唐 琳，張軍芳，王 英，孫 斌，王恩澤，SHIN Jongsuh,郭盼盼，金 鑫，嚴(yán)昌國，李香子，李 強(qiáng),3

(1.延邊大學(xué)，東北寒區(qū)肉?？萍紕?chuàng)新教育部工程研究中心，吉林省肉?？茖W(xué)與產(chǎn)業(yè)技術(shù)重大需求協(xié)同創(chuàng)新中心，延吉 133002；2.韓國江原大學(xué)校動(dòng)物生命科學(xué)系，春川 24341；3.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，延吉133002)

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)是犬最常見的胃腸道疾病之一，根據(jù)嚴(yán)重程度分為輕度、中度和重度，其中，重度胰腺炎可發(fā)展為全身炎癥、多器官衰竭及休克，死亡率達(dá)27%～42%[1]。此外，獸醫(yī)臨床中對(duì)SAP尚無有效的特異性治療藥物，臨床上只能通過對(duì)癥治療方式來治療SAP。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是多能細(xì)胞，具有自我更新能力和多向分化潛能，存在于多種組織中，如骨髓、脂肪組織和胎膜，其中，脂肪組織的MSCs含量較高，在臨床上易于分離與獲得[2-3]。MSCs作為再生醫(yī)學(xué)的細(xì)胞來源引起了人們的關(guān)注，尤其是MSCs可通過分泌多種生物活性分子來調(diào)控體內(nèi)炎癥反應(yīng)[4]。因此，間充質(zhì)干細(xì)胞作為免疫性疾病的新型治療策略，在體內(nèi)炎癥過度激活時(shí)可高效地調(diào)節(jié)免疫水平[5]。有多個(gè)研究證明，脂肪來源MSCs(adipose-derived MSCs，Ad-MSCs)對(duì)炎性疾病具有治療潛力，如關(guān)節(jié)炎、炎性腸炎、敗血癥等[5-7]。有研究報(bào)道，人和犬Ad-MSCs(canine Ad-MSCs，cAd-MSCs)能有效改善由SAP引起的全身性炎癥反應(yīng)[8-10]。然而，cAd-MSCs對(duì)SAP的治療機(jī)制尚不完全清楚。

胰腺炎的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，主要原因?yàn)橐鹊鞍酌府惓＜せ钜鸬囊认俳M織自身消化、胰腺腺泡組織凋亡和壞死引起的炎性反應(yīng)[11]。已有研究證明，胰腺腺泡細(xì)胞(pancreatic acinar cells,PACs)損傷引起的炎癥反應(yīng)是胰腺炎發(fā)展為SAP的主要病因之一，且PACs受到外部刺激時(shí)，炎癥細(xì)胞通過分泌炎癥因子來刺激內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，可通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激機(jī)制產(chǎn)生局部炎癥反應(yīng)，從而進(jìn)一步通過炎性細(xì)胞因子來激活全身免疫應(yīng)答[12-13]。另外，SAP模型研究中，利用Caerulein刺激方式誘導(dǎo)小鼠引起SAP模型較多，但此模型只局限于誘導(dǎo)局部SAP，并未能引起全身性炎癥[14-15]。肖魯瑤等[16]在誘導(dǎo)小鼠SAP的研究中證明，50 μg/kg 雨蛙素(Caerulein)與10 mg/kg脂多糖(LPS)共刺激可進(jìn)一步加重小鼠急性胰腺炎的嚴(yán)重程度，是建立全身性SAP研究模型的理想方法。然而，目前內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在SAP中的作用機(jī)制及cAd-MSCs對(duì)PAC內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的調(diào)控作用還不清楚。因此，為分析cAd-MSCs對(duì)PACs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的調(diào)控作用，本試驗(yàn)首先分離cAd-MSCs和小鼠PACs，并利用Cearulein和LPS共刺激方式建立體外SAP內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激研究模型，通過間接共培養(yǎng)系統(tǒng)驗(yàn)證cAd-MSCs對(duì)PAC內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的調(diào)控及保護(hù)作用，以期為干細(xì)胞治療胰腺炎提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 犬脂肪組織來源于延邊大學(xué)動(dòng)物醫(yī)院卵巢子宮切除術(shù)的24月齡健康母犬，小鼠胰腺組織來源于延邊大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心的7周齡C57BL/6小鼠。

