周志華　李耀偉　王志琪　李躍輝　何苗　叢夢靜

〔摘要〕 目的 研究槲皮素配伍芹菜素抗順鉑誘導人胃上皮細胞（GES-1）損傷作用。方法 運用分子對接技術(shù)將槲皮素和芹菜素與腫瘤壞死因子-α（tumour necrosis factor-α， TNF-α）、白介素-1β（interleukin-1β， IL-1β）蛋白對接。采用細胞實驗方法，將GES-1細胞隨機分為空白組、順鉑組、槲皮素+芹菜素組（40 μmol/L槲皮素配伍4 μmol/L芹菜素干預順鉑誘導GES-1細胞損傷）。噻唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium， MTT）法測定細胞存活率;Hoechst 33258染色劑測定細胞凋亡染色;線粒體膜電位探針（JC-1）測定細胞線粒體膜電位;活性氧探針（DCFH-DA）測定細胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species， ROS）含量;微板法測定谷胱甘肽（glutathione， GSH）含量;硫微量操作法測定丙二醛（malondialdehyde， MDA）含量;鉬酸銨法測定過氧化氫酶（catalase， CAT）含量;WST-1法測定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）含量;ELISA法測定TNF-α、IL-1β表達。結(jié)果 與空白組比較，順鉑組能升高GES-1細胞凋亡熒光度值、ROS和MDA含量、TNF-α和IL-1表達，降低線粒體膜電位、GSH、CAT、SOD含量（P<0.05或P<0.01）;與順鉑組比較，槲皮素+芹菜素組能降低順鉑誘導的GES-1細胞凋亡熒光度值、ROS和MDA含量、TNF-α和IL-1表達，升高線粒體膜電位、CAT、GSH、SOD含量（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論 順鉑能誘導GES-1細胞損傷，槲皮素配伍芹菜素能拮抗順鉑誘導GES-1細胞損傷，其作用與抑制GES-1細胞氧化應激、炎癥反應和凋亡有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 槲皮素;芹菜素;順鉑;GES-1細胞;凋亡;氧化應激;炎癥反應

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2022.05.014

Effect of quercetin and apigenin on cisplatin-induced injury of human gastric epithelial cells

ZHOU Zhihua LI Yaowei WANG Zhiqi LI Yuehui HE Miao CONG Mengjing

（1. School of Pharmacy， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. Research Center of Standardization and Functional Engineering of Traditional Chinese Medicine in Hunan Province， Changsha， Hunan 410208， China; 3. Hunan Academy of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410006， China）

〔Abstract〕 Objective To study the effect of quercetin and apigenin on human gastric epithelial （GES-1） cell injury induced by cisplatin. Methods Molecular docking technology was used to dock the quercetin and apigenin with tumour necrosis factor-α? （TNF-α）， interleukin-1β （IL-1β） proteins. Cell experiment method was used， GES-1 cells were randomly divided into blank group， cisplatin group and quercetin+apigenin group （40 μmol/L quercetin and 4 μmol/L apigenin interfered with cisplatin-induced GES-1 cell damage）. Cell viability was determined by methyl thiazolyl tetrazolium （MTT） method; Hoechst 33258 was used to determine cell apoptosis staining; 5，5'6，6'-tetrachloro-1，1'，3，3'-tetraethyl-imidacarbocyanine iodide （JC-1） was used to detect intracellular mitochondrial membrane potential; reactive oxygen species （ROS） were determined with 2，7-dichlorodidi-hydrofluorescein diacetate （DCFH-DA）; glutathione （GSH） content was measured by microplate method; malondialone （MDA） content was measured by sulfur trace manipulation method; catalase （CAT） content was measured by ammonium molybdate method; WST-1 method was used to determine superoxide dismutase （SOD） content; the expression levels of TNF-α and IL-1β were determined by ELISA. Results Compared with blank group， cisplatin group increased fluorescence value of GES-1 cell apoptosis， ROS and MDA content， TNF-α and IL-1β expression， and decreased mitochondrial membrane potential， GSH， CAT and SOD content （P<0.05 or P<0.01）; compared with the cisplatin group， quercetin+apigenin group decreased cisplatin-induced fluorescence value of GES-1 cell apoptosis， ROS and MDA content， TNF-α and IL-1β expression， and increased mitochondrial membrane potential， CAT， GSH and SOD content （P<0.05 or P<0.01）. Conclusion Cisplatin can induce GES-1 cell injury， quercetin combined with apigenin can antagonize cisplatin-induced cell injury， which may be related to inhibiting cell oxidative stress， inflammatory response and apoptosis.25A77063-C2B2-471B-9E92-F11400E53F48

