邱琪琪，王聰珂，張陽(yáng)，王夢(mèng)珂，趙特，周琳，汪梅子

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/河南省新型農(nóng)藥創(chuàng)制與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/河南省綠色農(nóng)藥創(chuàng)制工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450002)

液泡型ATP酶(vacuolar-type proton ATPase，V-ATP酶)定位在不同的膜中，能與離子通道和轉(zhuǎn)運(yùn)體結(jié)合維持適合所有真核細(xì)胞內(nèi)膜隔室生化功能的pH環(huán)境，并激活許多不同的傳輸過(guò)程[1]。維持pH穩(wěn)態(tài)對(duì)許多生理生化過(guò)程至關(guān)重要，包括細(xì)胞內(nèi)的膜運(yùn)輸、激素原處理和神經(jīng)遞質(zhì)運(yùn)輸，以及許多病毒進(jìn)入細(xì)胞等。V-ATP酶是多亞基復(fù)合酶，由胞質(zhì)內(nèi)介導(dǎo)ATP水解的V1結(jié)構(gòu)域和結(jié)合在膜上介導(dǎo)質(zhì)子轉(zhuǎn)移的V0結(jié)構(gòu)域組成[2]。外周V1結(jié)構(gòu)域包含至少8種分子質(zhì)量為13～70 kD的不同亞基(亞基A～H)，V0結(jié)構(gòu)域包含6個(gè)分子質(zhì)量17～100 kD的不同亞基(亞基a、c、c’、c”、d和e)[3]。V-ATP酶具有高度保守性，在真核細(xì)胞中通常位于質(zhì)膜或酸性細(xì)胞器的膜中[4]。在許多昆蟲(chóng)的上皮細(xì)胞中，V-ATP酶分子大量存在于頂膜中產(chǎn)生一個(gè)電化學(xué)質(zhì)子梯度，用于細(xì)胞外空間的酸化或堿化、離子和液體的分泌或重吸收、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的輸入、以及各種其他細(xì)胞活動(dòng)[5]。

昆蟲(chóng)中活躍的跨上皮陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)最初是在馬氏管中被發(fā)現(xiàn)的，隨后也在其他上皮中發(fā)現(xiàn)，如唾液腺、唇腺、中腸和感覺(jué)器，參與調(diào)節(jié)pH穩(wěn)態(tài)[6]。昆蟲(chóng)的馬氏管是排泄器官，作為運(yùn)輸組織當(dāng)受到刺激時(shí)可以用比任何其他已知組織都要高的速度運(yùn)輸水和離子，這是由位于管腔細(xì)胞膜上的V-ATP酶驅(qū)動(dòng)的[7]。V-ATP酶在昆蟲(chóng)其它組織中可能還發(fā)揮著其它重要作用。在黑腹果蠅Drosophilamelanogaster體內(nèi)，位于復(fù)眼光感受器的V-ATP酶對(duì)兩類板間神經(jīng)元L1和L2的大小和形狀進(jìn)行了晝夜節(jié)律的周期性調(diào)節(jié)[8]。除此之外，V-ATP酶很可能參與了一部分信號(hào)通路的運(yùn)行。在果蠅中，V-ATP酶不僅可以促進(jìn)溶酶體中Notch配體的降解，而且促進(jìn)核內(nèi)體中Notch信號(hào)的激活[9]。在經(jīng)過(guò)siRNAs靶向V-ATP酶的2個(gè)亞基(ATP6V1C2和ATP6V0C)處理的細(xì)胞中，Wnt信號(hào)通路的受體LRP6的磷酸化被抑制，這些結(jié)果表明Wnt信號(hào)通路的激活需要V-ATP酶的活性[10]。因其重要性，V-ATP酶被看作害蟲(chóng)防治的潛在分子靶標(biāo)。

