張?jiān)罉罚?李智強(qiáng)， 陳 倩

福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/媒介病毒研究中心/福建省植物病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002

隨著分子生物學(xué)和測序技術(shù)的發(fā)展，一些隱藏于昆蟲體內(nèi)但不引起宿主昆蟲明顯病癥的微生物逐漸被熟知，這些微生物被稱為共生微生物(Cowlingetal.,2013; Hong,2009)。共生微生物與昆蟲的共生關(guān)系并不單單指互利共生，也包括對抗關(guān)系以及相互并無明顯影響的共生關(guān)系。但在大多數(shù)情況下，共生關(guān)系不能嚴(yán)格地劃分為僅屬于這3類中的一類，它可以隨環(huán)境或其他情況而變化。通常認(rèn)為，共生微生物與宿主最多的是互惠互利關(guān)系(Hurst & Hutchence,2010)。近年來研究發(fā)現(xiàn)，某些共生菌與昆蟲的生物學(xué)特性相關(guān)，如內(nèi)共生菌不僅能合成昆蟲宿主所需的營養(yǎng)成分，還可通過解毒昆蟲宿主所攝取的植物次生物質(zhì)，提高其對寄主植物的利用能力，以調(diào)節(jié)昆蟲宿主的種群適應(yīng)性(褚棟等,2006; 徐紅星等,2009; Himleretal.,2011； Zabalouetal.,2004)。昆蟲體內(nèi)的細(xì)菌還與昆蟲存在協(xié)同進(jìn)化關(guān)系(Thao & Baumann,2004)。

柑橘木虱DiaphorinacitriKuwayama屬半翅目Hemiptera木虱科Liviidae (Percyetal., 2018)，主要危害蕓香科植物，以柑橘屬受害最重，黃皮Clausenalansium(Lour.) Skeels、九里香Murrayapaniculata(L.) Jack.和枸椽CitrusmedicaL.次之，是傳播黃龍病最主要的昆蟲媒介，也是世界柑橘生產(chǎn)中最嚴(yán)重的害蟲之一(葉志勇等,2006)。柑橘木虱的高齡若蟲和成蟲都能攜帶柑橘黃龍病的病原，一旦獲毒就具有終生傳病的能力(陳循淵, 1986)。隨著宏基因組學(xué)的發(fā)展，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，除了能攜帶黃龍病病原菌之外，柑橘木虱體內(nèi)還存在很多其他微生物，如內(nèi)共生病毒(Nourietal.,2015； Sahaetal.,2012; Stackebrandt & Goodfellow,1991)。Nourietal.(2015)分析了世界范圍內(nèi)的柑橘木虱種群，發(fā)現(xiàn)柑橘木虱體內(nèi)存在多種多樣的類似于病毒的序列。Reeseetal.(2014)利用生物信息學(xué)，并采用桑格測序法(sanger sequencing)、RT-PCR和PCR驗(yàn)證，最終鑒定了很多新的病毒序列。隨后，柑橘木虱呼腸孤病毒序列(Diaphorinacitrireovirus, DcRV)(Chenetal.，2019)、類小核糖核酸病毒(Picorna-like viruses, DcPLV)(Kooninetal.，2008)、類布尼亞病毒序列(Diaphorina citri Bunyavirus， DcBV)以及類濃核病毒序列(Densovirus-like sequences, DcDNV)(Nourietal.，2015)、柑橘木虱相關(guān)的C病毒(Diaphorina citri-associated C virus, DcACV)(Nourietal.，2016)、柑橘木虱類黃病毒(Diaphorina citri flavi-like virus, DcFLV)(Matsumuraetal.，2016)相繼被發(fā)現(xiàn)。同時(shí)，Nourietal.(2015)在柑橘木虱體內(nèi)也識(shí)別到了沃爾巴克噬菌體的序列(Wolbachia prophage WO) 。柑橘木虱體內(nèi)還有合胞體共生菌(Syncytium endosymbiont)、里奧夸爾托病毒(Mal de Rio Cuarto virus, MRCV)、褐飛虱呼腸孤病毒(Nilaparvata lugens reovirus, NLRV)、噬菌體S-RSM4 (Synechococcus phage S-RSM4)和Al DNA(Tokyovirus Al DNA)(Hert,2008)。但這些共生微生物，特別是內(nèi)共生病毒對柑橘木虱的影響尚不清楚。

