rèn)為，HOX基因?qū)χ窘M織發(fā)育與重塑具有重要的調(diào)節(jié)作用。GESTA等[10]通過分析人類脂肪組織的特異性差異發(fā)現(xiàn)，HOXA5基因的表達(dá)水平與肥胖程度和脂肪分布有關(guān)。CANTILE等[11]在研究人類脂肪組織中發(fā)現(xiàn)，HOXA1、HOXA4和HOXC4基因可能直接參與白色和棕色脂肪組織的分化。PARRILLO等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在高脂誘導(dǎo)肥胖小鼠的脂肪組織中HOXA5基因發(fā)生超甲基化導(dǎo)致其表達(dá)水平降低，且在干擾HOXA5基因后脂肪細(xì)胞分化被抑制。YAMAMOTO等[13]研究發(fā)現(xiàn)，HOXA5基因在小鼠棕脂和附睪白脂表達(dá)水平較高，而在皮下白脂中表達(dá)量較低，且與脂質(zhì)分解密切相關(guān)。SINGH等[14]發(fā)現(xiàn)棕色脂肪細(xì)胞的成脂與HOXA5基因緊密相關(guān)。脂肪沉積是脂肪組織發(fā)生和脂肪細(xì)胞增殖分化的一系列復(fù)雜的生物學(xué)過程，根據(jù)脂肪組織生成部位的不同可將其分為皮下脂肪、肌內(nèi)脂肪和內(nèi)臟脂肪，而皮下脂肪和背最長肌中的肌內(nèi)脂肪是影響豬肉品質(zhì)的重要因素[15]。確山黑豬是河南省優(yōu)良的地方豬品種，具有繁殖力高、脂肪沉積能力強(qiáng)以及肉質(zhì)優(yōu)良等特性，屬于脂肪型豬種[16]，是研究HOXA5基因表達(dá)模式的理想試驗(yàn)動(dòng)物，但是目前關(guān)于HOXA5基因?qū)Υ_山黑豬脂肪代謝影響的研究還未見報(bào)道。大白豬是世界上分布最廣的瘦肉型豬種之一，與確山黑豬相比在胴體脂肪比例方面有所不同。本研究明確了確山黑豬HOXA5基因在不同組織(心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、皮下脂肪、腹部脂肪、背最長肌)中的表達(dá)差異，對(duì)比了HOXA5基因在確山黑豬與大白豬的皮下脂肪和背最長肌表達(dá)效果，并對(duì)確山黑豬HOXA5蛋白生物學(xué)進(jìn)行了分析，以期探究HOXA5基因?qū)ωi脂肪沉積的影響，為今后研究HOXA5基因調(diào)控豬脂肪沉積的分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

試驗(yàn)選用在相同飼養(yǎng)條件下約110 kg健康的確山黑豬和大白豬各3頭。屠宰后，采集確山黑豬的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、皮下脂肪、腹部脂肪和背最長肌組織，以及大白豬的皮下脂肪和背最長肌組織，并迅速置于-196 ℃液氮中保存?zhèn)溆?。操作過程均在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)機(jī)構(gòu)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)(institutional animal care and use committee，IACUC)(編號(hào)11-0085)的批準(zhǔn)下進(jìn)行。

試劑：Trizol、PrimerScriptTMRT reagent Kit等常規(guī)試劑均購自TaKaRa公司；瓊脂糖凝膠 DNA 回收試劑盒購自天根生化科技有限公司；大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞購自TransGen Biotech公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中豬HOXA5基因(NM_001195232.1)的mRNA序列信息，使用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)HOXA5基因克隆引物及實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，qRT-PCR)相關(guān)引物。HOXA5基因克隆引物序列：HOXA5-F1(5’-CGAGCCACAAATCAAGCA-3’)和HOXA5-R1(5’-ATTAGGGCAACGAGAACA-3’)，預(yù)期產(chǎn)物長度為971 bp，其中包含HOXA5基因813 bp 編碼區(qū)(coding sequence，CDS)序列。qRT-PCR 特異性引物序列：HOXA5-F2(5’-CAACATAGGCGGCCCTGAA-3’)，HOXA5-R2(5’-CGGAGAGGCAAAGAGCATGT-3’)，預(yù)期產(chǎn)物長度為143 bp；β-actin內(nèi)參基因引物序列：β-actin-F(5’-AGAGCAAGAGAGGCATCCTG-3’)，β-actin-R(5’-CACGCAGCTCGTTGTAGAAG-3’)，預(yù)期產(chǎn)物長度為111 bp。以上引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 HOXA5基因組織表達(dá)差異分析

