閆曉煜

摘要：目的 使用快速高敏結(jié)核分枝桿菌群及利福平耐藥基因檢測(cè)技術(shù)（Gene Xpert/RIF Ultra）檢測(cè)臨床常見(jiàn)標(biāo)本，統(tǒng)計(jì)各類(lèi)標(biāo)本的陽(yáng)性率，評(píng)估在肺結(jié)核病中的診斷價(jià)值。方法 選取2021年1月1日～2022年1月1日來(lái)我院治療并進(jìn)行過(guò)Xpert/RIF Ultra檢測(cè)的患者，符合入選標(biāo)準(zhǔn)的共5890例，其中檢測(cè)標(biāo)本為痰液1848例，標(biāo)本為肺泡灌洗液2634例，其余為組織或其他體液標(biāo)本1408例。結(jié)果 痰液標(biāo)本中的陽(yáng)性率為32.25%，肺泡灌洗液的陽(yáng)性率為35.42%，其他標(biāo)本總的陽(yáng)性率為28.56%，全部標(biāo)本的陽(yáng)性率為30.08%。結(jié)論 Xpert/RIF Ultra檢測(cè)肺泡灌洗液標(biāo)本和痰液標(biāo)本有較高的陽(yáng)性率;對(duì)于無(wú)法咳痰或難以取得合格痰液標(biāo)本的患者，使用肺泡灌洗液標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)很有價(jià)值。

關(guān)鍵詞：結(jié)核病，肺泡灌洗液，Gene Xpert

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌傳染而引起的一種慢性傳染性疾病，其中以肺部感染最常見(jiàn)，臨床上可累及機(jī)體多個(gè)器官。結(jié)核病的主要臨床癥狀為午后低熱、盜汗、乏力、消瘦、咳嗽咳痰、咯血、呼吸困難等，對(duì)患者的生活質(zhì)量與生命健康有著嚴(yán)重的影響。研究表明，結(jié)核桿菌入侵人體后有不同時(shí)長(zhǎng)的潛伏期，所以臨床早診斷、早治療非常必要，患者大多可臨床治愈，預(yù)后良好。結(jié)核桿菌培養(yǎng)是臨床診斷結(jié)核病的金標(biāo)準(zhǔn)，但是培養(yǎng)周期長(zhǎng)，難以獲得及時(shí)有效的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)依據(jù)。因此，早期快速診斷成為目前結(jié)核病防控面臨的主要問(wèn)題。

臨床上，分子生物學(xué)方法是一類(lèi)高敏感的檢測(cè)方法和技術(shù)，能夠?qū)颖局械慕Y(jié)核桿菌核酸直接檢測(cè)，不僅可以提升結(jié)核病的檢出率和診斷效率，而且能夠?qū)Y(jié)核患者及早進(jìn)行有效的治療管理。目前，常見(jiàn)的方法有實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（SAT-TB）、γ干擾素釋放試驗(yàn)（T-SPOT.TB）、肺結(jié)核核酸（TB-DNA）定量。SAT-TB是對(duì)臨床收集的痰液進(jìn)行液化處理后，加入核酸提取劑100℃10min后提取核酸，最后將提取物進(jìn)行上機(jī)擴(kuò)增。該方法是在恒溫下進(jìn)行，大大縮短了反應(yīng)時(shí)間，得到結(jié)果相對(duì)快捷，缺點(diǎn)是實(shí)驗(yàn)抗干擾能力差，易出現(xiàn)假陰性，且對(duì)痰液中的菌量下限有要求，當(dāng)標(biāo)本中抗酸桿菌低于100 CFU/ml時(shí)，不易檢出。γ干擾素釋放試驗(yàn)是采集患者外周靜脈血清5ml，置于肝素抗凝管內(nèi)，并及時(shí)將血液加入培養(yǎng)管中，37℃培養(yǎng)16h以上，第二天將培養(yǎng)管離心對(duì)血清進(jìn)行ELISA檢測(cè)，最終用酶標(biāo)儀測(cè)量并分析結(jié)果。此方法靈敏度高，臨床應(yīng)用廣泛，但無(wú)法為活動(dòng)性結(jié)核與陳舊性結(jié)核提供鑒別診斷的依據(jù)。TB-DNA最常見(jiàn)的分子生物學(xué)檢測(cè)方法，臨床采集患者標(biāo)本后，實(shí)驗(yàn)室對(duì)標(biāo)本進(jìn)行預(yù)處理，待分枝桿菌核酸提取等工作完成后，用熒光定量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，在PCR擴(kuò)增儀（美國(guó)ABI，7500）上進(jìn)行擴(kuò)增，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算出DNA表達(dá)量，結(jié)果以>400拷貝為陽(yáng)性，反之為陰性。熒光定量PCR法有內(nèi)標(biāo)通道對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程進(jìn)行監(jiān)測(cè)，結(jié)果相對(duì)準(zhǔn)確，但擴(kuò)增時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，而且核酸提取的過(guò)程均為手工操作，預(yù)處理花費(fèi)的時(shí)間和精力相對(duì)較大。因此，亟須推廣自動(dòng)化的檢測(cè)方法，減輕檢測(cè)工作人員的工作負(fù)擔(dān)，提高實(shí)驗(yàn)室操作的生物安全性。

