包小雅 楊宇昊 翟景波

摘要：布魯氏桿菌是一種胞內(nèi)寄生菌，現(xiàn)階段針對(duì)布魯氏桿菌病主要從細(xì)菌學(xué)、血清學(xué)、分子生物學(xué)等幾方面進(jìn)行檢測(cè)。該文對(duì)布魯氏桿菌及檢測(cè)方法加以介紹，以期為后續(xù)研究提供參考。

關(guān)鍵詞：布魯氏桿菌;血清學(xué)檢測(cè);分子生物學(xué)檢測(cè)

中圖分類號(hào)：R516.7文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Bdoi：10.3969/j.issn.2096-3637.2022.01.001

Research Progress in Brucella and Detection Methods

BAO Xiaoya1，YANG Yuhao2，ZHAI Jingbo1

（Medical School，Inner Mongolia University for Nationalities，Tongliao Inner Mongolia 028000，China;2.College of Animal Science and Technology，Inner Mongolia University for Nationalities，Tongliao Inner Mongolia 028000，China）

Abstract：Brucellosis is mainly detected from bacteriology，serology，molecular biology and so on. In this paper，Brucella and its detection methods are introduced in order to provide reference for the follow-up research.

Keywords：brucella，serological detection，molecular biological detection

0引言

布魯氏桿菌?。˙rucellosis）簡稱布病，是一種由布魯氏桿菌引起的人畜共患型傳染病。1887年，英國醫(yī)生Bruce于一病死于“馬耳他熱”的患者脾臟內(nèi)分離到了布魯氏桿菌，自此該病原菌被公布于世。該病流傳范圍極其廣泛，于170多個(gè)國家和地區(qū)均有流傳[1]。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將布病設(shè)為必須通報(bào)的動(dòng)物疫病，我國也將該病列為二類動(dòng)物疫病。

1病原學(xué)

布魯氏桿菌為革蘭氏陰性菌，屬α-變形菌，菌體多呈現(xiàn)球桿狀，也可見卵圓狀，大小為（0.5～0.7）μm×（0.6～1.2）μm，無運(yùn)動(dòng)性、無天然質(zhì)粒，除部分具有毒力的菌株外多數(shù)菌株同樣不具有莢膜，為兼性胞內(nèi)寄生。與其他胞內(nèi)寄生菌相區(qū)別的是，該菌不含陰性菌所有的外毒素等毒力因子，且不具有抗原變異性，這些特性可幫助其脫逃免疫防線成功侵入機(jī)體內(nèi)并進(jìn)行復(fù)制。在入侵過程中，布魯氏桿菌的非經(jīng)典脂多糖（lipopolysaccharide，簡稱LPS）可與細(xì)胞表面特異性受體進(jìn)行相互作用，保護(hù)菌體不受殺菌肽及補(bǔ)體引發(fā)的裂解，從而協(xié)助菌體逃避免疫應(yīng)答，此外該結(jié)構(gòu)在菌體發(fā)揮毒性的過程中也起著十分重要的作用[2]。

布魯氏桿菌可感染多數(shù)的哺乳動(dòng)物及部分兩棲動(dòng)物，目前已知的主要有6種經(jīng)典類型19個(gè)亞型，分別為B.melitensis（羊種，主要感染綿羊和山羊，分為1、2、3亞型）、B.abortus（牛種，分為1、2、3、4、5、6、7、9亞型）、B.suis（豬種，主要感染豬、野兔、野豬、馴鹿和嚙齒動(dòng)物，分為1、2、3、4、5亞型）、B. canis（犬種）、B. neotomae（沙林鼠種）、B.ovis（綿羊附睪種）。之后又鑒定到B.microti（田鼠型）、B.pinnipediae（鰭型）、B.cetacea（鯨型）、B.vulpis（狐貍型）和B.inopinata（人類為天然宿主）5種類型菌種。此外，還有從兩棲類動(dòng)物中分離出布魯氏桿菌的報(bào)道[1]。目前，我國已經(jīng)分離到該菌的6個(gè)經(jīng)典種及其所有亞型。

2檢測(cè)方法

2.1細(xì)菌學(xué)

