趙萬(wàn)韜，包學(xué)英，李明成

(1.北華大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 吉林 132011；2.吉林省中藥DNA指紋檢測(cè)技術(shù)科技創(chuàng)新中心，吉林 吉林 132013)

蘄蛇為蝰科動(dòng)物五步蛇(AgkistrodonacutusGuenther)的干燥體，其味甘咸、性溫，具有祛風(fēng)濕、散風(fēng)寒、舒筋活絡(luò)等藥效[1].蘄蛇成長(zhǎng)極慢，是我國(guó)一味傳統(tǒng)名貴中藥，又是食藥同源品種之一.由于市場(chǎng)需求量大、貨緊價(jià)高等原因，市場(chǎng)上各種充偽品屢見不鮮[2-3].2010年版《中國(guó)藥典》收錄了應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法鑒別蘄蛇真?zhèn)危凑辗肿由飳W(xué)鑒定技術(shù)要求，每次實(shí)驗(yàn)必須設(shè)置蘄蛇正品(即標(biāo)準(zhǔn)品)為陽(yáng)性對(duì)照[4-5].正品蘄蛇藥源珍貴，若每次實(shí)驗(yàn)都需要重新提取DNA，不僅費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，且十分浪費(fèi)[6].

本實(shí)驗(yàn)在《中國(guó)藥典》收錄蘄蛇PCR法鑒定基礎(chǔ)上，對(duì)蘄蛇DNA進(jìn)行提取，并對(duì)PCR鑒定試劑進(jìn)行了改良，研制出蘄蛇DNA檢測(cè)試劑盒[6].本實(shí)驗(yàn)嘗試運(yùn)用分子克隆技術(shù)，體外進(jìn)行蘄蛇標(biāo)準(zhǔn)品特異DNA區(qū)段PCR擴(kuò)增，與質(zhì)粒載體重組，導(dǎo)入工程菌宿主細(xì)胞內(nèi)，使特異片段在宿主細(xì)胞內(nèi)通過(guò)自我復(fù)制而產(chǎn)生大量分子克隆，目的是使蘄蛇特異基因序列片段得到保存?zhèn)鞔?，確保蘄蛇分子生物學(xué)鑒定方法的專屬性及特異度.

1 材料與方法

1.1 材 料

4批次蘄蛇正品藥材分別采集天津(編號(hào)：TJQS-1、TJQS-1、TJQS-2)、北京(編號(hào)：BJQS-1)，所有樣品經(jīng)吉林市藥檢所金英蘭主任藥師鑒定，并依據(jù)《中國(guó)藥典》收錄的PCR方法鑒定均為正品，具體信息見參考文獻(xiàn)[6].

1.2 試 劑

2×Taq PCR MasterMix(1 000 U)、pGM-T克隆試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒(北京康潤(rùn)誠(chéng)業(yè)生物科技有限公司)；大腸埃希菌DH-5α感受態(tài)細(xì)胞、LB固體和液體培養(yǎng)基(北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司)；氨芐西林(AMP)、IPTG、X-gal(Sigma公司，德國(guó)).

1.3 儀 器

Gene AmpR PCR System 2700 PCR儀(Perkin Elmer公司，美國(guó))；超微量紫外可見分光光度計(jì)Q6000(Quawell公司，美國(guó))；紫外凝膠成像自動(dòng)分析儀(Biorad公司，美國(guó)).

1.4 PCR擴(kuò)增蘄蛇特異DNA片段

1.4.1 蘄蛇基因組DNA的提取

使用團(tuán)隊(duì)研制的中藥材蘄蛇DNA檢測(cè)試劑盒提取蘄蛇基因組DNA[6]，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)基因組DNA的濃度和純度，用雙蒸水將DNA提取液適當(dāng)稀釋，用于PCR反應(yīng)模板.

1.4.2 PCR反應(yīng)及瓊脂糖凝膠電泳

參考文獻(xiàn)[7]的方法進(jìn)行PCR反應(yīng)，結(jié)束后取產(chǎn)物10～15 μL，加在2%的瓊脂糖凝膠(含GelRed)點(diǎn)樣孔中，電泳30 min，結(jié)束后在紫外凝膠成像自動(dòng)分析儀上記錄結(jié)果.