草地貪夜蛾屬于世界性重大農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)，目前已有100多個(gè)國(guó)家受到了嚴(yán)重危害。草地貪夜蛾具有寄主范圍廣泛、多蟲(chóng)態(tài)共存、遷飛速度快、繁殖能力強(qiáng)和抗藥性強(qiáng)等特點(diǎn)[11-12]。中國(guó)玉米種植廣泛，草地貪夜蛾可能隨著氣候變遷及玉米播種時(shí)期不同進(jìn)行遷移危害[13]。為探索草地貪夜蛾V-ATP酶V1結(jié)構(gòu)域E、F、G和H亞基對(duì)草地貪夜蛾生長(zhǎng)發(fā)育的影響，本研究采用PCR技術(shù)克隆了草地貪夜蛾V-ATP酶V1結(jié)構(gòu)域的4個(gè)亞基(E～H)基因序列，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)測(cè)定了其在草地貪夜蛾不同發(fā)育階段的表達(dá)動(dòng)態(tài)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試?yán)ハx(chóng)：草地貪夜蛾在溫度(26 ± 1)℃、光照周期L/D=14 h/10 h、相對(duì)濕度60%～85%的室內(nèi)條件下人工飼養(yǎng)。幼蟲(chóng)飼料的主要成分為玉米粉及玉米葉粉，成蟲(chóng)用10%蜂蜜水補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)。

試劑：TRIzol試劑，美國(guó)Invitrogen公司；2×Es Taq Master Mix、大腸桿菌EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司；質(zhì)粒DNA提取試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；DNA凝膠回收試劑盒、PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit，日本TaKaRa公司；PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

儀器：DYY-6C電泳儀，北京六一儀器廠；In-GeniusLHR凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)Syngene公司；QuantStudio 3 Real-Time PCR System，美國(guó)ABI公司。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取與cDNA合成 收集草地貪夜蛾卵、1～6齡整頭幼蟲(chóng)、雌蛹、雄蛹、雌成蟲(chóng)、雄成蟲(chóng)備用，每個(gè)時(shí)期1個(gè)生物學(xué)重復(fù),所用的草地貪夜蛾數(shù)量分別為卵100粒，1齡40頭，2齡30頭，3齡15頭，4齡、5齡各5頭，6齡、雌雄蛹和雌雄成蟲(chóng)各3頭。所有樣品均設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)。采用Trirol法提取各個(gè)齡期的RNA，取用適量RNA分別檢測(cè)濃度，并通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)是否降解，剩余放置在-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。cDNA模板的合成參考PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.2 RT-PCR反應(yīng) 從草地貪夜蛾轉(zhuǎn)錄組中獲得V-ATP酶亞基的核苷酸序列，利用Primer Pre-mier 6.0軟件設(shè)計(jì)出V-ATP酶V1結(jié)構(gòu)域E、F、G和H亞基基因的4對(duì)引物(表1)。PCR采用50 μL體系：1.1×T3 Super PCR Mix 44 μL，10 μmol·L-1正向引物和反向引物各2 μL，cDNA模板2 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸20 s，30個(gè)循環(huán)； 72 ℃延伸2 min；4 ℃保存。根據(jù)凝膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)回收純化PCR產(chǎn)物，將收集得到的PCR產(chǎn)物按照pClone007 Versatile Simple Vector Kit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行目的片段連接，隨后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆并提取質(zhì)粒DNA測(cè)序。引物合成及測(cè)序工作均委托鄭州擎科生物有限公司完成。

表1 RT-PCR及qRT-PCR反應(yīng)所用引物序列

1.2.3 序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建 對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析拼接后獲得全長(zhǎng)序列。使用NCBI的BLAST程序?qū)-ATP酶E～H亞基基因在不同物種間的同源性進(jìn)行對(duì)比分析；用DNAMAN軟件分析各個(gè)亞基基因的一致性；用MEGA X軟件分析各個(gè)亞基與其他物種之間的進(jìn)化關(guān)系；利用在線軟件ExPASy-ProtParam tool進(jìn)行各個(gè)亞基分子量、等電點(diǎn)等理化性質(zhì)的分析；利用在線軟件ExPASy-ProtScale tool進(jìn)行各個(gè)亞基蛋白質(zhì)的親水性和疏水性分析。利用Pfam在線預(yù)測(cè)軟件(http://pfam.janelia.org/search)對(duì)各個(gè)亞基蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析。

1.2.4 熒光定量RT-PCR分析 根據(jù)河南省新型農(nóng)藥創(chuàng)制與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室已克隆出的草地貪夜蛾V-ATP酶E～H 4個(gè)亞基基因的序列全長(zhǎng)設(shè)計(jì)出符合要求的4對(duì)特異性引物(表1)。為了消除樣本量差異，以GAPDH基因作為內(nèi)參基因[14]。