根據(jù)中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)肺結(jié)核診斷WS 288—2017的標(biāo)準(zhǔn)[1]，超敏結(jié)核分枝桿菌及利福平耐藥基因檢測(cè)（Gene Xpert/RIF Ultra，簡(jiǎn)稱(chēng)Gene Xpert）在結(jié)核病診斷中，表現(xiàn)出檢測(cè)靈敏度相對(duì)較高，且特異度也不低，能夠更快地為臨床提供早期診斷依據(jù)，在臨床結(jié)核病診斷方面具有非常好的應(yīng)用前景。GeneXpert系統(tǒng)自進(jìn)行純化核酸擴(kuò)增、單一或復(fù)雜樣本中的目標(biāo)序列測(cè)定。該系統(tǒng)使用單份/一次性的Xpert檢測(cè)匣，檢測(cè)匣內(nèi)裝有PCR反應(yīng)試劑，以獨(dú)立進(jìn)行PCR處理，由于試劑盒采用自成一體的封閉設(shè)計(jì)，因此使得樣本間的交叉污染最小化。目前，臨床上最常見(jiàn)的標(biāo)本類(lèi)型為痰液和肺泡灌洗液，但由于結(jié)核病還存在肺外結(jié)核，例如泌尿系結(jié)核、消化道結(jié)核、結(jié)核性腦膜炎及其他局部組織結(jié)核感染病等，且Gene Xpert檢測(cè)費(fèi)用比較高，這在一定程度上阻礙了其在臨床上的推廣。因此，對(duì)其他類(lèi)型標(biāo)本的檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行回顧性分析，檢測(cè)肺外結(jié)核病患者標(biāo)本類(lèi)型的陽(yáng)性率及效能評(píng)價(jià)十分重要。

1對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

采用回顧性研究方法選取2021年1月1日～2022年1月1日就診于我院的5890例患者作為研究對(duì)象。其中，檢測(cè)標(biāo)本為痰液1848例，標(biāo)本為肺泡灌洗液2634例，其余為組織或其他體液標(biāo)本1408例，包括組織、引流液、引流條、血液、胸腹水、心包積液、胃液、刷檢物、手術(shù)切除標(biāo)本、傷口分泌物、皮損分泌物、膿腫穿刺液、尿液、腦脊液、關(guān)節(jié)液、骨髓、宮頸分泌物等?；颊吣挲g范圍為1～98歲，男性3472例（58.9%），女性2418例（41.1%）。痰液標(biāo)本中的陽(yáng)性率為32.26%，肺泡灌洗液的陽(yáng)性率為35.42%，其他標(biāo)本總的陽(yáng)性率為28.56%，全部標(biāo)本的陽(yáng)性率為30.08%。