1.1.2 主要試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基、Trypsin-EDTA(0.25%)、表皮生長因子(EGF)均購自Gibco公司；胎牛血清(FBS)購自Bioind公司；青-鏈霉素混合液(PS)、PBS緩沖液均購自Solarbio公司；PRIME-XV?成脂分化無血清培養(yǎng)基(SFM)、PRIME-XV?成骨分化SFM和PRIME-XV?成軟骨分化Xeno-Free無血清培養(yǎng)基(XSFM)均購自Irvine Scientific公司；Caerulein、LPS、胰蛋白酶抑制劑、油紅O染色液、茜素紅S染色液和阿爾新藍(lán)染色液均購自Sigma公司；總RNA提取試劑盒、蛋白提取試劑均購自iNtRON Biotechnology公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自CellSafe公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購自Enzo Life Sciences公司；CD29-FITC、CD34-PE、CD73-PE、CD45-FITC、CD44-FITC和CD90-PE均購自BD Biosciences公司；Anti-Caspase-12、Anti-CHOP、Anti-Grp78蛋白抗體均購自Cusabio Biotech公司；Anti-rabbit和Anti-mouse IgG二抗均購自Santa Cruz Biotechnology公司。

1.2 方法

1.2.1 cAd-MSCs的分離培養(yǎng)與鑒定 通過無菌手術(shù)從母犬的子宮剝離犬脂肪組織，置于含1% PS PBS的離心管中低溫運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。將犬脂肪組織用滅菌眼科剪剪成1 mm3后，加入1 mg/mLⅠ型膠原酶，在37 ℃水浴鍋中振蕩消化1 h。用FBS終止消化后，1 500 r/min離心5 min去除上清液。用含20% FBS、1% PS的DMEM重懸細(xì)胞，經(jīng)100目細(xì)胞篩網(wǎng)過濾后，以1×106/mL接種于培養(yǎng)皿，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d換液1次，體視顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)85%以上時(shí)，用Trypsin-EDTA(0.25%)消化細(xì)胞，進(jìn)行1∶3傳代培養(yǎng)。分離細(xì)胞傳至3代后，取1×106/mL的cAd-MSCs，分別加入1∶100稀釋的CD29-FITC、CD34-PE、CD73-PE、CD45-FITC、CD44-FITC和CD90-PE，于4 ℃避光孵育30 min；孵育后用PBS反復(fù)清洗、離心，隨后用PBS重懸細(xì)胞，利用BD FACS Aria Ⅱ流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。為進(jìn)一步檢測干細(xì)胞的分化潛能，使用PRIME-XV成脂分化無血清培養(yǎng)基(SFM)、成骨分化培養(yǎng)基SFM和成軟骨細(xì)胞分化培養(yǎng)基SFM進(jìn)行誘導(dǎo)分化，誘導(dǎo)分化過程中，每2 d換液1次，分別于誘導(dǎo)的第14天進(jìn)行油紅O染色、茜素紅S染色和阿爾新藍(lán)染色。

1.2.2 小鼠PACs的分離與鑒定 根據(jù)Song等[6]方法，用1 mg/mLⅠ型膠原酶分離3只C57BL/6小鼠的胰腺組織PACs。 用含10% FBS、1% PS、胰蛋白酶抑制劑(0.25 mg/mL)、EGF(10 ng/mL)的DMEM培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，收集PACs，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測PACs及胰腺組織中胰腺導(dǎo)管特異性基因細(xì)胞角蛋白(CK19)、β-胰島細(xì)胞特異性細(xì)胞基因胰島素-1(Insulin-1)、α-胰島細(xì)胞特異性基因胰高血糖素(Glucagon)及PAC特異性基因胰腺特異性轉(zhuǎn)錄因子(PTF-1α)、羧肽酶A-1(CPA-1)、α淀粉酶(AMY2B)的表達(dá)。