熒光定量PCR采用20 μL體系，各反應(yīng)成分的含量為：PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix (2X) 10 μL，10 μmoL·L-1的正向和反向引物各2 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 5 μL。反應(yīng)條件為：50 ℃ 2 min，95 ℃2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)；溶解曲線95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，0.15 ℃·s-1升溫至95 ℃持續(xù)15 s。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù)，反應(yīng)結(jié)束后收集Ct值。采用2-△△Ct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，以表達(dá)量最低的樣品為基準(zhǔn)進(jìn)行定量分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，應(yīng)用HSD法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 核苷酸序列分析

通過(guò)特異性引物PCR擴(kuò)增出編碼草地貪夜蛾V-ATP酶V1結(jié)構(gòu)域E～H 4個(gè)亞基的開(kāi)放閱讀框。E亞基的開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度為681 bp，編碼226個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子質(zhì)量和等電點(diǎn)分別為55.5 kD和5.11，GenBank登錄號(hào)為MT707618。E亞基基因編碼的蛋白不穩(wěn)定指數(shù)為40.97，屬不穩(wěn)定蛋白，蛋白親疏水性預(yù)測(cè)顯示為親水性。該蛋白僅有一個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，即位于18～216的V-ATP酶E亞基結(jié)構(gòu)域(圖1)。

注：黑色表示高度保守的氨基酸，圖2～4同。序列上方橫線標(biāo)注的是保守結(jié)構(gòu)域：V-ATP酶E亞基結(jié)構(gòu)域(FIE至ALF)。草地貪夜蛾：MT707618；斜紋夜蛾：XP_022815239.1；棉鈴蟲(chóng)：XP_021191658.1；粉紋夜蛾：XP_026735678.1；家蠶：NP_001040451.1；夏威夷紅蛺蝶：XP_026497418.1；野桑蠶：XP_028025362.1；煙草天蛾：XP_030031453.1；亞洲玉米螟：XP_028179329.1。

F亞基開(kāi)放閱讀框序列長(zhǎng)375 bp，編碼124個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子質(zhì)量和等電點(diǎn)分別為30.8 kD和5.24，GenBank登錄號(hào)為MT707619。F亞基基因編碼的蛋白不穩(wěn)定指數(shù)為53.33，屬不穩(wěn)定蛋白，蛋白親疏水性預(yù)測(cè)顯示為親水性。該蛋白僅有一個(gè)位于12～113的V-ATP酶F亞基的保守結(jié)構(gòu)域(圖2)。

注：序列上方橫線標(biāo)注的是保守結(jié)構(gòu)域：V-ATP酶F亞基結(jié)構(gòu)域(ISV至LRR)。草地貪夜蛾：MT707619；斜紋夜蛾：XP_022825205.1；偏瞳蔽眼蝶：XP_023948003.1；夏威夷紅蛺蝶：XP_026496172.1；家蠶：NP_001040448.1；臍橙螟：XP_013184521.1；粉紋夜蛾：XP_026737139.1；玉帶鳳蝶：NP_001298649.1；亞洲玉米螟：XP_028157779.1。

G亞基基因開(kāi)放閱讀框序列長(zhǎng)354 bp，編碼117個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子質(zhì)量和等電點(diǎn)分別為27.7 kD和5.26，GenBank登錄號(hào)為MT707620。G亞基基因編碼的蛋白不穩(wěn)定指數(shù)為44.68，屬不穩(wěn)定蛋白，蛋白親疏水性預(yù)測(cè)顯示為親水性。該蛋白僅有一個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，即位于3～107的V-ATP酶G亞基結(jié)構(gòu)域(圖3)。

注：序列上方橫線標(biāo)注的是保守結(jié)構(gòu)域：V-ATP酶G亞基結(jié)構(gòu)域(SQT至DIK)。草地貪夜蛾：MT707620；斜紋夜蛾：XP_022818379.1；棉鈴蟲(chóng)：XP_021188551.1；亞洲玉米螟：XP_028164911.1；夏威夷紅蛺蝶：XP_026494470.1；柑橘鳳蝶：NP_001299749.1；家蠶：NP_001040287.1；阿芬眼蝶：XP_034825880.1；野桑蠶：XP_023934297.1。