新一代測序技術(shù)(next generation sequencing，NGS)具有快速、高靈敏度、高通量等特點(diǎn)，大大推動(dòng)了病毒研究的進(jìn)程。NGS可以在不知道病毒生物學(xué)、血清學(xué)特性和基因組信息的情況下快速檢測未知病毒。通過大量的NGS數(shù)據(jù)分析，可以獲得病毒基因組變異、準(zhǔn)種重建、進(jìn)化和宿主內(nèi)起源(Ho & Tzanetakis,2014; Houetal.,2011)。高通量測序技術(shù)不僅能夠檢測到生物體內(nèi)絕大部分含量低的病毒基因，而且不需要對病毒進(jìn)行分離富集，避免了不可培養(yǎng)病毒信息的丟失。該技術(shù)的出現(xiàn)突破了傳統(tǒng)病毒診斷技術(shù)對新病毒鑒定的局限性,創(chuàng)新了發(fā)現(xiàn)和鑒定未知病毒的方法，促進(jìn)了病毒檢測鑒定領(lǐng)域的發(fā)展(Nourietal.,2018)。高通量測序技術(shù)已在病毒種類多樣性和發(fā)現(xiàn)新病毒等方面被廣泛應(yīng)用，對系統(tǒng)研究樣本所攜帶病毒的多樣性和遺傳進(jìn)化有重要意義(Liuetal.,2011; Nachappaetal.,2012)。

為探索柑橘木虱共生微生物的多樣性，本研究利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)和小RNA深度測序技術(shù)，對福建省田間自然種群所攜帶的共生微生物進(jìn)行分析鑒定，獲得了若干個(gè)柑橘木虱共生微生物序列。根據(jù)序列的差異，區(qū)分出攜帶不同共生微生物的柑橘木虱種群。為了解釋內(nèi)共生病毒對柑橘木虱的影響，本研究進(jìn)一步測定了柑橘木虱在不同共生微生物影響下的單雌總產(chǎn)卵量、單雌日產(chǎn)卵量、單雌壽命和單雌存活率，以揭示柑橘木虱內(nèi)共生病毒對宿主昆蟲種群的綜合影響。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

柑橘木虱采自福建農(nóng)林大學(xué)校園和福州市晉安區(qū)日溪柑橘園，于實(shí)驗(yàn)室人工氣候箱內(nèi)用九里香MurrayaexoticaL.分別培養(yǎng)，建立種群。培養(yǎng)條件為溫度 25 ℃、光周期L∶D=16∶8、相對濕度60%～70 %。

1.2 總RNA提取與質(zhì)檢

從2個(gè)種群中分別選取20頭柑橘木虱成蟲，用液氮冷凍研磨后，用Trizol 法提取總RNA。分別用瓊脂糖凝膠電泳和Nano Photometer spectrophotometer 檢測RNA的純度，檢測合格后送至北京諾禾致源生物信息科技有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組和siRNA文庫構(gòu)建和測序。

1.3 轉(zhuǎn)錄組拼接和功能基因注釋

測序得到的原始數(shù)據(jù)去除序列接頭、ploy-N 和低質(zhì)量序列，獲得高質(zhì)量的clean data，同時(shí)計(jì)算Q20、Q30和GC含量。再利用Trinity 軟件進(jìn)行組裝。使用BLAST 軟件將組裝得到的unigenes在七大數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，獲得功能基因的注釋信息。

1.4 含和不含7種內(nèi)共生病毒的柑橘木虱種群的人工建立

由于2個(gè)種群的內(nèi)共生微生物種類存在差異，為了建立只在內(nèi)共生病毒上存在差異的2個(gè)種群，參照Chenetal.(2015，2019)的方法，將源于福建農(nóng)林大學(xué)校園的柑橘木虱冷凍麻痹，用0.01 mol·L-1His-MgCl2(pH 6.2) 緩沖液研磨,用0.22 μm濾頭過濾上清液中的雜質(zhì)、細(xì)菌和真菌，制備病毒粗提液。

應(yīng)用顯微注射技術(shù)，按64 nL·頭-1的劑量，將病毒粗提液注射于采自晉安區(qū)日溪柑橘園的柑橘木虱，并飼養(yǎng)至下一代。用RT-PCR方法確定注射種群中7種內(nèi)共生病毒的穩(wěn)定存在，確認(rèn)注射種群與未注射的種群在內(nèi)共生微生物上只存在7種內(nèi)共生病毒的差別。將注射的種群命名為“注射組”，將未被注射的種群命名為“未注射組”，用于下一步試驗(yàn)。