〔Keywords〕 quercetin; apigenin; cisplatin; GES-1 cells; apoptosis; oxidative stress; inflammatory response

化療性胃腸損傷發(fā)生率高達90%，影響腫瘤治療效果[1]，研究中藥復方或單體可改善化療藥物誘發(fā)的消化道損傷[2-3]。肺復方系湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院協(xié)定方。該方由重樓、黨參、女貞子、白花蛇舌草等12味中藥組成，具有益氣養(yǎng)陰、化瘀解毒、化痰散結(jié)功效[4]。前期實驗研究發(fā)現(xiàn)[5]，肺復方單用或聯(lián)用順鉑可緩解氣陰兩虛Lewis肺癌模型小鼠神疲乏力、口干少飲的癥狀，增加脾臟指數(shù)。根據(jù)肺復方的方解，運用網(wǎng)絡藥理學方法測算出肺復方治療胃炎、胃潰瘍中有5味中藥關(guān)鍵組分為槲皮素，3味中藥關(guān)鍵組分為芹菜素，且均與肺復方化瘀解毒、益氣養(yǎng)陰功效相關(guān)。文獻報道，槲皮素和芹菜素對人胃上皮細胞（GES-1）損傷具有保護作用[6-7]，兩者均可降低細胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species， ROS）、丙二醛（malondialdehyde， MDA）含量及腫瘤壞死因子-α（tumour necrosis factor-α， TNF-α）、白介素-1β（interleukin-1β， IL-1β）表達，升高谷胱甘肽（glutathione， GSH）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）含量，從而拮抗順鉑毒性[8-9]。因此，本文為探討槲皮素配伍芹菜素對順鉑誘導的胃黏膜損傷保護作用及機制，在GES-1細胞上開展單體化合物配伍研究。

1 材料

1.1? 分子對接數(shù)據(jù)庫與軟件

中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫和分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform， TCMSP）、PDB蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫、Auto Dock Tools 4.2.1軟件。

1.2? 實驗細胞系

人胃上皮細胞（GES-1）購于賽庫生物公司，貨號：CC4026。

1.3? 主要試劑與儀器

順鉑（批號：P4394）購于美國Sigma公司;槲皮素標準品（批號：B20527）、芹菜素標準品（批號：B20981）均購于上海源葉生物科技有限公司;N，N-二甲基甲酰胺（DMF）（批號：D112007-100ml）購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司;二甲基亞砜（DMSO）（分析級，批號：D806645）購于上海麥克林生化科技有限公司;特級胎牛血清（批號：164210-50）、RPMI1640培養(yǎng)基（批號：PM150110）、PBS緩沖液（批號：PB180327）、胰蛋白酶（批號：PB180226）均購于普諾賽生物公司;GSH試劑盒（批號：A006-2-1）、過氧化氫酶（catalase， CAT）試劑盒（批號：A007-1-1）、SOD試劑盒（批號：A001-3）、MDA試劑盒（批號：A003-1-2）均購于南京建成公司;BCA蛋白試劑盒（批號：E-BC-K318-M）、TNF-α試劑盒（批號：E-EL-H0109c）、IL-1β茁試劑盒（批號：E-EL-H0149c）均購于伊萊瑞特生物科技有限公司;噻唑藍（MTT）（批號：M8180）、Hoechst 33258染色液（批號：C0021）、線粒體膜電位試劑盒（JC-1）（批號：M8650-100T）均購于索萊寶生物科技有限公司。

3111型CO₂培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）;1510型全波長酶標儀（美國Thermo公司）;75002420型高速冷凍離心機（美國Thermo公司）;990型超低溫冰箱（美國Thermo公司）;BX51型倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司）;TS2-FL型熒光倒置顯微鏡（日本Nikon公司）;KM-500DE型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）;SSW-420-2S型電熱恒溫水浴鍋（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）;SHZ-C型水浴恒溫振蕩器（上海躍進醫(yī)療器械有限公司）。

2 方法

2.1 分子對接技術(shù)測算槲皮素和芹菜素與TNF-α、IL-1β的結(jié)合能

從PDB數(shù)據(jù)庫以物種為Homo sapiens、蛋白分辨率2.0～3.0為條件，獲取TNF-α、IL-1β 3D結(jié)構(gòu)的PDB格式文件;TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取槲皮素和芹菜素的mol2格式文件。利用Auto Dock Tool 4.2.6軟件對蛋白進行去水、加氫優(yōu)化，保存為pdbqt格式文件，作為受體;對槲皮素和芹菜素添加原子電荷，設(shè)置可旋轉(zhuǎn)鍵，保存為pdbqt格式文件，作為配體。將槲皮素和芹菜素與TNF-α、IL-1β進行對接，若結(jié)合能≤-5.0 kcal/mol[10]認為配體和受體結(jié)合越穩(wěn)定，可作為肺復方治療胃炎、胃潰瘍關(guān)鍵組分及蛋白的篩選依據(jù)。