H亞基基因開(kāi)放閱讀框序列長(zhǎng)1 452 bp，編碼483個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子質(zhì)量和等電點(diǎn)分別為118.2 kD和4.96，GenBank登錄號(hào)為MT707621。H亞基基因編碼的蛋白不穩(wěn)定指數(shù)為41.01，屬不穩(wěn)定蛋白，蛋白親疏水性預(yù)測(cè)顯示為親水性。H亞基蛋白具有2個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，分別是位于28～328和334～450的V-ATP酶F亞基N端結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域(圖4)。

注：序列上方橫線標(biāo)注的是保守結(jié)構(gòu)域：N端結(jié)構(gòu)域(VLQ至ERL)和C端結(jié)構(gòu)域(LSS至RNW)。草地貪夜蛾：MT707621；斜紋夜蛾：XP_022822595.1；粉紋夜蛾：XP_026726220.1；煙草天蛾：XP_030040379.1；大蠟螟：XP_026756478.1；家蠶NP_001040488.1；亞洲玉米螟：XP_028168669.1；夏威夷紅蛺蝶：XP_026497418.1；柑橘鳳蝶：XP_013180033.1；菜粉蝶：XP_022129728.1。

2.2 氨基酸序列同源性分析

草地貪夜蛾V-ATP酶E亞基與其他8種昆蟲(chóng)E亞基的氨基酸序列同源性分析結(jié)果顯示，草地貪夜蛾V-ATP酶E亞基與斜紋夜蛾S.litura和棉鈴蟲(chóng)H.armigera的V-ATP酶E亞基氨基酸同源性分別為97.8%和91.6%。通過(guò)多重序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)不同物種間該基因編碼氨基酸序列的差異少且分散。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果顯示(圖5)，草地貪夜蛾與斜紋夜蛾、棉鈴蟲(chóng)聚集在同一進(jìn)化分支上，有較高同源性。

圖5 不同物種間V-ATP酶E亞基系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)

草地貪夜蛾V-ATP酶F亞基與其他8種昆蟲(chóng)F亞基的氨基酸序列同源性分析結(jié)果顯示，草地貪夜蛾V-ATP酶F亞基與斜紋夜蛾的V-ATP酶F亞基氨基酸源性高達(dá)98.4%。通過(guò)多重序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)不同物種間該基因編碼氨基酸序列的差異不明顯。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果顯示(圖6)，草地貪夜蛾與斜紋夜蛾聚集在同一進(jìn)化分支上，有較高同源性。

圖6 不同物種間V-ATP酶F亞基系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)

草地貪夜蛾V-ATP酶G亞基與其他8種昆蟲(chóng)G亞基的氨基酸序列同源性分析結(jié)果顯示，草地貪夜蛾V-ATP酶G亞基與斜紋夜蛾、棉鈴蟲(chóng)的V-ATP酶G亞基氨基酸同源性高達(dá)99.1%、96.6%。通過(guò)多重序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)不同物種間該基因編碼氨基酸序列前70位完全保守，差異主要存在于中間80～100位。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果顯示(圖7)，草地貪夜蛾與斜紋夜蛾、棉鈴蟲(chóng)聚集在同一進(jìn)化分支上，有較高同源性。

圖7 不同物種間V-ATP酶G亞基系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)

草地貪夜蛾V-ATP酶H亞基與其他8種昆蟲(chóng)H亞基的氨基酸序列同源性分析結(jié)果顯示，草地貪夜蛾V-ATP酶H亞基與斜紋夜蛾的V-ATP酶H亞基氨基酸同源性高達(dá)96.8%。通過(guò)多重序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)不同物種間該基因編碼氨基酸序列的差異少且分散。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果顯示(圖8)，草地貪夜蛾與斜紋夜蛾聚集在同一進(jìn)化分支上，有較高同源性。

圖8 不同物種間V-ATP酶H亞基系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)

