陳 睿， 高燁宏， 趙學(xué)楠， 楊敏儀， 吳惠娟， 王榮智， 汪世華

生物農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建省病原真菌與真菌毒素重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002

石房蛤毒素(saxitoxin， STX)是一種毒素極強(qiáng)的胍胺類神經(jīng)毒素，為麻痹性貝類毒素(paratic shellfish position)的主要成分之一，該毒素主要來(lái)源于海水或淡水中的膝溝藻、海洋甲藻、淡水藍(lán)藻等有害浮游生物，通過(guò)食物鏈積累于蛤類、貝類以及蟹類等水產(chǎn)中，哺乳動(dòng)物食用了這些被污染后的水產(chǎn)后，會(huì)引發(fā)呼吸麻痹、死亡等一系列中毒反應(yīng)(李淑冰等，2000)。STX對(duì)小鼠的半致死劑量LD50為10 μg·kg-1(陳常英等，1994)。STX在世界分布廣泛，在我國(guó)的山東、福建、廣東等地均發(fā)生過(guò)人類誤食STX污染的水產(chǎn)品后引發(fā)的中毒事件(孔凡洲等，2007)。因此,漁業(yè)生產(chǎn)中亟需一種簡(jiǎn)便、快速、靈敏的STX檢測(cè)方法。

目前，國(guó)際上用于檢測(cè)貝類毒素的方法主要為理化分析法和生物測(cè)定法。理化分析法包括高效液相色譜法(high performance liquid chromatography， HPLC)、液相色譜(liquid chromatograph-mass spectrometer， LC-MS)、分光光度法、免疫化學(xué)法。其中，較常用的HPLC能精確測(cè)定毒素的種類和含量，但樣品前處理較繁瑣且需要昂貴的儀器(馬燕玲，2013)。生物測(cè)定法包括小鼠生物測(cè)定法(mouse bioassay， MBA)、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(enzyme-linked immunosorbnent assay， ELISA)、家蠅生物分析法(house-fly biassay)、蝗蟲生物分析法(locust bioassay， LBA)、神經(jīng)細(xì)胞生物分析法(neurional bioassay)等。其中,MBA是國(guó)際上較通用的方法，該方法方便、快捷且成本低廉，但測(cè)定結(jié)果受小鼠個(gè)體的影響較大，誤差大、重現(xiàn)性差，不能分析樣品中的具體組分；ELISA簡(jiǎn)便、快速、靈敏、成本低，同MBA及HPLC相比，更快速經(jīng)濟(jì)，以滿足大批量樣品快速篩查的需要(Zhietal.，2018)。目前，我國(guó)對(duì)STX的研究較少。本試驗(yàn)通過(guò)2種不同的方法，使用微量的STX制備了多種STX多克隆抗體，并采用酶聯(lián)免疫分析對(duì)其效價(jià)進(jìn)行比較，以期為商業(yè)化生產(chǎn)多克隆抗體提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 Balb/c小鼠(雌性6周齡)購(gòu)買于吳氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物貿(mào)易有限公司。

1.1.2 試劑 STX毒素標(biāo)準(zhǔn)品由臺(tái)灣Algalchem公司提取，雞卵清白蛋白(ovalbumin， OVA)購(gòu)于源葉生物公司，牛血清白蛋白(bovine serum albumin， BSA)購(gòu)于翊圣生物公司，鑰孔血藍(lán)蛋白(keyhole limpet hemocyanin， KLH)、高碘酸鈉和硼氫化鈉購(gòu)于Macklin公司。弗氏完全佐劑(complete freunds adjuvant， CFA)和弗氏不完全佐劑(incomplete freunds adjuvant， IFA)購(gòu)于SIGMA公司。N-羥基琥珀酰亞胺(N-hydroxysuccinimide， NHS)購(gòu)于Aladdin公司。1-(3-二甲基氨丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride， EDC)購(gòu)于梯希愛(ài)(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司，辣根過(guò)氧化物標(biāo)記的山羊抗鼠IgG購(gòu)于Bioss公司。

