孫佳平，張福順，邳 植，周 芹

（1黑龍江大學中俄聯合研究生院，哈爾濱 150080；2黑龍江大學生命科學學院黑龍江省寒地生態(tài)修復與資源利用重點實驗室，哈爾濱 150080；3黑龍江大學現代農業(yè)與生態(tài)環(huán)境學院，哈爾濱 150080；4農業(yè)農村部甜菜品質監(jiān)督檢驗測試中心，哈爾濱 150080）

0 引言

甜菜(Beta vulgaris L.)屬莧科，甜菜屬，二年生草本植物，別名菾菜、紅菾菜[1]。甜菜具有耐寒、耐旱、耐鹽堿等特點，是一種適應性廣、抗逆性強的作物[2]。甜菜是一種經濟作物，在糖業(yè)生產中占有重要作用，是世界乃至中國重要的糖料作物之一，甜菜制糖的產量約占世界食用糖總產量的20%，約占中國食用糖總產量的10%～20%[3-4]。甜菜在國民經濟生產中占有重要的地位，除用于制糖外，甜菜制糖的副產品也具有較高的綜合利用價值。甜菜屬于北方冷涼作物，能夠生長在氣溫較低的高緯度地區(qū)[5]。甜菜適宜生長的溫度范圍大約是17～25℃，世界主要甜菜栽培區(qū)位于45°N附近的氣候溫和地區(qū)。在甜菜種植生產的過程中，不同類型以及不同程度的逆境脅迫，都會對甜菜的生長發(fā)育帶來不利的影響。低溫脅迫對農作物影響尤為嚴重，已成為世界各國農作物栽培中普遍存在的問題[6-8]。尤其全球溫室效應愈發(fā)嚴重，引起自然環(huán)境惡化，極冷天氣極易產生，對甜菜種子萌發(fā)期、幼苗期乃至生長期都會產生不利的影響，受到的低溫傷害可能影響植物后續(xù)的生長發(fā)育，進而影響甜菜的產質量[9]，限制中國甜菜產業(yè)穩(wěn)步發(fā)展[10-11]，因此，研究甜菜低溫冷害具有必要性和時效性。植物在非脅迫狀態(tài)下，體內ROS的產生與釋放是屬于一個動態(tài)平衡的狀態(tài)，不會對植物體的新陳代謝產生影響。當受到低溫脅迫時，植物體內的這種平衡被打破，導致ROS的大量積累，ROS的特點是具有極強的氧化性，導致細胞膜發(fā)生膜脂過氧化反應，從而使細胞受到破壞[12]。

丙二醛屬于細胞膜脂過氧化的分解產物，可表示植物受損害的程度，因此植物丙二醛含量是反映植物對低溫脅迫耐受能力的主要生理指標[13]。低溫脅迫下，植株受到逆境影響，會啟動一系列響應機制來應對低溫環(huán)境[14]。植物體內的抗氧化系統(tǒng)分為酶促防御系統(tǒng)和非酶促防御系統(tǒng)，在酶促防御系統(tǒng)中，SOD、POD、APX、CAT是研究最多的幾種酶，這4種酶被稱為細胞保護酶系統(tǒng)[15]，其活性的強弱可反映植物的抗寒能力?？寡趸冈谥仓陸鸬蜏孛{迫中起著重要作用，植物通過增加抗氧化酶的活性來清除ROS的積累防止細胞膜脂過氧化，保護細胞膜系統(tǒng)，因此抗氧化酶的活性可以作為衡量植物抗逆性的重要指標[16-17]。低溫脅迫下玉米、茶樹以及煙草的抗氧化系統(tǒng)的變化研究的較多，目前低溫脅迫對甜菜的研究雖有報道，但是國內的科學研究者對低溫脅迫甜菜生理生化響應的研究卻很少，有待進一步研究[18-20]，因此，本文以甜菜品種‘KWS9147’為實驗材料，測定低溫脅迫下(4℃)甜菜幼苗中MDA含量和抗氧化系統(tǒng)酶(T-AOC、SOD、POD、APX、CAT)活性的變化，探討甜菜抵在低溫脅迫下生理指標的變化及響應低溫脅迫的生理機制，完善甜菜抗寒生理機制，并為其他植物抗寒機制提供理論依據，對提高甜菜產質量具有重要意義[21-23]。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用甜菜品種為‘KWS9147’，購自德國KWS種子股份有限公司。

實驗在黑龍江大學現代農業(yè)與生態(tài)環(huán)境學院甜菜品質監(jiān)督檢驗測試中心一樓光照培養(yǎng)室，于2021年3月—4月進行。

1.2 實驗設計

該實驗采用水培方式，甜菜種子從播種到可供實驗處理共分為以下3個階段。

發(fā)芽：選取籽粒飽滿、均勻一致的甜菜種子播種于滅菌消毒的蛭石基質的塑料盆中（規(guī)格為長20 cm、寬14 cm、高7 cm），放入光照培養(yǎng)室培養(yǎng)一周，等待其長出兩片子葉。