1.5 成蟲產(chǎn)卵量和壽命的測定

分別收集注射組與未注射組的40頭新羽化的雌蟲，用單雌單苗法測試2個(gè)種群的產(chǎn)卵能力和壽命。具體方法如下：

采集九里香嫩稍，單株插入盛滿水的EP管中，用Parafilm membrane封口，制備單苗食源。將每個(gè)食源放入50 mL的玻璃試管中，并放入1頭雌蟲和1頭雄蟲。用捕蟲紗網(wǎng)封口離心管。每頭雌蟲編號。

每隔3 d觀察雌蟲的存活情況，做好記錄，并回收取食過的食源。對存活的雌蟲，更換新鮮食源，并及時(shí)補(bǔ)充雄蟲。顯微鏡下統(tǒng)計(jì)回收食源上的卵粒數(shù)，并記錄。重復(fù)上述操作，直至雌蟲死亡。

1.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Excel軟件處理分析。用Graphpad 6.0軟件中雙尾t檢驗(yàn)分析所有重復(fù)數(shù)據(jù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差值。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組序列分析和組裝

利用Illumina測序平臺(tái)對柑橘木虱轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序，組裝獲得的clean reads，共有57441個(gè)轉(zhuǎn)錄本(transcripts)，序列信息達(dá)到107700364 bp，平均長度1205 bp，N50長度為3123 bp。在轉(zhuǎn)錄本基礎(chǔ)上進(jìn)一步組裝獲得22742條功能基因(unigenes)，長度為39029359 bp，N50長度為2838 bp。其中，長度超過1 kb 的unigenes有11612條，占51.06%。

2.2 基因功能注釋

在組裝獲得的22742條 unigenes中，成功注釋17673條，注釋率為77.71%。其中，NR注釋到的unigenes基因中，相似性在95%以上的基因占26.8%。從匹配的物種來源分析，柑橘木虱轉(zhuǎn)錄組測序拼接的unigenes與Genbank數(shù)據(jù)庫的柑橘木虱unigenes相似性最高，達(dá)到67.7%；其次與煙粉虱BemisiatabaciGennadius、褐飛虱NilaparvatalugensSt?l和濕木白蟻ZootermopsisnevadensisHagen等的相似性分別為5.9%、3.2%和2.5%；另外與其他物種同源的基因占17.0%。

2.3 基因功能分類

柑橘木虱轉(zhuǎn)錄組中，有29893條(48.19%)unigenes被GO注釋至生物學(xué)過程(biological process)的26個(gè)功能亞類；13076條(21.08%)unigenes注釋至分子功能(molecular function)；19066條(30.73%)unigenes歸屬于細(xì)胞組分(cellular component)的10個(gè)功能亞類(圖1)。

在生物學(xué)過程中，注釋至細(xì)胞過程(cellular process， GO: 0009987)的unigenes數(shù)量最多，為6214條(20.78%)；注釋到代謝過程(metabolic process， GO: 0008152)的unigenes數(shù)量較多，為5322條(17.80%)；注釋到單生物過程(single-organism process， GO: 0044699)的unigenes為4870條(16.29%)；其余均在4000條以下，其中注釋至行為(behavior， GO: 0007610)、節(jié)律性過程(rhythmic process， GO: 0048511)和解毒過程(detoxification， GO: 0098754)的unigenes 僅有17(0.06%)、13(0.04%)和7條(0.02%)。

分子功能類型中，注釋至蛋白結(jié)合活性(binding， GO: 0005488)和催化活性(catalytic activity， GO: 0003824)的unigenes分別有6148 (47.02%)和4344條(33.22%)；注釋至轉(zhuǎn)運(yùn)活性(transporter activity， GO： 0005215)的unigenes達(dá)1041條(7.96%)；其余功能亞類均在400條以下，其中，被注釋至金屬伴侶蛋白活性(metallochaperone activity， GO： 0016530)的unigenes僅有5條(0.04%)。

細(xì)胞組分功能類型中，注釋至細(xì)胞(cell， GO： 0005623)和細(xì)胞部分(cell part， GO： 0044464)的unigenes均為4507條(23.63%)；注釋至細(xì)胞器(organelle， GO： 0043226)、大分子復(fù)合物(macromolecular complex, GO: 0032991)、細(xì)胞膜(membrane， GO： 0016020)、細(xì)胞膜部分(membrane part， GO： 004 4425)和細(xì)胞器部分(organelle part， GO： 00444 22)的unigenes分別為2493 (13.08%)、2240 (11.75%)、2279 (11.95%)、2119 (11.11%)和1370條(7.19%)；其余被注釋的功能亞類均在1000條以下。