細(xì)菌學(xué)檢測(cè)是布病檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，該檢測(cè)方法可根據(jù)布魯氏桿菌在無二氧化碳環(huán)境下、含堿性品紅染劑或不同設(shè)置的生化培養(yǎng)基內(nèi)的生長狀態(tài)進(jìn)行細(xì)菌的基因分型[3]，在疾病的診斷與流行病學(xué)調(diào)查上具有重要意義。動(dòng)物布病檢測(cè)可選擇流產(chǎn)胎兒、陰道分泌物、奶水、血液等組織為樣本進(jìn)行培養(yǎng)。該方法準(zhǔn)確性高，但所需時(shí)間較長，且布魯氏桿菌的培養(yǎng)鑒定需在生物安全3級(jí)以上的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行操作，分離過程危險(xiǎn)性較高，因此不適用于疫情緊急檢測(cè)[4]。

2.2血清學(xué)

由于血清學(xué)檢測(cè)相對(duì)簡單、成本低、陰性預(yù)測(cè)值高，在經(jīng)濟(jì)和技術(shù)資源有限的流行地區(qū)，血清學(xué)檢測(cè)仍是主要的診斷工具。目前針對(duì)布病已經(jīng)開發(fā)了高效的血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)，多見于酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、凝集試驗(yàn)、熒光偏振檢測(cè)方法和膠體金免疫層析技術(shù)。

2.2.1酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

將菌體抗原包被于ELISA板上，若被檢血清內(nèi)含有相應(yīng)抗體，此時(shí)板內(nèi)則會(huì)形成抗原抗體復(fù)合物，之后加入酶標(biāo)二抗，再與酶的底物進(jìn)行反應(yīng)產(chǎn)生顏色，最后根據(jù)酶標(biāo)儀檢測(cè)樣品的OD值得出抗體量。該項(xiàng)檢測(cè)技術(shù)準(zhǔn)確性高，但操作需要專業(yè)技術(shù)人員及儀器，因此不適用于基層大規(guī)模檢測(cè)。補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)是通過將布魯氏桿菌補(bǔ)體結(jié)合抗原與待檢血清中的抗體結(jié)合形成復(fù)合物，復(fù)合物再與補(bǔ)體結(jié)合，從而不再引起指示系統(tǒng)中紅細(xì)胞溶血的檢測(cè)方法[5]。該方法敏感性強(qiáng)，特異性高，是OIE認(rèn)可的血清學(xué)檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)法，多應(yīng)用于牛羊布病的檢測(cè)。

2.2.2凝集試驗(yàn)

布病常用的凝集試驗(yàn)為虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBPT）與試管凝集試驗(yàn)（SAT）。虎紅平板凝集是根據(jù)虎紅平板抗原對(duì)IgG類抗體進(jìn)行檢測(cè)，操作簡單、快速，適用于大范圍的布病篩查工作[6]。試管凝集試驗(yàn)則是針對(duì)IgM抗體進(jìn)行檢測(cè)，不易受非特異性抗體的干擾，假陰性率低，可對(duì)疾病進(jìn)行定性分析[7]。此外，2- 巰基乙醇試驗(yàn)（2-ME）和乳牛全乳環(huán)狀試驗(yàn)（MRT）也被應(yīng)用于布病的檢測(cè)。

2.2.3熒光偏振檢測(cè)

最早的熒光偏振檢測(cè)技術(shù)是由Nielsen等建立的，主要利用分子旋轉(zhuǎn)特性，來測(cè)量抗原與抗體的結(jié)合進(jìn)行檢測(cè)，但由于檢測(cè)設(shè)備價(jià)格昂貴，目前市場(chǎng)上尚未廣泛應(yīng)用該方法進(jìn)行布病的檢測(cè)[8]。

2.2.4膠體金免疫層析技術(shù)

膠體金免疫層析技術(shù)是將膠體金標(biāo)記技術(shù)、免疫檢測(cè)技術(shù)和蛋白層析技術(shù)相結(jié)合的以硝酸纖維膜作為載體的固相膜免疫分析技術(shù)，該技術(shù)檢測(cè)快速，可被廣泛應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)的快速檢測(cè)，在臨床上具有廣闊的應(yīng)用前景和極大的發(fā)展?jié)摿9]。

2.3分子生物學(xué)

近些年，分子生物學(xué)診斷不斷取得進(jìn)展，特別是針對(duì)一些培養(yǎng)難度較大的微生物所引起的感染。由于布魯氏桿菌屬的培養(yǎng)條件具有一定特殊性，因此分子生物學(xué)檢測(cè)是其最優(yōu)的檢驗(yàn)方式。布病的分子生物學(xué)檢測(cè)方式以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、重組酶聚合酶擴(kuò)增以及環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增等4種方法較為多見。