1.2.3 SAP體外內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型構(gòu)建 為建立SAP體外內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型，將原代PACs進(jìn)行如下分組及處理：①對(duì)照組(不添加藥物，Naive)；②LPS-10組(添加10 μg/mL LPS)；③LPS-20組(添加20 μg/mL LPS)；④Cae-10組(添加10 mmol/L Caerulein)；⑤Cae-100組(添加100 mmol/L Caerulein)；⑥LPS+Cae組(添加10 μg/mL LPS+100 mmol/L Caerulein)；培養(yǎng)24 h后，使用CCK-8檢測各組細(xì)胞存活率，篩選出最佳構(gòu)建模型的處理組(模型組，P)；CCK-8法檢測P組與對(duì)照組細(xì)胞0、2、4、8、12和24 h的存活率及模型組78 ku葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(Grp78)、CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CHOP)、Caspase-12蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.4 cAd-MSCs與PACs體外共培養(yǎng)系統(tǒng)篩選 用Tripsin-EDTA(0.25%)消化匯合度達(dá)到80%的第3代cAd-MSCs，用含10% FBS、1% PS的DMEM終止消化，輕輕吹打，4 ℃、1 200 r/min離心5 min，用培養(yǎng)液吹打混勻后接種在6孔板中，直接共培養(yǎng)系統(tǒng)中PACs懸浮培養(yǎng)于6孔板中，間接共培養(yǎng)系統(tǒng)中將PACs接種到0.4 μm孔徑的transwell插入物中。細(xì)胞分為：空白對(duì)照組(僅PACs，Naive)、P組、間接共培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)組(IC)、直接共培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)組(DC)，除對(duì)照組外，其余3組均用10 μg/mL LPS+100 mmol/L Caerulein刺激12 h。收集各組細(xì)胞，檢測腫瘤壞死因子α(TNF-α)基因的表達(dá)情況，以篩選合適的cAd-MSCs與PACs體外共培養(yǎng)系統(tǒng)。

1.2.5 cAd-MSCs對(duì)PACs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響 細(xì)胞分為空白對(duì)照組(Naive)、對(duì)照組(C)、P組及試驗(yàn)組(T)。各組細(xì)胞均采用1.2.4篩選出的共培養(yǎng)系統(tǒng)，空白對(duì)照組僅有PACs，對(duì)照組為PACs與cAd-MSCs間接共培養(yǎng)，模型組和試驗(yàn)組均用10 μg/mL LPS+100 mmol/L Caerulein刺激PACs，試驗(yàn)組PACs與cAd-MSCs共培養(yǎng)。共培養(yǎng)系統(tǒng)在含37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行12 h培養(yǎng)。收集各組細(xì)胞，檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因(Grp78、CHOP、Caspase-12)及其蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.6 基因表達(dá)水平的檢測 使用Easy-Blue總RNA提取試劑盒提取1.2.2、1.2.4及1.2.5中的細(xì)胞以及胰腺組織總RNA，用CellScript All-in-One cDNA Master Mix試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中小鼠內(nèi)參基因GAPDH，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因Grp78、CHOP、Caspase-12，炎癥細(xì)胞因子TNF-α，胰腺導(dǎo)管特異性基因CK19、β-胰島細(xì)胞特異性細(xì)胞基因Insulin-1、α-胰島細(xì)胞特異性基因Glucagon及PAC特異性基因PTF-1α、CPA-1、AMY2B序列，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物信息見表1。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以GAPDH為內(nèi)參基因，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。PCR反應(yīng)體系20 μL：cDNA模板2 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL，2×AMPIGENE qPCR Green Mix Hi-ROX 10 μL，RNase-free ddH2O 6.4 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性5 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40個(gè)循環(huán)。根據(jù)2-ΔΔCt法分析各基因的表達(dá)情況。

表1 引物信息

1.2.7 蛋白表達(dá)水平的檢測 使用PRO-PREP蛋白提取試劑盒提取1.2.3、1.2.4、1.2.5處理的PAC的總蛋白。用Bio-Rad DC蛋白質(zhì)檢測試劑盒進(jìn)行總蛋白濃度測量，并將20 μg蛋白質(zhì)通過SDS-PAGE電泳進(jìn)行分離后，利用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜,5%脫脂奶粉封閉處理1 h，與一抗Caspase-12(1∶500)、CHOP(1∶500)、Grp78(1∶1 000)在4 ℃過夜孵化,與二抗(1∶500)在室溫孵育1 h后，用凝膠圖像掃描儀掃描，并使用ImageJ 1.48軟件對(duì)蛋白條帶灰度值進(jìn)行分析。