1.2 方法

1.2.1 完全抗原的制備及分析 EDC法:將0.09 mmol·L-1NHS和0.09 mmol·L-1EDC分別加入裝有450 μL二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide， DMSO)的1.5 mL EP管中，分別制備3管，用移液槍吹打溶解，并用錫紙包裹管身，分別加入50 μL STX標(biāo)準(zhǔn)品，固定于25 ℃恒溫?fù)u床中，轉(zhuǎn)速120 r·min-1混合12 h。取出置于常溫離心機(jī)中12000 r·min-1離心10 min，取上清備用。將20 mg的OVA、BSA、KLH蛋白分別溶于10 mL ddH2O中(pH6.5)，并用NaHCO3緩沖液(0.5 mol·L-1，pH9.6)將pH調(diào)至7，最后每種蛋白取5 mL分裝3個(gè)10 mL EP管中備用。將上清分別緩慢加入制備好的3種蛋白溶液中，固定于25 ℃恒溫?fù)u床中，轉(zhuǎn)速120 r·min-1振蕩12 h，取上清，按順序用0.05 mol·L-1的(NH4)2CO3透析4 h，0.01 mol·L-1的(NH4)2CO3透析過(guò)夜，再換成新的0.01 mol·L-1的(NH4)2CO3透析4 h，最后ddH2O透析4 h，用PEG20000置于冰上濃縮至1～2 mL，置于-20 ℃保存(Meietal.，2019)。用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)分析。

高碘酸鹽法:將5 mg的OVA、BSA、KLH蛋白分別溶于1 mL ddH2O中，用0.1 mol·L-1的乙酸將pH調(diào)至4.4。將含有6.9 mg高碘酸鈉的0.3 mL ddH2O分別逐滴加入到配置好的蛋白溶液中，避光條件下反應(yīng)1 h，接著用乙酸鈉緩沖液(0.1 mol·L-1，pH4.4)透析，放置備用。將28 μL的STX加入到200 μL乙酸溶液(0.1 mol·L-1)中，混勻，分別制備3管，再分別加入到活化后的蛋白溶液中。用NaHCO3緩沖液(0.5 mol·L-1，pH9.6)將pH調(diào)至7.5。并在20 ℃條件下水浴1 h，分別加入0.1 mL NaBH4(4 mg·mL-1)。最后在4 ℃下孵育20 min，并分別用PBS透析3次，每次4 h，再用ddH2O透析4 h，用PEG20000置于冰上濃縮至1～2 mL，置于-20 ℃保存(Christineetal.，1995)。用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)分析。

1.2.2 試驗(yàn)小鼠的免疫 分別以EDC法和高碘酸鹽法制備的STX-BSA、STX-KLH為免疫原，分別免疫6周齡健康的Balb/c雌性小鼠，共免疫3組。首次免疫，將200 μg的免疫原用PBS稀釋至500 μL，與等體積500 μL的弗式完全佐劑混合，并用乳化儀乳化成乳濁液，在小鼠皮下多點(diǎn)注射(劉帥帥等，2011)。之后每隔14 d，將100 μg免疫原用400 μL的PBS稀釋，再與等體積500 μL的弗式不完全佐劑混合，并用乳化儀乳化成乳濁液，在小鼠皮下多點(diǎn)注射。

1.2.3 多克隆血清的獲取 間隔1～2個(gè)免疫周期，用扎取小鼠尾部靜脈血管的方法，取小鼠尾部靜脈血進(jìn)行血清效價(jià)測(cè)定。待小鼠免疫7次后，摘小鼠眼球取血，取血完畢后脫臼處死(王月英等，2007)。取得的血液置于37 ℃恒溫水浴鍋中30 min，再于4 ℃冷凍離心機(jī)中，12000 r·min-1離心30 min。取上層血清，加入體積甘油混勻，置于-20 ℃保存。

1.2.4 ELISA檢測(cè)多克隆抗體的效價(jià) 分別將EDC法和高碘酸鹽法制備的STX-OVA為檢測(cè)原，用包被緩沖液(pH9.6)稀釋到10 mg·mL-1，在高效價(jià)的96孔酶標(biāo)板上每孔加入100 μL，37 ℃孵育2 h。取出棄掉殘液，拍干，每孔加入200 μL PBSM封閉液，4 ℃封閉過(guò)夜。取出棄掉封閉液，用PBS洗滌3次，拍干，再用PBST洗滌3次，拍干，放置于4 ℃冰箱備用。將多抗血清與PBSM按照1∶500、1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000、1∶16000、1∶32000、1∶64000的比例稀釋混勻，每孔100 μL按順序加入包有相應(yīng)檢測(cè)原的酶標(biāo)孔中，將PBSM加入2孔包有檢測(cè)原的酶標(biāo)孔中為陰性對(duì)照。37 ℃孵育1 h，取出棄掉殘液，洗板操作同上，再加入稀釋比為1∶8000的HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG為二抗，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h，取出棄掉殘液，洗板操作同上，加入TMB顯色液，37 ℃ 孵育15 min，加入2 mol·L-1的H2SO4終止液，每孔50 μL (Caietal.，2021)。用酶標(biāo)儀測(cè)D450 nm的值，收集數(shù)據(jù)并分析。