2.4 內(nèi)共生病毒的分析

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組和siRNA拼接序列的基因注釋進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在福建農(nóng)林大學(xué)種群中，共有15種病毒的核酸序列，福州晉安區(qū)日溪柑橘園種群中，共有11種病毒的核酸序列，并且這些序列可以在柑橘木虱體內(nèi)復(fù)制。其中，2個(gè)種群有相同的病毒8種，包括Canarypox virus、Choristoneura occidentalis granulovirus、Diaphorina citri densovirus、Lactococcus phage bIL312、Diaphorina citri retrovirus、Shamonda virus、Synechococcus phage S-CBS1和Wolbachia phage WO；福建農(nóng)林大學(xué)種群有7種單獨(dú)的病毒Hubei tick virus 2、NLRV、MRCV、Synechococcus phage S-RSM4、Tokyovirus A1 DNA、DcRV、DcPLV isolate BR1，福州晉安區(qū)日溪柑橘園種群有3種單獨(dú)的病毒Pandoravirus dulcis、Diaphorina citri bunyavirus和Prochlorococcus phage P-SSM3。

用RT-PCR方法擴(kuò)增了福建農(nóng)林大學(xué)種群7種單獨(dú)的病毒的序列(圖2)，并測序，確認(rèn)序列的存在和正確性。

2.5 7種內(nèi)共生病毒對柑橘木虱產(chǎn)卵能力的影響

為分析福建農(nóng)林大學(xué)校園柑橘木虱種群7種內(nèi)共生病毒對柑橘木虱繁殖力和存活力的影響，將提自該種群的病毒粗提液注射到福州晉安區(qū)日溪柑橘園的柑橘木虱體內(nèi)。待下一代成蟲羽化后，應(yīng)用PCR或RT-PCR確認(rèn)這7種內(nèi)共生病毒可在柑橘木虱種群內(nèi)穩(wěn)定地垂直傳播，從而確立種群，并命名為“注射組”。將未注射的福州晉安區(qū)日溪柑橘園的柑橘木虱種群命名為“未注射組”。

用單雌單苗法統(tǒng)計(jì)注射組和未注射組柑橘木虱的產(chǎn)卵量。研究發(fā)現(xiàn)，注射組產(chǎn)卵量總體低于未注射組的產(chǎn)卵量。在產(chǎn)卵第12、18、21、24和27 天，注射組的3日平均產(chǎn)卵量顯著低于未注射組(圖3A)；注射組的單雌總產(chǎn)卵量顯著低于未注射組，說明7種內(nèi)共生病毒可顯著降低單雌總產(chǎn)卵量(圖3B)；注射組的單雌日產(chǎn)卵量、單雌壽命與未注射組的無顯著差異(圖3C、D)，說明7種內(nèi)共生病毒對單雌日產(chǎn)卵量及雌蟲壽命無顯著影響。

3 討論

本研究初步明確了柑橘木虱體內(nèi)基因功能的種類。將全部unigenes序列與七大數(shù)據(jù)庫進(jìn)行功能注釋，獲得的17673條unigenes(77.71%)成功被注釋，仍有50696條(22.29%)未被注釋，其原因可能是由于unigenes較短，未與公共數(shù)據(jù)庫中的序列比對上(孟翔等，2016)，也有可能是存在很多功能未知的新基因(Ho & Tzanetakis,2014)。與NR數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，結(jié)果表明,與柑橘木虱同源序列最多。

圖2 擴(kuò)增7種內(nèi)共生病毒基因組序列片段 的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.2 Agarose gel electrophoresis of partly genomic sequences of 7 viral endosymbionts M: Marker; 1: DcRV; 2: NLRV; 3: MRCV; 4: Hubei tick virus 2; 5: Synechococcus phage S-RSM4; 6: DcPLV isolate BR1; 7: Tokyovirus A1 DNA.

圖3 注射組和未注射組的雌蟲產(chǎn)卵量和單雌壽命統(tǒng)計(jì)分析Fig.3 Analysis of female fecundity and lifespan of injected group and uninjected group A: 3日平均產(chǎn)卵量;B:單雌總產(chǎn)卵量;C:單雌日產(chǎn)卵量;D:單雌壽命分析。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；ns:差異不顯著。 A: Average number of eggs laid every 3 days; B: Total number of eggs laid by per female; C: Average number of eggs laid per day; D: Average lifespan of female.*p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001; ns: The indicators are not significantly different (p>0.05).