1.2.8 TUNEL染色檢測細(xì)胞凋亡 為分析cAd-MSCs對(duì)PACs的抗凋亡效果，通過Apo-BrdU DNA Fragmentation Assay試劑盒對(duì)1.2.5中各處理組PACs進(jìn)行TUNEL染色，并通過EVOS FL熒光顯微鏡進(jìn)行陽性細(xì)胞進(jìn)行檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 19.0和Graphic Prism 7.0軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 cAd-MSCs的形態(tài)及鑒定結(jié)果

分離細(xì)胞培養(yǎng)3 d后，可觀察到cAd-MSCs成纖維樣(圖1)。流式細(xì)胞術(shù)鑒定結(jié)果顯示，分離培養(yǎng)的cAd-MSCs高表達(dá)CD29、CD44、CD73和CD90，不表達(dá)CD34和CD45(圖2)。cAd-MSCs分化14 d后，油紅O染色結(jié)果顯示有明顯脂滴生成(圖3A)，茜素紅S染色有明顯紅染鈣結(jié)節(jié)(圖3B)，阿爾新藍(lán)染色后發(fā)現(xiàn)被藍(lán)染的軟骨細(xì)胞(圖3C)。

2.2 PACs的形態(tài)及鑒定結(jié)果

在倒置顯微鏡中觀察，分離的PACs呈現(xiàn)鵝卵石形狀(圖4)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果表明，與胰腺組織相比較，分離的PACsCK19、Glucagon、Insulin-1基因的相對(duì)表達(dá)水平均極顯著降低(P<0.01)，AMY2B、CPA-1和PTF-1α基因的表達(dá)水平均顯著增加(P<0.05)(圖5)。

圖1 cAd-MSCs形態(tài)(200×)Fig.1 Morphology of cAd-MSCs (200×)

A～F，分別為CD29、CD44、CD90、CD73、CD45和CD34A-F,CD29,CD44,CD90,CD73,CD45 and CD34,respectively圖2 cAd-MSCs流式細(xì)胞鑒定結(jié)果Fig.2 Flow cytometry identification results of cAd-MSCs

A～C，油紅O、茜素紅S和阿爾新藍(lán)染色A-C,Oil red O,alizarin red S and alcian blue staining，respectively圖3 cAd-MSCs多向分化潛能鑒定結(jié)果(200×)Fig.3 Results of multidirectional differentiation potential identification of cAd-MSCs (200×)

圖4 PACs的形態(tài)(200×)Fig.4 Morphology of PACs (200×)

①A～F，分別為CK-19、Glucagon、Insulin-1、AMY2B、CPA1和PTF-1α的相對(duì)表達(dá)量。②*，差異顯著(P<0.05)；**，差異極顯著(P<0.01)①A-F,The relative expression of CK-19,Glucagon,Insulin-1,AMY2B,CPA1 and PTF-1α,respectively.②*,Significant difference (P<0.05)；**，Extremely significant difference(P<0.01)圖5 PACs鑒定Fig.5 Identification of PACs

2.3 SAP模型構(gòu)建處理篩選及模型組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白表達(dá)變化

由圖6A可知，Cae-100及Cae+LPS組細(xì)胞存活率分別顯著和極顯著低于對(duì)照組(P<0.05；P<0.01)，因此選用10 μg/mL LPS+100 mmol/L Caerulein用于構(gòu)建SAP模型；由圖6B可知，與Naive組相比，Cae+LPS組細(xì)胞存活率從4 h開始顯著降低(P<0.05)，8、12、24 h細(xì)胞存活率均極顯著降低(P<0.01)；由圖6C～6F可知，與0 h相比，Cae+LPS組細(xì)胞的Grp78、Caspase-12和CHOP的蛋白表達(dá)水平在2 h均無顯著變化，4 h以后均極顯著增加(P<0.01)。