2.2? 試藥的制備

順鉑、槲皮素、芹菜素儲備液：取適量順鉑溶于DMF，制備濃度為80 mmol/L的儲備液;槲皮素、芹菜素溶于DMSO，分別制備濃度為40、100 mmol/L的儲備液，0.22 μm針頭式一次性過濾器除菌后分裝于200 μL的EP管中，-20 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

噻唑藍儲備液：將適量MTT溶解于PBS中，渦旋混勻，使之成為5 mg/mL的MTT儲備液，0.22 μm針頭式一次性過濾器除菌后分裝于10 mL的離心管中，-20 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3? 試藥濃度的確定

取對數(shù)生長期的GES-1細胞接種于96孔板中，按照每孔100 μL、每孔1×10⁴個細胞，在5% CO₂、37 ℃條件下培養(yǎng)，細胞生長70%～80%時，棄去培養(yǎng)基，設(shè)空白組、調(diào)零孔組，2、4、8、16、32、64 μmol/L順鉑組，5、10、20、40、80 μmol/L槲皮素配伍4、8、16 μmol/L芹菜素組。培養(yǎng)24 h后，吸出藥液，加入100 μL濃度為0.5 μmol/L 的MTT，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，棄去MTT，加入100 μL DMSO，置于搖床低速震蕩10～15 min，使用酶標儀在490 nm處測定吸光度，細胞存活率=[A_給藥組-A_{調(diào)零孔組}]/[A_空白組-A_{調(diào)零孔組}]×100%。25A77063-C2B2-471B-9E92-F11400E53F48

2.4? 測定槲皮素配伍芹菜素對順鉑誘導的GES-1細胞存活率的影響

根據(jù)“2.3”項培養(yǎng)細胞，細胞生長70%～80%時棄去培養(yǎng)基，空白組加入100 μL RPMI1640培養(yǎng)基，順鉑組根據(jù)“2.3”項選定濃度加入100 μL順鉑溶液，槲皮素配伍芹菜素組根據(jù)“2.3”項選定濃度給藥，加入50 μL相應藥物，培養(yǎng)1 h后，加入50 μL與順鉑組相同濃度的順鉑溶液，其余步驟參照“2.3”項。

2.5? 檢測GES-1細胞凋亡、線粒體膜電位及ROS含量

取對數(shù)生長期的GES-1細胞接種于12孔板中，按照每孔1 mL、每孔2×10⁵個細胞，在5% CO₂、37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)基，空白組加入1 mLRPMI1640培養(yǎng)基，順鉑組根據(jù)“2.3”項選定濃度加入1 mL順鉑溶液，槲皮素配伍芹菜素組根據(jù)“2.4”項選定濃度給藥，加入500 μL相應藥物，培養(yǎng)1 h后，加入500 μL與順鉑組相同濃度的順鉑溶液，培養(yǎng)24 h。按照Hoechst 33258試劑盒方法進行操作，使用熒光倒置顯微鏡觀察GES-1細胞的定性片段化和濃縮染色來判斷其凋亡程度，以熒光強度進行半定量分析[11];根據(jù)JC-1、ROS檢測試劑盒說明書進行操作，使用熒光倒置顯微鏡觀察、拍照。檢測完成后均使用ImageJ軟件對其進行分析。

2.6? 檢測GES-1細胞GSH、CAT、SOD、MDA含量及TNF-α、IL-1β表達水平

取對數(shù)生長期的GES-1細胞接種于6孔板中，按照每孔2 mL、每孔5×10⁵個細胞，在5%CO₂、37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)基，空白組加入2 mL RPMI1640培養(yǎng)基，順鉑組根據(jù)“2.3”項選定濃度加入2 mL順鉑溶液，槲皮素配伍芹菜素組根據(jù)“2.4”項選定濃度給藥，加入1 mL相應藥物，培養(yǎng)1 h后，加入1 mL與順鉑組相同濃度的順鉑溶液，培養(yǎng)24 h后參照試劑盒操作說明，采用微板法測定GSH含量，硫微量操作法測定MDA含量，鉬酸銨法測定CAT含量，WST-1法測定SOD含量，并使用比色法測定蛋白濃度，采用ELISA法檢測TNF-α、IL-1β水平。