1.5 PCR產(chǎn)物與pGM-T連接、鑒定

1.5.1 連 接

按照表1準(zhǔn)備混合反應(yīng)液，置于16 ℃水浴過(guò)夜，次日將離心管置于冰上.

表1 PCR產(chǎn)物與pGM-T連接反應(yīng)體系Tab.1 System of PCR products and pGM-T ligation reactions

1.5.2 培養(yǎng)基的制備

制備LB液體和固體培養(yǎng)基，固體培養(yǎng)基含有AMP(75 μg/mL)，表面加入IPTG(50 mg/mL)16 μL、X-gal(20 mg/mL)40 μL，均勻涂開，避光，將其置于37 ℃放置1～3 h，備用.

1.5.3 轉(zhuǎn) 化

取連接產(chǎn)物50 μL加到大腸埃希菌DH-5α感受態(tài)細(xì)胞中，混勻，冰浴30 min.42 ℃水浴90 s，立即置于冰浴2 min.加入37 ℃預(yù)熱的LB液體培養(yǎng)基，120 r/min，37 ℃震蕩培養(yǎng).吸取100 μL培養(yǎng)完成的混勻菌液，加到LB固體瓊脂培養(yǎng)基上，混勻涂開，37 ℃培養(yǎng)12～16 h.

1.5.4 鑒 定

挑選白色菌落接種3 mL LB(含AMP 90 μg/mL)培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，用質(zhì)粒提取試劑盒按照說(shuō)明書提取質(zhì)粒，應(yīng)用PCR及測(cè)序鑒定插入片段是否正確.

1.6 穩(wěn)定性考察

將鑒定準(zhǔn)確的攜帶正品蘄蛇特異DNA序列的菌落置于-80 ℃冰柜保存，30 d、60 d、3個(gè)月和6個(gè)月后復(fù)蘇，采用煮沸法進(jìn)行基因組DNA的提取，再用PCR擴(kuò)增方法進(jìn)行鑒定.

2 結(jié) 果

2.1 蘄蛇特異DNA序列克隆與鑒定

采用團(tuán)隊(duì)自行研制的試劑盒提取正品蘄蛇基因組DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得特異基因片段；同時(shí)，利用分子克隆方法獲得正品蘄蛇特異DNA片段，經(jīng)煮沸法提取蘄蛇DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其結(jié)果為不同品種的正品蘄蛇PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，均在250～350 bp之間出現(xiàn)特異條帶.見圖1.

M.Marker；1.TJQS-3；2.BJQS-1；3.TJQS-1；4.TJQS-2；5.克隆后蘄蛇DNA；6.陰性對(duì)照.圖1 蘄蛇正品PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.1 Agrose gell electrophoresis of PCR products

2.2 蘄蛇特異DNA片段序列克隆測(cè)序

將PCR鑒定含有目的片段質(zhì)粒送上海生工生物工程有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果登陸NCBI Nucleotide-BLAST在線比對(duì)，結(jié)果顯示：送檢片段的核苷酸序列與Genebank(AY223560)注冊(cè)蘄蛇物種相似性均為99%(見圖2)，證明本實(shí)驗(yàn)分子克隆后所得到的蘄蛇目的基因片段是正確的，克隆所得DNA片段即為蘄蛇目的基因片段.

圖2 克隆后蘄蛇特異DNA測(cè)序結(jié)果與Genbank比對(duì)Fig.2 Comparison of DNA sequences and Genbank of Agkistrodon acutus Guenther

2.3 蘄蛇特異DNA序列克隆的穩(wěn)定性考察

將攜帶正品蘄蛇特異DNA序列的工程細(xì)菌及用試劑盒方法提取、PCR擴(kuò)增獲得的含有蘄蛇正品特異DNA片段的溶液放置于-80 ℃冰柜內(nèi)，保存30 d、60 d、3個(gè)月和6個(gè)月后復(fù)蘇，分別進(jìn)行獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，瓊脂糖凝膠電泳圖譜顯示：隨著時(shí)間的推移，試劑盒方法提取及PCR擴(kuò)增獲得DNA的濃度呈遞減趨勢(shì)，有的品種6個(gè)月后完全降解消失；而分子克隆方法獲得蘄蛇正品特異基因片段的所有品種6個(gè)月后經(jīng)PCR擴(kuò)增后依然出現(xiàn)亮且清晰的目標(biāo)條帶.見圖3.