①A，SAP模型構(gòu)建處理的篩選；B，對(duì)照組及模型組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞存活率；C，Grp78、Caspase-12、CHOP蛋白Western blotting檢測；D～F，Grp78、Caspase-12、CHOP蛋白的灰度值。②與Naive組/0 h相比，*，差異顯著(P<0.05)；**，差異極顯著(P<0.01)；無*，差異不顯著(P>0.05)①A,Selection of SAP model construction;B,Cell survival rate of control group and model group at different time points；C,Western blotting detection of Grp78,Caspase-12 and CHOP;D-F,Gray values of Grp78,Caspase-12 and CHOP proteins.②Compared with Naive group/0 h,*,Significant difference (P<0.05)；**，Extremely significant difference (P<0.01)；No *,No significant difference (P>0.05)圖6 SAP模型構(gòu)建處理的篩選及模型組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白的表達(dá)變化Fig.6 Selection of SAP model construction and changes of endoplasmic reticulum stress protein expression in model groups

2.4 cAd-MSCs與PACs體外共培養(yǎng)系統(tǒng)篩選

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明，P組TNF-α基因的表達(dá)水平極顯著高于Naive組(P<0.01)，IC和DC組TNF-α基因的表達(dá)水平均極顯著低于模型組(P<0.01)(7C)，考慮到細(xì)胞沉降的影響，選用間接共培養(yǎng)系統(tǒng)用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.5 cAd-MSCs對(duì)PACs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的作用

在間接共培養(yǎng)系統(tǒng)中，P組Grp78、Caspase-12和CHOP的mRNA和蛋白水平的表達(dá)均極顯著高于Naive和C組(P<0.01)，而Naive和C組無顯著差異(P>0.05)；與P組相比，T組Grp78、Caspase-12和CHOP的mRNA和蛋白水平的表達(dá)均極顯著降低(P<0.01)(圖8)。

①A、B，直接和間接共培養(yǎng)系統(tǒng)示意圖；C，TNF-α基因相對(duì)表達(dá)量。②肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；肩標(biāo)不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)；肩標(biāo)相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同①A and B,Schematic diagram of direct and indirect co-culture system,respectively;C,The relative expression of TNF-α gene.②Values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05);And with different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.01);While with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05).The same as below圖7 cAd-MSCs與PACs體外共培養(yǎng)系統(tǒng)篩選Fig.7 Screening of cAd-MSCs and PACs co-culture system in vitro

A～C，Grp78、Caspase-12、CHOP基因的相對(duì)表達(dá)量；D，Grp78、Caspase-12、CHOP蛋白Western blotting檢測；E～G，Grp78、Caspase-12、CHOP蛋白的灰度值A(chǔ)-C,The relative expression of Grp78,Caspase-12 and CHOP genes;D,Western blotting detection of Grp78,Caspase-12 and CHOP;E-G,Gray values of Grp78,Caspase-12 and CHOP proteins圖8 各組PACs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激基因及蛋白的相對(duì)表達(dá)量Fig.8 The relative expression of endoplasmic reticulum stress genes and proteins of PACs in each group

2.5 PAC凋亡檢測結(jié)果

由圖9可知,Naive和C組TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)較少，P組TUNEL陽性細(xì)胞明顯增加，cAd-MSCs處理后的T組TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少。

A～D，分別為空白對(duì)照組(Naive)、對(duì)照組(C)、模型組(P)和試驗(yàn)組(T)A-D,Blank control group(Naive),control group (C),model group(P) and test group(T),respectively圖9 各組PACs的TUNEL陽性細(xì)胞情況Fig.9 TUNEL positive cells of PACs in each group

3 討 論

長期以來，SAP的發(fā)病機(jī)制和病理情況一直是醫(yī)學(xué)界的重要研究課題。目前，引起SAP的發(fā)病機(jī)理有很多，其中包括炎癥細(xì)胞引起的局部至全身性炎癥反應(yīng)，以及刺激胰腺腺泡細(xì)胞引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[17]。由于SAP發(fā)病的因素不明，因此，選擇合適的SAP建模方法對(duì)研究其發(fā)病機(jī)制具有深遠(yuǎn)意義。研究者根據(jù)不同的方法制造了不同的SAP動(dòng)物模型[15]。Caerulein構(gòu)建SAP模型操作簡單，可重復(fù)性好，但由于Caerulein主要用于建立水腫型SAP，且Caerulein成本過高[13]。因此，常用Caerulein和LPS共同誘導(dǎo)建立胰腺炎模型[16]。本試驗(yàn)中，比較了不同濃度的LPS和Caerulein對(duì)PAC的作用，結(jié)果表明隨著處理濃度和時(shí)間的增加，PACs存活率呈下降趨勢，存在明顯的時(shí)間及劑量效應(yīng)。

