李愛梅， 付開赟， 丁新華， 何 江， 吐爾遜·阿合買提， 馮宏祖*， 郭文超

1塔里木大學植物科學學院，新疆 阿拉爾 843300； 2新疆農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部 西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830091； 3新疆農(nóng)業(yè)科學院 微生物應用研究所/新疆特殊環(huán)境微生物重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830091

南美番茄潛葉蛾Tutaabsoluta(Meyrick)，別名番茄潛葉蛾、番茄潛麥蛾、番茄麥蛾，屬鱗翅目Lepidoptera麥蛾科Gelechiidae，原產(chǎn)于南美洲的秘魯，是世界性的檢疫入侵害蟲(李棟等，2019)。該蟲的傳播速度快，截至2021年2月11日，已入侵105個國家(南美洲10個、北美洲3個、歐洲31個、非洲35個、亞洲26個)，成為世界性番茄SolanumlycopersicumL.的重要害蟲。在我國，新疆伊犁、云南臨滄、貴州、四川、廣西、湖南及江西等地，相繼發(fā)現(xiàn)該蟲危害(陸永躍，2021)。在云南省彌渡縣，大棚里的番茄植株被害率高達100%，果實被害率達19.33%，最高可達40%(尹艷瓊等，2021)。番茄潛葉蛾的寄主范圍較廣，可危害包括茄科、豆科、錦葵科、莧科、旋花科、藜科、菊科、十字花科以及禾本科在內(nèi)的近40種植物，但主要危害茄科植物，特別嗜食番茄(包括鮮食番茄、加工番茄和櫻桃番茄/圣女果)(Camposetal.,1976; Cisneros & Mujica,1998; Pereyra & Sánchez,2006)。番茄潛葉蛾幼蟲潛入葉片并取食葉肉，還會鉆入果實內(nèi)危害，成蟲喜在植株幼嫩的葉片上產(chǎn)卵，但隨著該植株的危害程度加劇，產(chǎn)卵偏好有所減弱(阿米熱·牙生江等，2021)。番茄潛葉蛾具有很高的生物潛能，對不同氣候條件的適應性等方面存在差異(Vargas，1970)，可能存在著更深層次的分化。但關于我國番茄潛葉蛾的種群分化以及遺傳多樣性的研究還未見報道。

近些年，隨著分子生物學技術、分子標記種類及其監(jiān)測技術的不斷發(fā)展，ISSR(簡單重復序列區(qū)間 inter simple sequence repeat)分子標記方法由于操作簡單、成本較低、耗時短等,已成為物種遺傳變異監(jiān)測的重要方法之一(Camposetal.,2017)，被廣泛應用于鑒定種資資源、篩選稀有品種以及探索各種群遺傳多樣性等(Essadkietal.,2006; Guptaetal.,2008; Reddyetal.,2002)。

番茄潛葉蛾是農(nóng)業(yè)上的重要害蟲，該蟲的入侵直接導致在一個生長季節(jié)內(nèi)番茄地塊殺蟲劑的使用次數(shù)由12次突增到30次以上(張桂芬等,2018; Gontijoetal.,2013)，殺蟲劑的過度使用，導致該蟲對多種殺蟲劑產(chǎn)生了抗藥性。研究發(fā)現(xiàn)，殺蟲劑的使用可引起昆蟲遺傳多樣性及遺傳分化(褚棟等，2008)。新疆地區(qū)各地理種群的番茄潛葉蛾對不同類型的殺蟲劑產(chǎn)生了抗藥性，因此，對新疆地區(qū)不同地理種群的番茄潛葉蛾進行遺傳多樣性的研究有利于了解不同區(qū)域的番茄潛葉蛾基因及遺傳分化情況對不同地理種群的影響。然而，迄今為止有關新疆地區(qū)番茄潛葉蛾的基因流及遺傳分化情況的研究較少。本研究擬采用ISSR分子標記技術對所采集到的20個不同地理種群的番茄潛葉蛾進行遺傳多樣性分析，旨在明確不同地理環(huán)境下番茄潛葉蛾對其適應性引起的遺傳變化，為番茄潛葉蛾的綜合治理提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