1.2? 檢測(cè)方法

嚴(yán)格按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，根據(jù)樣本的形狀，取標(biāo)本處理液2ml對(duì)1ml標(biāo)本（1～2倍樣本體積處理液）進(jìn)行液化處理，避免檢測(cè)標(biāo)本中有明顯顆粒物或者血液，充分振蕩10～15s，然后將樣本室溫下靜置15min，在靜置5～10min時(shí)再次用力振蕩10～20次，保證樣本充分液化，不應(yīng)有未液化的痰液細(xì)小塊狀物。根據(jù)樣本檢測(cè)數(shù)量準(zhǔn)備Xpert MTB/RIF檢測(cè)匣，并在檢測(cè)匣側(cè)面標(biāo)注樣本編號(hào)。打開(kāi)檢測(cè)匣的蓋子，使用試劑盒內(nèi)提供的無(wú)菌移液管吸取液化前處理好的樣本2ml以上（如果樣本量不足，不要進(jìn)行下一步），由檢測(cè)匣的加樣孔緩慢加入（避免形成氣溶膠），關(guān)閉檢測(cè)匣蓋子。其余液化樣本可保存于2～8℃達(dá)12 h，以備重復(fù)檢測(cè)使用。結(jié)果判讀與解釋?zhuān)篨pertMTB/RIF檢測(cè)結(jié)果儀器測(cè)量熒信號(hào)和內(nèi)設(shè)的計(jì)算算法來(lái)判斷，由系統(tǒng)直接報(bào)告結(jié)果，并在“預(yù)覽結(jié)果”（ViewResults）窗口顯示。結(jié)核分支桿菌檢測(cè)基于樣本中分支桿菌的 Ct值，結(jié)核分支桿菌結(jié)果將以高、中、低或非常低來(lái)顯示。結(jié)果分為：檢測(cè)到利福平耐藥、未檢測(cè)到利福平耐藥、利福平耐藥不確定。其中，只有在檢測(cè)到結(jié)核分枝桿菌的情況下，才顯示利福平耐藥的檢測(cè)結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料數(shù)據(jù)用（%）表示，組間比較采取卡方檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

痰液組和肺泡灌洗組分別與其他類(lèi)型標(biāo)本組進(jìn)行比較，P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

3討論

近十年來(lái)，由于艾滋病患者、糖尿病患者、老年人等特殊人群的數(shù)目增長(zhǎng)，流動(dòng)人口增加，多重耐藥性結(jié)核桿菌增多，以及部分國(guó)家地區(qū)對(duì)結(jié)核控制的忽視等因素，全球結(jié)核病防控形勢(shì)十分嚴(yán)峻[2]。傳統(tǒng)結(jié)核診斷技術(shù)涂片鏡檢法以及結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)法盡管有一定的特異性，但都存在不足，如齊尼抗酸染色法涂片鏡檢敏感度低，容易漏檢;培養(yǎng)法耗時(shí)長(zhǎng)，容易導(dǎo)致延誤診療，這也是造成結(jié)核難以有效被控制的原因之一[3]。眾所周知，作為目前臨床重要的一線抗結(jié)核藥物，利福平和異煙肼的耐藥現(xiàn)象十分嚴(yán)重，即大部分菌株對(duì)利福平耐藥的同時(shí)，也對(duì)異煙肼有耐藥性。因此，利用GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)利福平耐藥性可作為多重耐藥結(jié)核桿菌（MDR-TB）的篩選標(biāo)志，對(duì)臨床的用藥治療也能提供一定的參考價(jià)值。