1.2.5 2種抗原制備方法所制備出的抗原的差異比較 分別將EDC法和高碘酸鹽法制備的STX-OVA用包被緩沖液(pH9.6)稀釋到10 μg·mL-1作為包被原，在高效價(jià)的96孔酶標(biāo)板上每孔加入100 μL，其后的操作同1.2.4。

2 結(jié)果與分析

2.1 完全抗原的制備及分析

2.1.1 EDC法制備完全抗原與分析 利用EDC法制備STX-BSA、STX-OVA和STX-KLH。將BSA與STX-BSA完全抗原和OVA與STX-OVA分別進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳和紫外光譜掃描分析。在瓊脂糖凝膠電泳中，STX-BSA完全抗原與BSA蛋白相比，由于其分子質(zhì)量更大，遷移率較低，說(shuō)明成功制備了STX-BSA完全抗原。通過(guò)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)STX、BSA和STX-BSA完全抗原的光譜，STX-BSA完全抗原的波峰同BSA和STX的波峰相比，出現(xiàn)紅移，佐證了STX-BSA完全抗原的成功制備(圖1A、B)。圖1C、D中，STX-OVA完全抗原的遷移率比OVA蛋白低，且STX-OVA完全抗原的波峰同OVA和STX的波峰相比，出現(xiàn)紅移，說(shuō)明STX-OVA成功制備。用同樣的方法也成功制備了STX-KLH的交聯(lián)物。

圖1 EDC法交聯(lián)STX的瓊脂糖凝膠電泳和紫外光譜掃描Fig.1 Agrosegel electrophoresis and UV-vis analysis of STX conjugates by EDC A：泳道1為BSA，泳道2為STX-BSA交聯(lián)產(chǎn)物；B：STX、BSA和STX-BSA交聯(lián)產(chǎn)物紫外光譜掃描圖; C：泳道3為OVA，泳道4為STX-OVA交聯(lián)產(chǎn)物;D：STX、OVA和STX-OVA交聯(lián)產(chǎn)物紫外光譜掃描圖。 A: Lane 1 is BSA protein, lane 2 is STX-BSA conjugates; B: UV-vis analysis of STX, BSA and STX-BSA conjugate； C: Lane 3 is OVA protein, lane 4 is STX-OVA conjugates; D: UV-vis analysis of STX, OVA and STX-OVA conjugate.

2.1.2 高碘酸鹽法制備完全抗原與分析 利用高碘酸鹽法制備STX-BSA、STX-OVA和STX-KLH。將BSA與STX-BSA完全抗原分別和OVA與STX-OVA進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳和紫外光譜掃描分析。在瓊脂糖凝膠電泳中，STX-BSA完全抗原與BSA蛋白相比,遷移率較低，說(shuō)明成功制備STX-BSA完全抗原。通過(guò)紫外光譜掃描檢測(cè)STX、BSA和STX-BSA完全抗原的光譜，STX-BSA完全抗原的波峰同BSA和STX的波峰相比，出現(xiàn)紅移，說(shuō)明STX-BSA完全抗原的成功制備(圖2A、B)。圖2C、D中，STX-OVA完全抗原的遷移率均比相應(yīng)的蛋白載體低，且波峰均出現(xiàn)紅移，說(shuō)明STX-OVA完全抗原的成功制備。用同樣方法也成功制備了STX-KLH的交聯(lián)物。

圖2 高碘酸鹽法交聯(lián)STX的瓊脂糖凝膠電泳和紫外光譜掃描Fig.2 Agrosegel electrophoresis and UV-vis analysis of STX conjugates by periodate reaction A：泳道1為BSA，泳道2為STX-BSA交聯(lián)產(chǎn)物；B：STX、BSA和STX-BSA交聯(lián)產(chǎn)物紫外光譜掃描圖; C：泳道3為OVA，泳道4為STX-OVA交聯(lián)產(chǎn)物;D：STX、OVA和STX-OVA交聯(lián)產(chǎn)物紫外光譜掃描圖。 A: Lane 1 is BSA protein, lane 2 is STX-BSA conjugates; B: UV-vis analysis of STX, BSA and STX-BSA conjugate； C: Lane 3 is OVA protein.Lane 4 is STX-OVA conjugates; D: UV-vis analysis of STX, OVA and STX-OVA conjugate.