番茄潛葉蛾樣品采自新疆喀什地區(qū)喀什市、伽師縣、疏附縣、巴楚縣、疏勒縣、葉城縣、莎車縣，伊犁特克斯縣、霍城縣、霍爾果斯市、伊寧市、新源縣、察布查爾縣，阿克蘇溫宿縣，阿拉爾市，阿克蘇市等地區(qū)及貴州省清鎮(zhèn)市，云南省昆明市、玉溪市，哈薩克斯坦阿拉木圖州等地，樣品采集后立即放入75%酒精中,-20 ℃保存。記錄20個地理種群的編號、采樣時間、地理位置、經(jīng)緯度、海拔高度及樣本數(shù)量大小。

1.2 DNA的提取

對采集的番茄潛葉蛾進行基因組DNA提取，提取方法按TaKaRa裂解液說明書進行操作。用濃度為2%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，使用B-500 BIOPHOTO METER(METASH)測定其濃度及純度，選取D260 nm/D280 nm值在1.7～1.9、濃度大于30 ng·mL-1的DNA樣品進行ISSR遺傳多樣性分析。

1.3 ISSR預實驗分析

1.3.1 引物篩選 根據(jù)預實驗，從哥倫比亞大學公布的第9套100條ISSR引物序列中共篩選出15條條帶清晰、多態(tài)性好的引物進行ISSR-PCR擴增反應實驗。

1.3.2 ISSR-PCR擴增 PCR反應體系(25 μL):2×Easy Taq PCR Super Mix 12.5μL、引物2 μL、模板DNA 1 μL、ddH2O 9.5 μL。PCR擴增條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，33～55 ℃(不同引物的退火溫度不一致)退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min；4 ℃下保存。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

電泳圖譜中的每一條帶均視為一個分子標記，代表一個等位基因位點。按凝膠同一位置上DNA條帶的有無進行統(tǒng)計，有條帶記為“1”，無條帶記為“0”，將所有個體在全部位點上構成1個(0或1)矩陣模型。在得到ISSR 原始數(shù)據(jù)矩陣后，將矩陣導入軟件中，利用POPGENE 32軟件計算各種群的遺傳參數(shù)，計算各群體的有效等位基因數(shù)Ne、Nei′s基因多樣性指數(shù)H、Shannon信息多樣性指數(shù)I、多態(tài)位點比率、群體內(nèi)基因多樣度Hs、總基因多樣度Ht、2種群或亞種群間的遺傳分化系數(shù)Gst(Gst=Ht-Hs/Ht)，以及基因流Nm=(1-Gst)/Gst等參數(shù)(張桂芬等，2020)。根據(jù)Nei′s遺傳距離的分析結果，利用NTSYS 2.1軟件對其進行UPGMA聚類分析，根據(jù)所讀取的數(shù)據(jù)分析相應的結果。

2 結果與分析

2.1 番茄潛葉蛾種群DNA的ISSR擴增結果

根據(jù)預實驗結果，得出各引物的最佳退火溫度(表1)，再用各引物對不同地理種群進行ISSR擴增(圖1)。利用15條ISSR引物對20個種群297頭番茄潛葉蛾的DNA進行擴增，共得到137條可統(tǒng)計的條帶，平均每條引物擴增了9.133條條帶，其中引物857、885擴增的條帶數(shù)最高，為13條，引物818擴增出的條帶數(shù)最少，為6條；各引物擴增出的多態(tài)性條帶及其占比存在差異，多態(tài)性條帶占比最大的是引物807、808、811、812、826、827、856、857、868、872、886，為100%。最小的為引物885，為84.62%。不同種群的每個個體都呈現(xiàn)出唯一的ISSR基因型，說明ISSR分子標記對番茄潛葉蛾有較高的鑒別效率，也說明番茄潛葉蛾的個體間存在較大的遺傳變異。這些位點在各個地理種群中分布不平衡，從番茄潛葉蛾20個種群的多態(tài)位點占比中可看出，番茄潛葉蛾的遺傳多樣性較豐富。