2.7? 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行處理，若服從正態(tài)分布且滿足方差齊性，則進行單因素方差分析，各組數(shù)據(jù)之間采用LSD多重比較;服從正態(tài)分布不滿足方差齊性，則進行單因素方差分析，各組數(shù)據(jù)之間采用Games-Howell多重比較;若不服從正態(tài)分布，則進行非參數(shù)檢驗，計量資料以“x±s”表示。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1? 槲皮素和芹菜素與TNF-α、IL-1β的結(jié)合能

TNF-α、IL-1β與槲皮素結(jié)合能分別為-6.37、-6.28 kcal/mol，與芹菜素結(jié)合能分別為-7.27、-6.29 kcal/mol。

3.2? 試藥濃度的確定

與空白組比較，4、8、16、32、64 μmol/L順鉑作用于GES-1細胞24 h后，細胞存活率降低（P<0.05或P<0.01），且細胞存活率隨順鉑濃度的升高而降低，IC50=（16.36±0.56） μmol/L，考慮細胞存活率對實驗結(jié)果的影響，本實驗選擇16 μmol/L作為順鉑后續(xù)GES-1細胞給藥濃度。5、10、20、40、80 μmol/L槲皮素配伍4 μmol/L芹菜素作用于GES-1細胞24 h后，不影響細胞存活率（P>0.05），由于80 μmol/L的槲皮素配伍芹菜素存活率出現(xiàn)下降趨勢，故采用5、10、20、40 μmol/L槲皮素配伍4 μmol/L芹菜素作用于順鉑誘導GES-1細胞，確定槲皮素配伍芹菜素濃度。詳見圖1。

3.3? 槲皮素配伍芹菜素提高順鉑誘導的GES-1細胞的存活率

與空白組比較，順鉑組的GES-1細胞存活率降低（P<0.01）;5、10、20、40 μmol/L槲皮素配伍4 μmol/L芹菜素可使GES-1細胞存活率升高（P<0.05），故采用40 μmol/L槲皮素和4 μmol/L芹菜素進行后續(xù)實驗。詳見圖2。

3.4? 槲皮素配伍芹菜素抑制順鉑誘導的GES-1細胞凋亡

與空白組比較，順鉑組誘導GES-1細胞凋亡，細胞核由于凋亡濃集呈亮藍色或核呈分葉、碎片狀、邊集形態(tài)，促進GES-1細胞凋亡（以熒光度值作為評價標準）（P<0.01）;顯微鏡觀察到槲皮素配伍芹菜素組細胞形態(tài)逐漸恢復正常，圓形、淡藍色的正常細胞數(shù)量逐漸增加。與順鉑組比較，槲皮素配伍芹菜素組GES-1細胞凋亡降低（P<0.05）。詳見表1、圖3。

3.5? 槲皮素配伍芹菜素升高順鉑誘導的GES-1細胞線粒體膜電位

與空白組比較，順鉑組GES-1細胞線粒體膜電位降低（以紅綠熒光比值作為評價標準）（P<0.01）;與順鉑組比較，槲皮素配伍芹菜素GES-1細胞線粒體膜電位升高（P<0.01）。詳見表1、圖4。

3.6? 槲皮素配伍芹菜素降低順鉑誘導的GES-1細胞ROS含量

與空白組比較，順鉑組GES-1細胞內(nèi)ROS含量升高（以熒光度值作為評價標準）（P<0.01）;與順鉑組比較，槲皮素配伍芹菜素GES-1細胞內(nèi)ROS含量降低（P<0.01）。詳見表1、圖5。

3.7? 槲皮素配伍芹菜素對順鉑誘導的GES-1細胞氧化應激指標、炎癥因子的影響

與空白組比較，順鉑組GES-1細胞內(nèi)GSH、CAT、SOD含量和TNF-α、IL-1β表達升高，MDA含量降低（P<0.05或P<0.01）;與順鉑組比較，槲皮素配伍芹菜素GES-1細胞GSH、CAT、SOD含量升高，MDA含量及TNF-α、IL-1β表達降低（P<0.05或P<0.01）。詳見表2。25A77063-C2B2-471B-9E92-F11400E53F48