2.2 多克隆抗體的效價(jià)測(cè)定

2.2.1 EDC法制備的完全抗原的效價(jià)測(cè)定 以STX-BSA和STX-KLH為免疫原，分別皮下免疫2只小鼠，得到多抗血清，進(jìn)行ELISA試驗(yàn)，用酶標(biāo)儀測(cè)效價(jià)。以STX-BSA為免疫原免疫小鼠，得血清效價(jià)圖3A,1號(hào)小鼠的效價(jià)最為明顯，血清滴度為1∶1000時(shí)，D450 nm為3.316；血清滴度為1∶8000時(shí)，D450 nm為0.06，獲得較高效價(jià)。而2號(hào)小鼠在各血清滴度下，D450 nm均為0.050左右，故以EDC法制備的STX-BSA為免疫原進(jìn)行皮下免疫的2只小鼠中，僅有1號(hào)小鼠能發(fā)生特異性免疫應(yīng)答。以STX-KLH為免疫原免疫小鼠得血清效價(jià)圖3B，1號(hào)小鼠與2號(hào)小鼠相比，能顯示出效價(jià)梯度，但血清滴度為1∶500時(shí)，D450 nm僅為0.596，說(shuō)明用EDC法制備的STX-KLH的完全抗原的效果并不理想。

圖3 EDC法制備的抗原免疫小鼠血清效價(jià)測(cè)定Fig.3 The titer assay of anti-serum with EDC method A:以STX-BSA為免疫原;B:以STX-KLH為免疫原。 A: Immunogen is STX-BSA; B: Immunogen is STX-KLH.

2.2.2 高碘酸鹽法制備的完全抗原的效價(jià)測(cè)定 分別以STX-BSA和STX-KLH為免疫原，皮下免疫3只小鼠，用STX-OVA作為檢測(cè)原免疫小鼠得到多抗血清進(jìn)行ELISA試驗(yàn)，用酶標(biāo)儀測(cè)效價(jià)。以STX -BSA為免疫原免疫小鼠可得得血清效價(jià)圖4A, 1 號(hào)和2號(hào)小鼠均隨著血清滴度增加表現(xiàn)出明顯的效價(jià)梯度:1號(hào)小鼠在血清滴度為1∶500 時(shí),D450 nm為 0.882,獲得 較高效價(jià);2號(hào)小鼠在血清滴度為1∶500 時(shí),D450 nm為0.452,血清滴度為1∶8000時(shí)，D450 nm為0.284，獲得效價(jià)。3號(hào)小鼠在各血清滴度下，D450 nm均為0.050左右，說(shuō)明3號(hào)小鼠沒(méi)有發(fā)生特異性免疫反應(yīng)。故以高碘酸鹽法交聯(lián)STX-BSA為免疫原進(jìn)行皮下免疫的3只小鼠中，1號(hào)和2號(hào)小鼠均能發(fā)生特異性免疫應(yīng)答，且1號(hào)小鼠多抗血清的效價(jià)較高。以STX-KLH為免疫原免疫小鼠得得血清效價(jià)圖4B，3只小鼠均隨著血清滴度增加表現(xiàn)出明顯的效價(jià)梯度：1號(hào)小鼠在血清滴度為 1∶ 500 倍 時(shí)，D450 nm為 1.856，獲得較高效價(jià)；2 號(hào)小鼠在血清 滴度為 1 ∶ 500時(shí)，D450 nm為 0.990，獲得效價(jià)；3 號(hào)小鼠在血清滴度為 1∶ 500 時(shí)，D450 nm為 0.488，在血清滴度為1:8000時(shí)，D450 nm為0.076，具有效價(jià)。故以高碘酸鹽法交聯(lián)STX-KLH為免疫原進(jìn)行皮下免疫的3只小鼠中，3只小鼠都發(fā)生特異性免疫應(yīng)答,其中1號(hào)小鼠多抗血清的效價(jià)較高。

圖4 高碘酸鹽法制備的抗原免疫小鼠血清效價(jià)測(cè)定Fig.4 The titer assay of anti-serum with periodate reaction A:以STX-BSA為免疫原;B:以STX-KLH為免疫原。 A: Immunogen is STX-BSA; B: Immunogen is STX-KLH.