2.3 草地貪夜蛾不同發(fā)育階段V-ATP酶E～H亞基表達(dá)量分析

V-ATP酶E亞基基因在草地貪夜蛾整個(gè)發(fā)育階段均有表達(dá)(圖9)。其中在雄蛹中表達(dá)量最低，在雄成蟲(chóng)中高量表達(dá)，為雄蛹的12.44倍。另外，在1齡幼蟲(chóng)、4齡幼蟲(chóng)和雌性成蟲(chóng)中都有較高量的表達(dá)，這三者之間無(wú)顯著差異。在雌蛹中表達(dá)量為雄蛹的1.27倍，兩者無(wú)顯著差異，均處于低水平。不同發(fā)育階段中的相對(duì)表達(dá)量由高到低依次為雄成蟲(chóng)>1齡幼蟲(chóng)>6齡幼蟲(chóng)>4齡幼蟲(chóng)>2齡幼蟲(chóng)>雌成蟲(chóng)>3齡幼蟲(chóng)>5齡幼蟲(chóng)>卵>雌蛹>雄蛹。

注：數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。不同字母表示經(jīng)HSD法檢驗(yàn)在P<0.05水平差異顯著。下同。

以表達(dá)量最低的雌蛹作為對(duì)照，草地貪夜蛾體內(nèi)V-ATP酶F亞基基因的表達(dá)量在不同齡期存在差異(圖10)。V-ATP酶F亞基基因在卵至3齡幼蟲(chóng)的表達(dá)量為雌蛹表達(dá)量的2.46～3.01倍之間，上下浮動(dòng)不明顯，無(wú)顯著差異。從5齡開(kāi)始表達(dá)量逐漸升高，直至6齡時(shí)期達(dá)到頂峰，為雌蛹表達(dá)量的6.82倍。雄蛹表達(dá)量明顯高于雌蛹，兩者之間差異顯著。不同發(fā)育階段中的相對(duì)表達(dá)量由高到低依次為6齡幼蟲(chóng)>雄成蟲(chóng)>雄蛹>5齡幼蟲(chóng)>雌成蟲(chóng)>卵>1齡幼蟲(chóng)>3齡幼蟲(chóng)>2齡幼蟲(chóng)>4齡幼蟲(chóng)>雌蛹。

圖10 V-ATP酶F亞基基因在草地貪夜蛾不同發(fā)育階段的相對(duì)表達(dá)量

以表達(dá)量最低的雌蛹作為對(duì)照，對(duì)草地貪夜蛾不同發(fā)育階段V-ATP酶G亞基基因的表達(dá)量進(jìn)行分析(圖11)。其中,在雄成蟲(chóng)中的表達(dá)量顯著高于其他齡期，為雌蛹的18.28倍；在6齡幼蟲(chóng)中表達(dá)量也較高，為雌蛹的9.42倍。不同發(fā)育階段中的相對(duì)表達(dá)量由高到低依次為雄成蟲(chóng)>6齡幼蟲(chóng)>1齡幼蟲(chóng)>雌成蟲(chóng)>3齡幼蟲(chóng)>2齡幼蟲(chóng)>5齡幼蟲(chóng)>4齡幼蟲(chóng)>卵>雄蛹>雌蛹。以表達(dá)量最低的雌蛹作為對(duì)照，草地貪夜蛾體內(nèi)V-ATP酶H亞基基因的表達(dá)量在不同發(fā)育階段存在差異(圖12)。H亞基基因在卵和雄蛹中的表達(dá)量低于與其他齡期中的表達(dá)量，分別為雌蛹的2.22和2.26倍。雄成蟲(chóng)中H亞基基因的表達(dá)量明顯高于其他齡期，為雌蛹表達(dá)量21.77倍，且與其他齡期表達(dá)量相比差異顯著。幼蟲(chóng)期1齡至6齡的表達(dá)量之間均無(wú)顯著差異。不同發(fā)育階段中的相對(duì)表達(dá)量由高到低依次為雄成蟲(chóng)>6齡幼蟲(chóng)>雌成蟲(chóng)>3齡幼蟲(chóng)>1齡幼蟲(chóng)>4齡幼蟲(chóng)>2齡幼蟲(chóng)>5齡幼蟲(chóng)>雄蛹>卵>雌蛹。