移苗：挑選出生長均勻且無病害的甜菜幼苗用蒸餾水反復洗凈后移入帶有圓孔的泡沫板上（每板8孔，每孔兩株），在黑色避光玻璃槽（規(guī)格為長36 cm、寬14.5 cm、高15 cm）用1倍的營養(yǎng)液進行培養(yǎng)，通入空氣。

間苗：為保證幼苗有足夠的生長空間與營養(yǎng)面積，待其長出兩片真葉后，拔除生長柔弱、畸形的苗，留下大小一致、優(yōu)良的甜菜幼苗繼續(xù)水培，每孔僅保留一株，以促進幼苗健壯生長。

在水培第10天和第20天換一次營養(yǎng)液，保證植物汲取到足夠的養(yǎng)分，期間進行正常的苗期管理。從移苗開始將甜菜幼苗置于光照培養(yǎng)室培養(yǎng)21天后，選取大小一致、生長正常健碩、無病蟲害的甜菜放入人工氣候培養(yǎng)箱中，設置3個重復，每個重復8株，進行低溫脅迫處理。

實驗設置由風冷低溫培養(yǎng)箱進行4℃低溫脅迫處理(L)，以光照培養(yǎng)室中正常生長的甜菜幼苗為對照(CK)。培養(yǎng)室溫度設置為晝25℃，夜20℃；光周期為晝14 h，夜10 h；光照強度為140 μmol/(m2·s)。在低溫脅迫1天后，室溫生長幼苗和低溫脅迫幼苗同時取樣，采集生長部位相同的成熟葉片剪碎，用電子天平精確稱取0.10 g，用錫紙包好樣品放入液氮中進行速凍處理，后轉移入-80℃冰箱進行超低溫保存，用于后續(xù)生理生化指標的測定，每個處理3次重復。

1.3 指標測定及方法

1.3.1 MDA含量的測定 MDA用鮮樣測量，采用硫代巴比妥酸法，參考Heath的方法進行測定[24]，結果以μmol/g FW來表示。

1.3.2 抗氧化能力指標的測定 T-AOC[25]、SOD[26-27]、POD[28-29]、APX[30-31]、CAT[32-33]的測定，采用北京索萊寶科技有限公司測定試劑盒，用紫外分光光度法進行測量，所有指標均3次重復，實際操作步驟可以參照試劑盒內的說明書，各種酶活性均以U/g FW來表示。

1.4 數據處理

所有實驗數據采用測定的平均值表示，借助Microsoft Excel 2010軟件進行實驗數據的整理、統(tǒng)計與圖表制作，借助IBM SPSS Statistics 26軟件對實驗數據采用獨立樣本T檢驗，采用最小顯著差異法(LSD)進行顯著性檢驗，檢驗低溫處理前后各生理指標是否存在顯著差異，P＜0.05代表差異顯著。

2 結果與分析

2.1 低溫脅迫對甜菜植株表型的影響

低溫脅迫會引起植物形態(tài)發(fā)生一定的變化，不同的低溫脅迫條件引起的變化有一定差異，低溫脅迫的溫度條件和時間條件都是引起這種差異的主要原因[34]。低溫往往導致植物生長發(fā)育緩慢，受過低溫脅迫的植株生長矮小，地上部位的變化研究較多，其中植物莖的高度、葉片的形狀特征、葉片的顏色變化很為明顯，地下部位（根系）的變化研究較少。葉柄是植物進行光合作用、輸導和貯存營養(yǎng)物質的重要器官，在低溫脅迫下，葉柄的生長發(fā)育受到影響，通常表現為株高降低，這也是植物為了應對低溫條件預防葉柄結冰的一種應對策略[35-37]。葉片是甜菜直接暴露在空氣中的器官，對溫度的變化最為敏感，也是直接能體現溫度對甜菜帶來的影響，主要體現在葉片的形狀上，低溫使甜菜葉片中的細胞結構受到破壞，細胞受損，不能進行正常的新陳代謝，細胞缺水，表現為葉片萎蔫，卷曲，葉寬及葉長縮短[38]。同時，低溫脅迫會抑制植物的光合作用，抑制葉綠素的形成，加快葉綠素的降解，從而使植物葉片變黃，具體見圖1。4℃低溫脅迫下，葉片輕度受害，葉柄由直立變成輕斜，葉片出現了由于缺水而導致輕微程度的萎蔫、卷曲，葉片大小無明顯變化。