M.Marker；1.TJQS-3；2.BJQS-1；3.TJQS-1；4.TJQS-2；5.克隆后蘄蛇DNA；6.陰性對(duì)照.圖3 -80 ℃保存6個(gè)月的蘄蛇正品PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.3 Agrose gell electrophoresis of PCR products and molecular cloning assay stored at -80 ℃ for six months

3 討 論

傳統(tǒng)鑒別蘄蛇方法主要有基源、性狀、顯微及理化鑒別.基源和性狀鑒別方法簡(jiǎn)便易行，但是需要鑒別者有豐富的專業(yè)經(jīng)驗(yàn).中藥材蘄蛇在炮制等過(guò)程中會(huì)失去很多能夠代表來(lái)源物種的信息，增加了鑒別難度，準(zhǔn)確性也大大降低.顯微鑒別方法適合以原粉入藥的中藥鑒別，蘄蛇多以同源動(dòng)物作為偽品及混淆品，這些近緣動(dòng)物的基本結(jié)構(gòu)大部分非常相似，只有細(xì)微結(jié)構(gòu)的微小差別，因此，用顯微法鑒別蘄蛇具有一定困難[8].

近年來(lái)，以DNA分子為標(biāo)記的中藥分子鑒定方法得到廣泛認(rèn)可.生物體無(wú)論在生長(zhǎng)發(fā)育還是經(jīng)過(guò)人為加工，物種具有特定的DNA序列不會(huì)因環(huán)境變化而改變.因此，利用DNA指紋圖譜鑒別具有獨(dú)一無(wú)二的重復(fù)性，檢測(cè)范圍廣泛，炮制或破損中藥材對(duì)檢測(cè)結(jié)果沒(méi)有影響，也不依賴鑒別者的專業(yè)知識(shí)，特別適用于非專家物種鑒定[9-11].

本科研團(tuán)隊(duì)研制出川貝母、蘄蛇、烏梢蛇DNA檢測(cè)試劑盒，建立了貂心、龜甲和鹿類產(chǎn)品PCR檢測(cè)方法[12-15]，已廣泛用于中藥材正品與偽品的鑒別，不僅能夠得到與藥典相同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，也使DNA 指紋鑒定技術(shù)更加快速規(guī)范，可廣泛地應(yīng)用于藥品生產(chǎn)企業(yè)和檢驗(yàn)基層機(jī)構(gòu).《中國(guó)藥典》鑒定蘄蛇DNA需要每次提供正品蘄蛇樣品進(jìn)行DNA提取，若每次使用的陽(yáng)性對(duì)照品都從國(guó)家法定機(jī)構(gòu)購(gòu)買，勢(shì)必增加鑒定成本.若自己購(gòu)買蘄蛇藥材用于陽(yáng)性對(duì)照，因不能保證每次所使用的蘄蛇都是正品，每次使用時(shí)需要重新鑒定樣品的真?zhèn)危速M(fèi)時(shí)間和精力.本科研團(tuán)隊(duì)利用微生物生長(zhǎng)快速、繁殖量大、可傳代等優(yōu)點(diǎn)，使得細(xì)菌內(nèi)的特異DNA片段得到長(zhǎng)久保存，已經(jīng)成功將川貝母DNA特異片段克隆并保存在細(xì)菌體內(nèi)，用于川貝母鑒定和試劑盒生產(chǎn)[16].

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：利用分子克隆方法保存蘄蛇特異基因片段可行且有效，不僅節(jié)省了蘄蛇藥源藥材，而且即使反復(fù)凍融也對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)無(wú)干擾，確保了實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定性，同時(shí)也克服了傳統(tǒng)方法所提取DNA片段容易降解的缺點(diǎn).該成果為保存珍貴中藥材特異基因序列、建立新中藥正品基因庫(kù)奠定了理論基礎(chǔ)，推動(dòng)了中藥材DNA檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展[17-18].