2.3.1聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）

近年，PCR檢測(cè)技術(shù)憑借其操作方法簡單、準(zhǔn)確率高等優(yōu)勢(shì)再檢測(cè)領(lǐng)域占有一定優(yōu)勢(shì)。Paul[10]等針對(duì)不同基因片段設(shè)計(jì)了5對(duì)引物，建立了可檢測(cè)布魯氏桿菌分型的多重PCR方法，之后對(duì)80株布魯氏桿菌進(jìn)行鑒別檢測(cè)，成功地區(qū)分出了不同種屬的菌株。Morata等[11]為評(píng)估PCR檢測(cè)法對(duì)布魯氏桿菌的診斷率，對(duì)比了34份不同樣品下PCR與常規(guī)微生物培養(yǎng)技術(shù)的準(zhǔn)確率，結(jié)果顯示PCR準(zhǔn)確率為97%，靈敏度遠(yuǎn)高于培養(yǎng)所得的29.4%。

2.3.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR

實(shí)時(shí)熒光定量PCR是許多實(shí)驗(yàn)室診斷的首選方法。該技術(shù)將聚合酶鏈反應(yīng)與熒光報(bào)告分子的使用相結(jié)合，以便在PCR反應(yīng)的每個(gè)周期中監(jiān)測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。良好的靈敏度和特異性、可重復(fù)的數(shù)據(jù)、低污染風(fēng)險(xiǎn)和減少人工操作時(shí)間的相結(jié)合，使得實(shí)時(shí)PCR技術(shù)成為傳統(tǒng)PCR的一種替代方法。為對(duì)該方法靈敏度進(jìn)行檢測(cè)，研究者使用SYBR Green I熒光定量PCR對(duì)10例布魯氏桿菌陽性樣本進(jìn)行檢測(cè)，并與傳統(tǒng)的微生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示W(wǎng)right的血清凝集30%呈陰性，而SYBR Green I熒光定量PCR檢測(cè)陽性為90%。表明了該檢測(cè)方法具有良好的敏感度[12]。

2.3.3重組酶聚合酶擴(kuò)增

重組酶聚合酶擴(kuò)增（RPA）是一種核酸體外擴(kuò)增技術(shù)，與傳統(tǒng)PCR技術(shù)不同，該方法在核酸復(fù)制過程中形成D型結(jié)構(gòu)，之后雙向引物同時(shí)復(fù)制，從而實(shí)現(xiàn)基因片段的指數(shù)型增長。且復(fù)制的整個(gè)過程只需在37～42 ℃的恒溫條件下進(jìn)行即可。Ren等[13]建立了一種用于檢測(cè)布魯氏桿菌的重組酶聚合酶擴(kuò)增方法（RPA），該檢測(cè)方法可在20 mm內(nèi)檢測(cè)到每個(gè)反應(yīng)中至少有3拷貝布魯氏桿菌。RPA具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡便等優(yōu)勢(shì)。

2.3.4環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增

與RPA相似，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）同樣是是一種快速、簡便的DNA檢測(cè)方法，不同的是該檢測(cè)方法所需溫度為60 ℃。Bhat等[14]應(yīng)用不同引物及試劑的LAMP進(jìn)行RT-LAMP檢測(cè)，并與qPCR結(jié)果進(jìn)行比較。試驗(yàn)結(jié)果顯示RT-LAMP分析的靈敏度比qPCR高10倍左右。且該檢測(cè)方法與其他病原菌沒有任何交叉反應(yīng)，其特異性強(qiáng)，是直接和早期檢測(cè)布魯氏桿菌的一種特異和快速診斷工具。

3討論與結(jié)論

布病病程較長，為慢性傳染性疾病，臨床表現(xiàn)不具有特異性，多見于波浪熱、關(guān)節(jié)性疾病以及生殖系統(tǒng)疾病，且嚴(yán)重程度依據(jù)個(gè)體不同臨床差異性較大，這為疾病的治療增加了極大的難度。動(dòng)物患病后的臨床表現(xiàn)不明顯，可見于流產(chǎn)及生殖系統(tǒng)疾病，多數(shù)患畜無明顯臨床表現(xiàn)。

對(duì)于布病而言，防控與及時(shí)的診斷極為重要，各種診斷手段都存在不同的利弊，必要時(shí)需要結(jié)合多種檢測(cè)手法進(jìn)行共同診斷。日常的防控工作中要注意動(dòng)物疫苗的注射，現(xiàn)階段主要應(yīng)用的疫苗為弱毒苗，基因工程苗也在研究中[15]。

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