采用Trizol法提取確山黑豬各組織和大白豬皮下脂肪和背最長肌的總RNA，使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的質(zhì)量，NanoDrop One分光光度計(jì)檢測總RNA濃度。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime Script RT Reagent Kit對(duì)總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以確山黑豬8種組織(心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、皮下脂肪、腹部脂肪和背最長肌)的cDNA為模板，β-actin為內(nèi)參基因，設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù)，檢測HOXA5基因在確山黑豬不同組織的相對(duì)表達(dá)量；以確山黑豬和大白豬的皮下脂肪和背最長肌的cDNA為模板，檢測HOXA5基因在確山黑豬和大白豬皮下脂肪和背最長肌的表達(dá)情況。qRT-PCR反應(yīng)體系為10 μL：cDNA 1 μL，上、下游引物各0.3 μL，2×SYBR Premix Ex Taq Mix 5 μL，ddH2O補(bǔ)足10 μL。qRT-PCR反應(yīng)程序：95 ℃，30 s；95 ℃，10 s；60 ℃，30 s；共40個(gè)循環(huán)；95 ℃，15 s；68 ℃，5 s；95 ℃ ，5 s。采用2-ΔΔCt法計(jì)算其相對(duì)表達(dá)量，然后采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

1.4 確山黑豬HOXA5基因克隆及測序

以確山黑豬皮下脂肪組織cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為50 μL：2×Phanta Max Buffer 25 μL，dNTP Mix 1 μL，Phanta Max Super-Fidlity DNA 1 μL，HOXA5-F1和HOXA5-R1各2 μL，cDNA 2.5 μL，ddH2O 16.5 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的瓊脂糖凝膠電泳，對(duì)目的條帶進(jìn)行純化回收，并與pMD19-T載體連接、轉(zhuǎn)化。挑取單克隆菌落，經(jīng)菌液PCR檢測鑒定正確后進(jìn)行測序。

1.5 確山黑豬HOXA5基因生物信息學(xué)分析

運(yùn)用NCBI數(shù)據(jù)庫和DNA Star Meg Align 7.1.0軟件將確山黑豬HOXA5基因CDS區(qū)序列與牛(NM_001077098.1)、綿羊(XM_015095103.2)、馬(XM_001499578.5)、雞(NM_001318419.1)、人(NM_019102.4)、小鼠(NM_010453.5)和黑猩猩(XM_519011.6)的CDS區(qū)序列進(jìn)行同源性對(duì)比并采用Mega 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；使用Expasy在線軟件中的ProtParam和ProtScale分別對(duì)HOXA5蛋白的理化性質(zhì)和親/疏水性進(jìn)行分析。利用DTU Health Tech在線軟件中的TMHMM和SignaIP分別預(yù)測HOXA5蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)以及信號(hào)肽。使用InterPro在線軟件分析HOXA5蛋白的結(jié)構(gòu)域。使用PSPRT Ⅱ Prediction在線軟件預(yù)測HOXA5蛋白亞細(xì)胞定位。使用SOPMA和SWISS-MODEL在線軟件分別預(yù)測HOXA5蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 HOXA5基因在確山黑豬各組織表達(dá)分析

利用qRT-PCR技術(shù)檢測HOXA5基因在確山黑豬不同組織中的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，HOXA5基因在確山黑豬各種組織中均有表達(dá)。其中，在肺臟中表達(dá)量最高，其次是肝臟和皮下脂肪，且顯著高于其他組織(P<0.05)(圖1)。

注：不同字母表達(dá)差異顯著(P<0.05)。

2.2 HOXA5基因在不同豬種的皮下脂肪和背最長肌中表達(dá)分析

為了進(jìn)一步探究HOXA5基因?qū)χ境练e的影響，利用qRT-PCR技術(shù)檢測并對(duì)比HOXA5基因在確山黑豬和大白豬的皮下脂肪和背最長肌中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，在皮下脂肪中確山黑豬HOXA5基因表達(dá)水平顯著高于大白豬(P<0.05)，而在背最長肌中2個(gè)豬種的HOXA5基因表達(dá)水平差異不顯著(P>0.05)(圖2)。

注：*，差異顯著(P<0.05)；ns，差異不顯著(P>0.05)。

2.3 確山黑豬HOXA5基因克隆及序列分析

以確山黑豬皮下脂肪組織cDNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到了1條片段大小為971 bp的特異性條帶(圖3)，與目的條帶結(jié)果一致。經(jīng)序列分析后發(fā)現(xiàn)，確山黑豬HOXA5基因的CDS區(qū)沒有發(fā)生堿基突變，與NCBI中豬HOXA5基因的CDS區(qū)序列完全一致。該CDS區(qū)全長813 bp，編碼270個(gè)氨基酸，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA，A、T、G和C分別占22.51%、13.90%、29.77%和33.82%(圖4)。