2.2.3 2種制備方法所制備出的免疫原的差異 由上述試驗(yàn)結(jié)果可知，EDC法和高碘酸鹽法交聯(lián)的STX-BSA和STX-KLH完全抗原均可作為免疫原引起小鼠的特異性免疫應(yīng)答。比較這2種方法制備的完全抗原免疫小鼠后得到的多克隆抗體血清的效價(jià)差異，結(jié)果見(jiàn)表1。表中為免疫不同完全抗原后的4組小鼠與不同方法制備出的檢測(cè)原進(jìn)行ELISA試驗(yàn)，選取效價(jià)最高的1只進(jìn)行分析，比對(duì)D450 nm為1時(shí)的多克隆抗體血清的稀釋度。用EDC法交聯(lián)的STX-BSA免疫小鼠獲得多克隆抗體血清，與用EDC法交聯(lián)的STX-OVA為檢測(cè)原進(jìn)行間接ELISA試驗(yàn)，測(cè)得D450 nm為1時(shí)的抗體稀釋度最高，為4×103。此外，多克隆抗體血清對(duì)于不同交聯(lián)方法制備出的檢測(cè)原STX-OVA對(duì)多克隆抗體血清的檢測(cè)效果相似，證明EDC法和高碘酸鹽法制備出的STX-OVA交聯(lián)產(chǎn)物可作為通用的檢測(cè)原混用，同時(shí)證明這2種方法均能保留STX的主要結(jié)構(gòu)。

表1 不同的多克隆抗體對(duì)于檢測(cè)原的效價(jià)比較Table 1 Comparison of different polyclonal antibodies to titer of detective antigen

3 討論

STX為小分子半抗原，分子質(zhì)量為299 ku，在免疫反應(yīng)中沒(méi)有免疫原性，需要與分子質(zhì)量大的載體蛋白交聯(lián)制備成完全抗原才能進(jìn)行免疫。常用的載體蛋白有OVA、BSA和KLH等。本試驗(yàn)僅用了少量的STX通過(guò)2種交聯(lián)方法成功制備了6種STX的完全抗原，并通過(guò)免疫小鼠獲得抗STX的多克隆抗體，對(duì)其進(jìn)行了間接ELISA試驗(yàn)，比較了不同免疫原制備的多克隆抗體的差異。對(duì)比2種交聯(lián)方法，EDC法先是通過(guò)EDC活化STX上的酰胺基團(tuán)，接著NHS替換了活化后的酰胺基團(tuán)，最讓其與蛋白載體產(chǎn)生縮合反應(yīng)，從而交聯(lián)。高碘酸鹽法中高碘酸鈉為氧化劑，先將STX上的惰性羥基氧化為醛基形成中間產(chǎn)物，再通過(guò)硼氫化鈉還原劑，除去多余高碘酸鈉的同時(shí)，讓中間產(chǎn)物與蛋白交聯(lián)。2種方法的交聯(lián)產(chǎn)物雖然在結(jié)構(gòu)上略有差別，但制備的完全抗原均具有免疫原性，證明這2種交聯(lián)方法并未影響STX的結(jié)構(gòu)。通過(guò)對(duì)比交聯(lián)出的免疫原所制備出的多克隆抗血清的效價(jià)發(fā)現(xiàn)，EDC法更具優(yōu)勢(shì)。

對(duì)比不同的蛋白載體，BSA來(lái)源于牛血清，為一種可溶性良好且穩(wěn)定的一種蛋白載體。KLH來(lái)源于軟體動(dòng)物，與哺乳動(dòng)物的親緣性較遠(yuǎn)，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，2種交聯(lián)方法均能讓STX與BSA載體蛋白交聯(lián)，從而使免疫小鼠產(chǎn)生免疫應(yīng)答，但是從免疫效果來(lái)看，與BSA交聯(lián)的完全抗原能產(chǎn)生更高的效價(jià)，因此，BSA更適合作為STX的蛋白載體。

本試驗(yàn)的結(jié)果表明，在石房蛤毒素完全抗原的制備中，在交聯(lián)方法的選擇上，EDC法較高碘酸鹽法更具優(yōu)勢(shì)；而在免疫原的選擇上，STX-BSA完全抗原效果最好。該結(jié)果可為商業(yè)化批量生產(chǎn)STX多克隆抗體提供一定的數(shù)據(jù)支撐。