通常，痰液中檢出結(jié)核菌是診斷患者患有活動(dòng)性肺結(jié)核病的主要依據(jù)，因?yàn)榇嬖谟诜尾坎≡顗乃澜M織的大多數(shù)結(jié)核分支桿菌是通過(guò)痰液排出體外的。目前，傳統(tǒng)的羅琴氏（LJ）固體培養(yǎng)法陽(yáng)性率不高，且特異度差，因?yàn)楦鞣N非結(jié)核分枝桿菌（NTM）均可生長(zhǎng)，需要結(jié)合菌種鑒定方可確定是否為結(jié)核分枝桿菌?？顾崛旧科m然檢測(cè)便捷即時(shí)，但當(dāng)標(biāo)本中的結(jié)核分支桿菌數(shù)目低于5000條/ml時(shí)，極易漏檢[4～5]。美國(guó)賽沛公司推出的檢測(cè)技術(shù)有著極高的靈敏度，在痰標(biāo)本中的檢測(cè)下限為131 CFU/ml，遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的鏡檢法及其他檢測(cè)方法;并且GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)技術(shù)有操作簡(jiǎn)便、生物安全性高、抗干擾能力強(qiáng)等特點(diǎn)[6]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)此項(xiàng)技術(shù)的檢測(cè)敏感性和特異度做了許多回顧性研究，有結(jié)果顯示，GeneXpert MTB/RIF診斷結(jié)核病的特異度達(dá)99.2%，靈敏度為 92.2%[7]。針對(duì)我院標(biāo)本種類(lèi)繁多的情況，本次研究將臨床進(jìn)行了Xpert MTB/RIF的所有患者進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示各種類(lèi)型標(biāo)本的陽(yáng)性率存在明顯差異，且說(shuō)明Xpert MTB/RIF技術(shù)在檢測(cè)不同標(biāo)本時(shí)，敏感度存在差異，但都顯示很高的特異度。而肺泡灌洗液陽(yáng)性率稍高，可能是與臨床留取痰標(biāo)本的合格率有關(guān)。因?yàn)檠芯恐杏袑W(xué)齡前兒童及高齡患者，這類(lèi)人群很難正確咳痰，送檢的標(biāo)本中唾液較多，對(duì)檢測(cè)結(jié)果的陽(yáng)性率有嚴(yán)重影響。所以，一次檢測(cè)的陰性結(jié)果并不能排除結(jié)核病，需不同日期多次留取痰液檢測(cè)才能提高陽(yáng)性率，對(duì)他們而言，留取肺泡灌洗液標(biāo)本可能更為合適。

雖然Xpert MTB/RIF有優(yōu)點(diǎn)很多，但也存在些問(wèn)題及局限性，例如對(duì)臨床留取痰液標(biāo)本質(zhì)量的要求很高;各類(lèi)標(biāo)本的前處理也十分重要，食物殘?jiān)?、血紅蛋白、藥物等對(duì)結(jié)果有一定影響;結(jié)果回報(bào)的結(jié)核桿菌復(fù)合群，不能區(qū)分標(biāo)本中的結(jié)核分枝桿菌是死菌或活菌等。因此，盡管傳統(tǒng)羅氏培養(yǎng)耗時(shí)長(zhǎng)需要4～8周;抗酸染色鏡檢法敏感性低，涂片質(zhì)量以及工作人員閱讀能力不同，易造成誤診或漏檢;恒溫結(jié)核RNA檢測(cè)技術(shù)的抗干擾能力差，但結(jié)合上Xpert MTB/RIF的快速、高靈敏度和特異度這項(xiàng)新診斷技術(shù)，能有效對(duì)臨床提供病原學(xué)診斷依據(jù)。

綜上所述，Xpert/RIF Ultra檢測(cè)肺泡灌洗液標(biāo)本和痰液標(biāo)本有較高的陽(yáng)性率;對(duì)于無(wú)法咳痰或難以取得合格痰液標(biāo)本的患者，使用肺泡灌洗液標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)很有價(jià)值。Xpert MTB/RIF檢測(cè)技術(shù)適合在實(shí)驗(yàn)室條件不高的臨床試驗(yàn)室推廣使用，但該技術(shù)也存在一定缺陷，需與結(jié)核分枝桿菌的其它檢測(cè)方法相結(jié)合，進(jìn)一步提高結(jié)核分枝桿菌的正確檢出率。

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