注：M，DL2000 DNA Marker；1，HOXA5基因PCR產(chǎn)物；2，陰性對(duì)照。

圖4 確山黑豬HOXA5基因CDS區(qū)和編碼氨基酸序列

2.4 確山黑豬HOXA5基因生物信息學(xué)分析

2.4.1 確山黑豬HOXA5基因序列同源性對(duì)比及進(jìn)化樹分析 通過DNA Star Meg Align進(jìn)行同源性對(duì)比分析，結(jié)果顯示確山黑豬HOXA5基因與人、雞、牛、馬、綿羊、小鼠和黑猩猩的同源性分別為97.4%、81.3%、99.1%、98.8%、99.0%、95.6%和97.8%，變異度分別為2.6%、17.4%、0.9%、1.2%、1.0%、4.6%和2.3%(圖5)。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示，確山黑豬HOXA5基因與牛、綿羊的親緣關(guān)系最近，其次為馬、人和黑猩猩，與雞親緣關(guān)系最遠(yuǎn)(圖6)，這表明HOXA5基因核苷酸序列在不同物種間的保守性較高。

圖5 確山黑豬與其他已知物種的HOXA5基因核苷酸序列比對(duì)

注：比例尺代表該單位長度下序列間差異數(shù)值為0.020；節(jié)點(diǎn)上數(shù)字表示bootstrape值。

2.4.2 確山黑豬HOXA5蛋白理化性質(zhì)分析 經(jīng)Prot Param預(yù)測分析可知，確山黑豬HOXA5蛋白總原子質(zhì)量為3 991，分子質(zhì)量為29.28 kD，分子式為C1262H1929N391O399S10，理論等電點(diǎn)(pI)為9.42。HOXA5蛋白共編碼20種氨基酸(表1)。其中，絲氨酸(Ser)含量最高，為14.4%；半胱氨酸(Cys)和色氨酸(Trp)最低，均為1.1%。HOXA5蛋白含強(qiáng)酸性氨基酸(Asp+Glu)23個(gè)，強(qiáng)堿性氨基酸(Arg+Lys)31個(gè)，總體偏堿性。經(jīng)預(yù)測HOXA5蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為65.30，為不穩(wěn)定蛋白。

表1 確山黑豬HOXA5蛋白的氨基酸組成

續(xù)表

2.4.3 確山黑豬HOXA5蛋白親/疏水性分析 使用ProtScale軟件對(duì)確山黑豬HOXA5蛋白進(jìn)行親/疏水性分析，結(jié)果如圖7所示。多肽鏈的第230位氨基酸的疏水分值最大，為1.778；第249位和250位氨基酸的疏水分值最小，為-2.967。綜合分析顯示，確山黑豬HOXA5蛋白共有34個(gè)疏水性氨基酸，228個(gè)親水性氨基酸，表明該蛋白屬于親水性蛋白。

圖7 確山黑豬HOXA5蛋白親/疏水性預(yù)測

2.4.4 確山黑豬HOXA5蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測及蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測 通過TMHMM軟件對(duì)確山黑豬HOXA5蛋白跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析，結(jié)果顯示HOXA5蛋白不包含跨膜結(jié)構(gòu)(圖8)；通過Signa IP軟件預(yù)測信號(hào)肽，結(jié)果顯示HOXA5蛋白沒有信號(hào)肽(圖9)。上述結(jié)果表明確山黑豬HOXA5蛋白不屬于跨膜蛋白和分泌蛋白。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，HOXA5蛋白定位在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞骨架中，其比例分別為91.3%、4.3%和4.3%，表明該蛋白主要位于細(xì)胞核內(nèi)。

圖8 確山黑豬HOXA5蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測

圖9 確山黑豬HOXA5蛋白信號(hào)肽預(yù)測

2.4.5 確山黑豬HOXA5蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測分析 通過SOPMA軟件對(duì)豬HOXA5蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測，確山黑豬HOXA5蛋白含有4種二級(jí)結(jié)構(gòu)，分別為α-螺旋(22.96%)、延伸鏈(11.48%)、β-轉(zhuǎn)角(4.81%)和無規(guī)則卷曲(60.74%)(圖10)。通過SWISS-MODEL軟件對(duì)HOXA5蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，并將確山黑豬HOXA5蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)與牛、雞、鼠和人的三級(jí)結(jié)構(gòu)比較發(fā)現(xiàn)，在不同物種中HOXA5蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)無明顯差異，且主要以無規(guī)則卷曲為主(圖11)。

圖10 確山黑豬HOXA5蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)

圖11 不同物種間HOXA5蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)