圖1 低溫脅迫對甜菜形態(tài)特征的影響

2.2 低溫脅迫對甜菜葉片MDA含量的影響

MDA是細胞膜脂過氧化的最終產物[39]，MDA的大量積累會損害細胞膜，使細胞膜的通透性增加，功能喪失。MDA作為細胞膜氧化受損的指標之一，在一定程度上可以反映植物在逆境脅迫下受損害的程度，其含量高低與植物抗寒性強弱呈負相關[40]。低溫脅迫會使細胞膜脂發(fā)生過氧化反應，低溫脅迫對甜菜葉片MDA含量的影響見圖2，低溫脅迫會使甜菜葉片中的MDA含量上升，L組與CK組相比，差異顯著(P＜0.05)，低溫脅迫1天后，MDA含量升高幅度達到31.32%。

圖2 低溫脅迫對甜菜葉片MDA含量的影響

2.3 低溫脅迫對甜菜葉片T-AOC的影響

T-AOC是衡量抗氧化系統(tǒng)功能的綜合指標。其大小可以代表抗氧化酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)的性能，一般反映防御系統(tǒng)的抗氧化能力高低。測定T-AOC反映植物防御系統(tǒng)受低溫的影響狀況[41]。低溫脅迫對甜菜葉片T-AOC的影響見圖3，圖3表明，低溫脅迫會使甜菜葉片中的T-AOC上升，L組與CK組相比，差異顯著(P＜0.05)，低溫脅迫1天后，T-AOC升高幅度達到10.74%。

圖3 低溫脅迫對甜菜葉片T-AOC的影響

2.4 低溫脅迫對甜菜葉片抗氧化酶活性的影響

在低溫脅迫下，植物甜菜體內的抗氧化酶活性發(fā)生改變，這有助于植物清除ROS。SOD是一種在植物體內廣泛分布的金屬酶，是在逆境下，植物體內ROS的重要清除劑，可使ROS發(fā)生歧化作用，分解為H2O2和O2，對生物的抗氧化性起著重要的作用。低溫脅迫對甜菜葉片中SOD的影響見圖4B，低溫脅迫使甜菜葉片中的SOD上升，L組與CK組相比，差異非常顯著(P＜0.05)，低溫脅迫1天后，SOD升高幅度達到4倍之多，在一定程度上可以消除或減少低溫脅迫引起的活性氧自由基的積累，從而有效緩解甜菜的低溫損傷。

POD可催化過氧化氫氧化酚類和胺類化合物，具有消除過氧化氫和酚類、胺類毒性的雙重作用。低溫脅迫對甜菜葉片中POD的影響見圖4B，低溫脅迫會使甜菜葉片中的POD上升，L組與CK組相比，差異也非常明顯顯著(P＜0.05)，低溫脅迫1天后，POD升高幅度達到2.22倍。

APX催化H2O2氧化AsA，是植物AsA的主要消耗者。低溫脅迫對甜菜葉片中的APX的影響見圖4C，低溫脅迫會使甜菜葉片中的APX上升，L組與CK組相比，差異顯著(P＜0.05)，低溫脅迫1天后，APX上升高幅度達到32.85%。

CAT是最主要的H2O2清除酶，在活性氧清除系統(tǒng)中具有重要作用。低溫脅迫對甜菜葉片中CAT的影響見圖4D，低溫脅迫會使甜菜葉片中的CAT上升，L組與CK組相比，差異非常顯著(P＜0.05)，低溫脅迫1天后，CAT升高幅度達到2.56倍。

圖4 低溫脅迫對甜菜葉片4種抗氧化酶活性的影響

3 討論

低溫作為常見的非生物因素之一，能夠影響植物超微結構、形態(tài)和生理，并且隨著脅迫時間的延長，對植物的損害程度持續(xù)加深嚴重時能導致植物死亡[42]。植物在逆境下會產生復雜的生物化學和生理學上的響應，從微觀到宏觀，從細胞、分子、組織、器官甚至表型都會發(fā)生改變[43]。最直觀的體現就是植物的表型變化，植物表型的變化有萎蔫、葉片發(fā)黃、葉面積減小，株高降低，這與付娟娟等[44]和胡倩等[45]在研究低溫脅迫下其他植物表型的變化的研究結果一致。張珍珠等[46]研究發(fā)現，低溫會干擾植物體內正常的生理代謝，影響細胞間水分的運輸，細胞吸水能力降低，但蒸騰作用依然存在，當蒸騰大于吸水時，細胞失水，從而葉片出現萎蔫，卷曲的現象。舒必超等[47]研究發(fā)現，低溫來臨時，植物葉片中的氣孔關閉，導致CO2吸入受阻，流通不足，從而使光合作用降低，光合作用是植物產生葉綠素的主要途徑，葉綠素的合成受到抑制，從而導致葉片發(fā)黃。K?rner[48]和Falster等[49]研究發(fā)現植物在逆境條件下,會通過改變自身的生長和形態(tài)特征如降低植株的高度、葉面積減少適應這種逆境條件,通過調整自身生物量的分配來維持逆境條件下植株的存活。