SAP是一種胰腺組織局部炎癥發(fā)展至全身性炎癥反應(yīng)的綜合征，且發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，包括炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激損傷、細(xì)胞凋亡等[14]。多項(xiàng)研究表明，PACs損傷是SAP發(fā)生的多種病理學(xué)事件的早期主要影響因素及共同原因，影響損傷因素有胰蛋白酶異常激活、氧自由基以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)異常[17-18]，PACs主要負(fù)責(zé)合成消化酶原，含有豐富的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器，具有合成和運(yùn)輸?shù)鞍踪|(zhì)的功能，且對(duì)細(xì)胞外刺激和細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)變化高度敏感，如炎癥刺激、過度的氧化反應(yīng)、細(xì)胞內(nèi)代謝異常[19-20]。在生理?xiàng)l件下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)應(yīng)激傳感器(IRE-1α、PERK、ATF6)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白BiP(又稱Grp78)結(jié)合，保持非活性狀態(tài)[21]。受到刺激時(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)啟動(dòng)應(yīng)激機(jī)制，增加細(xì)胞內(nèi)游離Grp78蛋白與胞內(nèi)錯(cuò)誤折疊蛋白的結(jié)合，達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的效果[22-24]。 然而，過度的應(yīng)激反應(yīng)將誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，其中CHOP和Caspase-12被認(rèn)為是導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激過程中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因子[21,25-26]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，10 μg/mL LPS+100 mmol/L Caerulein模型組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白(Grp78、CHOP、Casepase-12)隨時(shí)間增加而增加，表明PACs受損而導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。

MSCs可在炎癥環(huán)境中直接分泌抗炎細(xì)胞因子，如白介素10(IL-10)、腫瘤壞死因子刺激基因(TSG-6)等來影響免疫細(xì)胞的表型[27-28]。另外，相關(guān)研究表明，不同組織來源MSCs對(duì)輕度和SAP動(dòng)物模型具有治療作用，且在沒有達(dá)到相對(duì)應(yīng)靶器官的情況下注射干細(xì)胞也能改善炎癥性疾病[9-10，27]。TNF-α是SAP發(fā)病時(shí)最早起作用的炎癥細(xì)胞因子，可通過級(jí)聯(lián)反應(yīng)誘發(fā)全身性炎癥[29-30]。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在直接共培養(yǎng)及間接共培養(yǎng)系統(tǒng)中，cAd-MSCs對(duì)PACs免疫相關(guān)基因TNF-α的表達(dá)水平無明顯影響，因此，可初步判斷cAd-MSCs對(duì)PACs炎癥反應(yīng)的調(diào)控方式為旁分泌間接調(diào)控。為進(jìn)一步驗(yàn)證cAd-MSCs是否可通過旁分泌調(diào)控方式影響PACs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平，進(jìn)一步利用間接共培養(yǎng)系統(tǒng)分析了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因及蛋白表達(dá)水平。結(jié)果表明，cAd-MSCs在間接共培養(yǎng)系統(tǒng)可顯著下調(diào)Grp78、Caspase-12和CHOP的mRNA及蛋白的表達(dá)水平，并降低PACs的凋亡數(shù)量，說明cAd-MSCs可顯著降低PACs的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平。綜上，cAd-MSCs可通過旁分泌間接調(diào)控PACs的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平，從而調(diào)控PACs的凋亡。結(jié)果可為cAd-MSCs靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號(hào)通路來治療胰腺炎提供理論指導(dǎo)。

4 結(jié) 論

cAd-MSCs在10 μg/mL LPS+100 mmol/L Caerulein共刺激下，可通過旁分泌間接調(diào)控Grp78、Caspase-12和CHOP mRNA及蛋白的相對(duì)表達(dá)，從而抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平，并降低PACs的凋亡水平。