圖11 V-ATP酶G亞基基因在草地貪夜蛾不同發(fā)育階段的相對(duì)表達(dá)量

圖12 V-ATP酶H亞基基因在草地貪夜蛾不同發(fā)育階段的相對(duì)表達(dá)量

3 討論

V-ATP酶的V1結(jié)構(gòu)域被劃分為幾個(gè)子域：A3B3柱體、中心莖和外圍莖，該結(jié)構(gòu)域主要功能是水解ATP[15]。單一拷貝的F亞基通過(guò)其C端與D亞基結(jié)合從而組成中心莖，并且起到連接V1和V0結(jié)構(gòu)域的作用[16]。外圍莖由C、E、G、H亞基在中心莖外包裹形成。研究表明，H亞基可以在V-ATP酶V1和V0結(jié)構(gòu)域的可逆解離過(guò)程中抑制V1結(jié)構(gòu)域的催化活性[17]。昆蟲(chóng)的V-ATP酶亞基功能的研究主要依靠RNAi的方式進(jìn)行，V-ATP酶的敲除對(duì)多種物種均有致死作用[18-20]。除此之外，V-ATP酶亞基的RNAi還會(huì)導(dǎo)致多種發(fā)育異常，如玉米蠟蟬(Peregrinusmaidis)的繁殖力降低和卵母細(xì)胞形成異常以及西方蜜蜂(Apismellifera)化蛹失敗[21-22]。因此，V-ATP酶V1結(jié)構(gòu)域的各個(gè)亞基很可能在昆蟲(chóng)的各種生理生化過(guò)程中承擔(dān)著各不相同的重要責(zé)任。

本研究從草地貪夜蛾中成功克隆獲得了V-ATP酶的E、F、G和H亞基基因。多序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的分析表明草地貪夜蛾中的V-ATP酶E～H亞基與其他物種的V-ATP酶E～H亞基具有極高的同源性。不同發(fā)育階段V-ATP酶E～H亞基表達(dá)量分析結(jié)果表明，V-ATP酶E～H 4個(gè)亞基在草地貪夜蛾整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育期均有表達(dá)，且都表現(xiàn)出在雄成蟲(chóng)中高量表達(dá)的特點(diǎn)。有研究表明，V-ATP酶在雄性灰翅夜蛾Spodopteramauritia輸精管上皮細(xì)胞中參與調(diào)節(jié)管腔酸堿環(huán)境以維持精子正常發(fā)育[23]。V-ATP酶維持精子健康發(fā)育環(huán)境的功能不僅在昆蟲(chóng)中被發(fā)現(xiàn)，在哺乳動(dòng)物、線蟲(chóng)中也得到了證實(shí)[24-25]。研究發(fā)現(xiàn)，桔小實(shí)蠅雄蟲(chóng)生殖節(jié)中的G亞基mRNA含量是雌蟲(chóng)生殖節(jié)中的6.04倍[26]，也可以為此結(jié)果提供論據(jù)。E～H亞基在卵期和蛹期均表現(xiàn)為低量的表達(dá)，其原因在于處于這2個(gè)時(shí)期的個(gè)體飛行、進(jìn)食等生命活動(dòng)均不再進(jìn)行，V-ATP酶只需維持低量運(yùn)轉(zhuǎn)就可以為孵化和羽化積蓄力量[27]。除此之外，個(gè)別亞基在6齡幼蟲(chóng)中也表現(xiàn)出較高的表達(dá)量，其中F和G亞基最為明顯。6齡時(shí)期處于幼蟲(chóng)階段末期，此時(shí)即將進(jìn)入預(yù)蛹期各項(xiàng)生命活動(dòng)都會(huì)降低，而F和G亞基卻表現(xiàn)出較高的表達(dá)量，表明這2個(gè)亞基可能與化蛹相關(guān)。綜上所述，V-ATP酶E、F、G和H均在昆蟲(chóng)的各種生理生化過(guò)程中承擔(dān)著不可或缺的責(zé)任。

目前，V-ATP酶在昆蟲(chóng)的研究方向上還有許多空白，其與昆蟲(chóng)生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖相關(guān)的調(diào)控機(jī)制尚需進(jìn)一步明確。下一步擬將該V-ATP酶作為新型農(nóng)藥研發(fā)的候選靶標(biāo)，通過(guò)深入了解V-ATP酶的作用方式，篩選出合理的作用靶點(diǎn)或開(kāi)發(fā)相應(yīng)的抑制劑，從而建立創(chuàng)新型農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)研究和防治手段。