植物在正常的生長狀況下，ROS的產出與分解屬于動態(tài)平衡的狀態(tài)，低溫脅迫下導致ROS的大爆發(fā)，從而損害細胞膜，細胞膜發(fā)生膜脂過氧化反應，產生大量有害物質膜脂過氧化物分解產生MDA，作為一種過氧化產物，可表示植物細胞受損害的程度，MDA含量與植物抗逆性強弱呈負相關。

在低溫脅迫過程中，植物有自己的一套活性氧清除系統(tǒng)，其中酶促防御系統(tǒng)起著重要的作用，酶促防御系統(tǒng)里面的抗氧化酶作為活性氧清除系統(tǒng)，能夠清除植物體內的活性氧，使植物細胞和組織免受傷害。抗氧化酶主要包括SOD、POD、APX及CAT，SOD負責把O-2歧化成H2O2，而POD、CAT和APX在第二步起到了關鍵的作用，進一步將SOD歧化的H2O2分解為H2O和O2[50-51]，從而緩解活性氧對細胞膜造成的傷害，減輕低溫脅迫對植物的傷害。這4種酶的活性可反映其對ROS的清除能力。

低溫脅迫下MDA和超氧陰離子的積累，對甜菜差生一定的毒害作用，從而啟動了甜菜自身的抗氧化防御系統(tǒng)，T-AOC發(fā)生變化，SOD、POD、APX及CAT活性顯著上升，以便清除有害物質，這與其美拉姆等[44]的研究結果一致。其中SOD的變化幅度最大，CAT和POD次之，APX變化幅度最小，不同的抗氧化酶的功能不同，其活性變化程度也不相同。我們可以推測出在抗氧化酶系統(tǒng)中，SOD發(fā)揮了主要的作用。

本研究對甜菜抗寒性生理機制變化進一步進行了補充。目前在低溫脅迫下甜菜非酶促抗氧化系統(tǒng)變化研究的較少。低溫脅迫下甜菜酶促抗氧化系統(tǒng)的變化的研究取得了一定的進展，但是還存在一些不足，主要體現在：對低溫脅迫下甜菜酶促抗氧化系統(tǒng)的酶活性的變化僅僅停留在經驗性研究中，對甜菜在低溫脅迫下甜菜酶促抗氧化系統(tǒng)酶活性的變化機理性研究較少。以及抗氧化酶活性變化產生的具體原因尚不清楚。這都是我們應該注意的問題。在下一步的工作中，將繼續(xù)研究非酶促抗氧化系統(tǒng)的變化，深入研究甜菜抗氧化酶系統(tǒng)各類酶變化產生的機制，投入到甜菜的具體生產實踐中，為社會帶來更高的經濟效益。

甜菜是一種重要的經濟作物，在在制糖產業(yè)中占有重要的地位，因此提高甜菜的產量和品質具有十分重要的意義。北方作為甜菜的主要種植區(qū)域，由于氣候原因，低溫是限制植物生長發(fā)育的最重要的環(huán)境因素，嚴重影響了甜菜的產量和品質，深入研究植物低溫應答分子調控與代謝機制的基礎,也將為提高植物耐低溫特性和作物產量提供重要信息，以為植物抗逆性的研究提供參考。

4 結論

本實驗研究了低溫脅迫(4℃)甜菜品種‘KWS9147’的表型、細胞膜受損情況及抗氧化系統(tǒng)酶活性的變化。低溫會影響作物表型的建成，表型變化主要體現在葉面積減小、葉片顏色變黃、株高降低及葉片出現輕微程度的萎蔫卷曲，植物通過表型的變化保護自身受到低溫侵害。低溫脅迫下，植物體內的自由基的產生和代謝的平衡遭到破壞，ROS大量積累，導致植物細胞膜系統(tǒng)受到傷害，從而使過氧化程度加深。本實驗結果表明，在4℃低溫脅迫下甜菜葉片的氧自由基的產生速率迅速增強、過氧化氫的積累量大幅增加，MDA含量升高了31.32%，這說明在4℃低溫脅迫下甜菜葉片出現了輕微程度的氧化損傷。

甜菜的T-AOC顯著上升了10.74%，其中里面的酶促防御系統(tǒng)發(fā)揮了積極主要的作用，來提高自身的抗寒性。SOD、POD、APX及CAT的含量分別增加了4倍、2.22倍、32.85%和2.56倍，隨著有害物質的積累，SOD、POD、抗APX及CAT通過提高自身的活性來清除有害物質，保護細胞膜。