GO功能富集結(jié)果顯示，柑橘木虱參與生物進(jìn)程的unigenes最多，其中前3個(gè)類別分別是細(xì)胞、代謝和單生物進(jìn)程。在分子功能中，unigenes 數(shù)量最多的3個(gè)類別是結(jié)合、催化和轉(zhuǎn)運(yùn)活性。與白背飛虱SogatellafurciferaHovarth(鄧瑤等,2018)和煙粉虱(邵若玄,2017)的研究結(jié)果較一致，與攜帶馬鈴薯斑馬病菌CandidatusLiberibactersolanacearum和未攜帶病菌的馬鈴薯木虱BactericeracockerelliSulc轉(zhuǎn)錄組的聚類結(jié)果一致(Hurst & Hutchence,2010)。

對siRNA序列分析和拼接發(fā)現(xiàn)，采集自福建農(nóng)林大學(xué)和福州日溪柑橘園的2個(gè)種群中含有8種相同和10種不同的內(nèi)共生病毒種類。且siRNA的存在證明這些病毒在柑橘木虱體內(nèi)是可以增殖的活病毒，并且能引起柑橘木虱RNA沉默的抗病毒反應(yīng)。根據(jù)傳統(tǒng)的病原物過濾方法，用0.22 μm的濾頭過濾上清液中的細(xì)菌、真菌和雜質(zhì)，可以獲得活病毒(Chenetal.,2015，2019)。用顯微注射法將病毒接種柑橘木虱，是遵循病理學(xué)的柯赫氏法則：將提自帶病宿主的病原物回接至無病宿主。雖然顯微注射過程會(huì)導(dǎo)致當(dāng)代少部分柑橘木虱的機(jī)械死亡，但是用于研究成蟲產(chǎn)卵量和壽命的是被注射蟲的下一代，因此,應(yīng)用顯微注射的方法對本研究的數(shù)據(jù)影響較小。而接種的病毒與原病毒是否有拮抗作用或相互促進(jìn)作用的可能性，還有待分子生物學(xué)層面的進(jìn)一步研究。

病毒與昆蟲的共生關(guān)系十分普遍，它們對宿主的生長發(fā)育不產(chǎn)生明顯的負(fù)面影響，還能提高宿主昆蟲免疫、繁殖能力(Roossinck，2008)。這種關(guān)系是它們長期共同進(jìn)化、相互作用的結(jié)果。認(rèn)識(shí)昆蟲的內(nèi)共生病毒，有助于了解宿主的免疫耐受機(jī)制，或是病毒逃避宿主免疫的機(jī)制。內(nèi)共生病毒在進(jìn)化上具有重要意義，它們改變和塑造宿主的基因組，對物種的形成分化至關(guān)重要。寄生蜂LeptopilinaboulardiBarbotin,Carton and Kelner-Pillault體內(nèi)的內(nèi)源病毒Lpopli系組Boulardi filamentous virus (LbFV)能影響雌性果蠅的行為，感染LbFV病毒的雌蟲更容易被誘發(fā)超寄生現(xiàn)象，受病毒感染的雌性產(chǎn)下的后代明顯比無毒雌蟲多(Varaldietal.,2015)。攜帶內(nèi)共生病毒Pteromalus puparum negative strand RNA virus 1 (PpNSRV-1) 的寄生蜂，成蟲壽命明顯長于不攜帶該病毒的昆蟲，并且該病毒能夠改變后代的性別比例，使雄性后代比例增多(Wangetal., 2017)。棉鈴蟲被densovirus(HaDNV-1)侵染后幼蟲生長速率加快，幼蟲孵化率、雌蟲生長發(fā)育和壽命提高，說明該共生微生物有利于宿主昆蟲的自然繁殖(Xuetal.，2014)。果蠅種群被果蠅C病毒Drosophila C virus (DCV)、Cricket paralysis virus (CrPV)和Flock house virus (FHV)侵染后，攜帶共生微生物Wolbachia的果蠅壽命明顯長于沒有攜帶共生微生物的果蠅(Hedgesetal.,2008)。本研究發(fā)現(xiàn)，7種內(nèi)共生病毒DcRV、Hubei tick virus 2、NLRV、MRCV、Synechococcus phage S-RSM4、Tokyovirus A1 DNA和DcPLV isolate BR1可顯著降低柑橘木虱雌蟲群體總產(chǎn)卵量，但是對單雌日產(chǎn)卵量以及單雌壽命無影響，說明柑橘木虱的內(nèi)共生病毒影響了宿主的繁殖力。但是這種影響機(jī)制和途徑目前尚不清楚，亟待進(jìn)一步研究。