3 結(jié)論與討論

HOXA5基因在胚胎發(fā)育、器官形成和細(xì)胞命運(yùn)等生物過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用[17]。本研究結(jié)果顯示，HOXA5基因在確山黑豬心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、皮下脂肪、腹部脂肪和背最長肌8種組織中均有不同程度的表達(dá)，表明該基因在機(jī)體內(nèi)廣泛表達(dá)。其中，HOXA5基因在肺臟中表達(dá)量最高，且顯著高于其他組織。HOXA5基因?qū)Ψ闻K的發(fā)育和成熟發(fā)揮重要的作用。MANDEVILLE等[18]研究表明，HOXA5基因的缺失對(duì)肺部后天發(fā)育產(chǎn)生嚴(yán)重的影響。KRUMLAUF等[19]研究表明，在小鼠出生后HOXA5基因在肺臟中保持高表達(dá)水平，并且HOXA5基因的缺失會(huì)導(dǎo)致小鼠呈現(xiàn)肺臟異常，肺泡分隔不足和肺不擴(kuò)張等癥狀。此外有研究表明，HOXA5基因間接控制脂肪細(xì)胞中的信號(hào)因子調(diào)節(jié)脂肪代謝。GESTA等[10]研究表明，HOXA5基因的表達(dá)量與身體指數(shù)和腰臀比成正相關(guān)。CAO等[20]研究表明，HOXA5基因通過抑制 PKA/HSL通路促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化。FEI等[21]研究表明，HOXA5基因通過抑制小鼠白色脂肪細(xì)胞中的Akt/mTORC1信號(hào)通路來增加細(xì)胞凋亡。本研究中，HOXA5基因在肝臟、皮下脂肪及腹部脂肪等與脂肪代謝相關(guān)的組織中表達(dá)量較高。同時(shí)，為了進(jìn)一步研究HOXA5基因在確山黑豬脂肪沉積中的調(diào)控功能，本研究檢測了HOXA5基因在確山黑豬和大白豬皮下脂肪組織和背最長肌中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，HOXA5基因在脂肪沉積量高的確山黑豬皮下脂肪組織中的表達(dá)量顯著高于大白豬，推測HOXA5基因的高表達(dá)提高了確山黑豬脂肪沉積的能力。因此，HOXA5基因可作為調(diào)控豬脂肪沉積的重要候選基因，其具體作用及機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

本研究通過分子克隆技術(shù)對(duì)確山黑豬HOXA5基因進(jìn)行克隆測序，得到了確山黑豬HOXA5基因完整的CDS區(qū)序列，對(duì)其CDS區(qū)序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果顯示，確山黑豬HOXA5基因CDS區(qū)序列全長813 bp，編碼270個(gè)氨基酸。研究發(fā)現(xiàn)，確山黑豬HOXA5基因CDS區(qū)序列與Gen Bank中公布的豬HOXA5基因(NM_001195232.1)序列完全一致。王艷[22]研究表明，梅山豬和大白豬HOXA5基因CDS區(qū)序列與Gen Bank中豬的序列也完全一致，由此推測HOXA5基因在不同豬品種中高度保守。本研究進(jìn)一步對(duì)不同物種的HOXA5基因核苷酸序列進(jìn)行同源性對(duì)比，發(fā)現(xiàn)確山黑豬HOXA5基因與牛和羊同源性最高，與該基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果一致，這說明該基因在不同物種間具有高度保守性，在穩(wěn)定物種的遺傳性狀方面起到重要的調(diào)控作用。

確山黑豬HOXA5蛋白生物信息學(xué)分析顯示，確山黑豬HOXA5蛋白沒有信號(hào)肽序列同時(shí)不含跨膜區(qū)，表明該蛋白屬于不分泌蛋白且不參與信號(hào)傳導(dǎo)。本研究還發(fā)現(xiàn)在HOXA5蛋白中有許多親水性氨基酸，因而該蛋白也具有親水性，為不穩(wěn)定蛋白。蛋白質(zhì)的功能與其空間結(jié)構(gòu)有著密切的關(guān)系，HOXA5蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測分析，發(fā)現(xiàn)確山黑豬HOXA5蛋白主要由α-螺旋(22.96%)、延伸鏈(11.48%)、β-轉(zhuǎn)角(4.81%)和無規(guī)則卷曲(60.74%)組成，為混合型蛋白，且該蛋白以無規(guī)則卷曲為主，與其不穩(wěn)定蛋白的理化性質(zhì)相符。本研究通過生物信息學(xué)分析，深入研究了HOXA5基因的結(jié)構(gòu)和功能，不僅有利于揭示HOXA5基因在豬脂肪沉積方面的調(diào)控機(jī)制，同時(shí)也為確山黑豬品種的基因改良提供了理論基礎(chǔ)。