4 討論

中藥有效組分配伍遵循傳統(tǒng)方劑的配伍理論與原則，具有成分清楚、作用靶點明確、質(zhì)量可控的特點，可為中醫(yī)方劑配伍研究提供研究基礎(chǔ)[12]。經(jīng)網(wǎng)絡藥理學測算出槲皮素和芹菜素是肺復方治療胃炎、胃潰瘍的關(guān)鍵組分，該方由重樓、黨參、女貞子、半枝蓮等12味藥組成，其中有5味中藥關(guān)鍵組分為槲皮素，3味中藥關(guān)鍵組分為芹菜素?，F(xiàn)有文獻表明，肺復方組方藥材的槲皮素含量高于芹菜素，對組方藥材中槲皮素和芹菜素的含量進行計算得出槲皮素和芹菜素比例范圍是15∶1～8∶1[13-16]。故本實驗選擇槲皮素配伍芹菜素作為研究對象，結(jié)合已有研究表明，槲皮素給藥GES-1細胞濃度小于100 μmol/L[6]，芹菜素給藥GES-1細胞濃度小于20 μmol/L[17]以及對槲皮素配伍芹菜素給藥濃度的探索，確定40 μmol/L槲皮素配伍4 μmol/L芹菜素在GES-1細胞上對肺復方抗順鉑誘導的胃黏膜損傷作用進行研究。

文獻表明，順鉑的細胞毒性作用主要與ROS參與氧化應激、炎癥反應及細胞凋亡有關(guān)[8-9]。ROS包含超氧陰離子、過氧化氫和羥自由基，順鉑可誘導上述自由基的形成從而誘發(fā)細胞毒性[18]。本研究結(jié)果顯示，順鉑能降低GES-1細胞存活率，升高細胞內(nèi)ROS含量;槲皮素配伍芹菜素可提高順鉑誘導的GES-1細胞存活率，降低細胞內(nèi)ROS含量，證實槲皮素配伍芹菜素能拮抗順鉑誘導的GES-1細胞損傷，其作用與抑制順鉑誘導ROS生成的細胞毒性有關(guān)。

ROS包含多種自由基，機體存在GSH、CAT、SOD等抗氧化酶系，可清除過度氧化反應所產(chǎn)生的自由基。有學者指出，順鉑誘導胃腸損傷與抑制抗氧化酶有關(guān)[19]，且抗氧化酶系含量降低及過氧化作用產(chǎn)物MDA升高常作為順鉑誘導氧化損傷的重要標志物[20]。本研究結(jié)果顯示，槲皮素與芹菜素配伍干預順鉑誘導的GES-1細胞后，GSH、CAT、SOD含量降低，MDA含量升高。實驗結(jié)果證實，槲皮素配伍芹菜素通過升高抗氧化酶系含量，降低過氧化作用產(chǎn)物，改善GES-1細胞中氧化應激反應，起到保護胃黏膜的作用。

胃黏膜組織中出現(xiàn)大量的炎癥細胞是胃腸黏膜損傷特征之一，而炎癥細胞產(chǎn)生多種炎癥介質(zhì)則進一步加重胃黏膜損傷[21]。TNF-α、IL-1β是核因子κB（nuclear factor-kappa light chain enhancer of B cells， NF-κB）通路上的關(guān)鍵蛋白，與細胞膜表面受體TNFR和IL-1R結(jié)合可激活NF-κB通路，促進炎癥因子TNF-α和IL-6的生成，導致胃黏膜炎癥的發(fā)生發(fā)展，從而加重胃潰瘍 [22]。分子對接結(jié)果表明，槲皮素和芹菜素與TNF-α、IL-1β蛋白結(jié)合能力強，本次實驗表明，槲皮素配伍芹菜素通過降低順鉑誘導的GES-1細胞中TNF-α和IL-1β表達，改善GES-1細胞中炎癥反應。

細胞內(nèi)的ROS過多會影響GES-1細胞線粒體功能，線粒體是傳遞凋亡信號的主要細胞器，其膜電位的改變是細胞凋亡發(fā)生的標志之一[23]。本研究以細胞凋亡染色、線粒體膜電位為細胞凋亡指標，檢測槲皮素配伍芹菜素對順鉑誘的GES-1細胞凋亡的影響。實驗結(jié)果表明，槲皮素與芹菜素配伍后減少順鉑誘導的GES-1細胞凋亡數(shù)量，降低凋亡細胞熒光強度，升高GES-1細胞線粒體膜電位，證實槲皮素配伍芹菜素可能通過減少GES-1細胞凋亡，升高線粒體膜電位，從而保護順鉑誘導損傷。

綜上所述，肺復方治療胃炎、胃潰瘍的關(guān)鍵組分槲皮素配伍芹菜素可拮抗順鉑誘導GES-1細胞的損傷，作用環(huán)節(jié)涉及降低GES-1細胞中ROS含量，緩解順鉑引起GES-1細胞凋亡、氧化應激和炎癥反應。肺復方可能作用于ROS和NF-κB通路緩解鉑類藥物引起的胃黏膜損傷保護胃，其改善順鉑誘導胃黏膜損傷的具體機制仍需進一步探究。

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