表1 ISSR擴增中引物退火溫度及多態(tài)性條帶Table 1 Primer annealing temperature and polymorphic bands in ISSR amplification

圖1 引物827對察布查爾縣種群DNA的ISSR擴增圖Fig.1 ISSR amplification map of primer 827 on the DNA of Qapqal County population M： DL2000 plus DNA marker；1～24：均為察布查爾縣樣品。 M： DL2000 plus DNA marker; 1-24: Samples from Qapqal County.

2.2 番茄潛葉蛾種群的遺傳多樣性分析

從表2可知，20個番茄潛葉蛾種群的多態(tài)性位點比率在31.30%～93.13%，平均多態(tài)性位點比率為58.28%。察布查爾縣(CBCE)地理種群多態(tài)性位點占比最高(93.13%)，多態(tài)性條帶多達13條，特克斯縣(TKS)地理種群多態(tài)位點占比最低(31.30%)。從地理空間分布上看，中國南方地區(qū)部分番茄潛葉蛾種群(GZ、YNYX、YNKM)的多態(tài)性位點占比低于北方地區(qū)種群(KS、JS、SF、CBCE)。特克斯縣(TKS)的Nei′s基因多樣性指數(shù)(0.1153)最小，察布查爾縣(CBCE)的Nei′s基因多樣性指數(shù)(0.2531)最大，說明中國南北方的各個地理種群Nei′s基因多樣性指數(shù)并無規(guī)律。特克斯縣(TKS)的番茄潛葉蛾種群的I(0.1719)最小，察布查爾縣(CBCE)種群的I(0.3976)最大，說明南北地區(qū)的番茄潛葉蛾種群遺傳多樣性較高。

表2 番茄潛葉蛾種群間的遺傳多樣性指數(shù)Table 2 Genetic diversity index among T. absoluta populations

2.3 番茄潛葉蛾種群遺傳分化及基因流

對番茄潛葉蛾種群內(nèi)遺傳分化進行分析，物種水平上的總基因多樣性(Ht)為0.2351，種群內(nèi)的遺傳分化系數(shù)(Hs)為0.1755。根據(jù)Nei′s基因多樣度算法，20個番茄潛葉蛾地理種群之間的的遺傳分化系數(shù)(Gst)為0.2536，說明變異來自不同的種群之間及種群內(nèi)部的個體間，占總變異的25.36%，有74.64%的變異來自于種群內(nèi)的個體之間。本研究檢測出番茄潛葉蛾物種水平上的基因流(Nm)為1.4716，表明番茄潛葉蛾各種群間的基因流存在一定的流動性。

2.4 遺傳一致度、遺傳距離及聚類分析

由表3可知，番茄潛葉蛾20個地理種群的遺傳一致性系數(shù)在0.8502～0.9935，其平均遺傳一致性系數(shù)為0.9329，察布查爾縣(CBCE)種群與特克斯縣(TKS)種群的遺傳一致性系數(shù)(0.8502)最小，疏附縣(SF)種群與伽師縣(JS)種群的遺傳一致性系數(shù)(0.9935)最大。通過對遺傳一致性的分析，說明所采集的各個地理種群間的遺傳一致性較高。

遺傳距離的大小反映了每個地理種群間彼此親緣關系的遠近，為確定番茄潛葉蛾20個地理種群間的遺傳關系，利用Nei′s無偏估計遺傳距離進行了計算(表 3)。20個番茄潛葉蛾種群的遺傳距離大小在0.0065～0.1623，其平均遺傳距離為0.0726，疏附縣(SF)種群與伽師縣(JS)種群間的遺傳距離最小，為0.0065，察布查爾縣(CBCE)種群與特克斯縣(TKS)種群的遺傳距離最大，為0.1623。表明番茄潛葉蛾不同地理種群之間，遺傳分化存在著一定程度上的差異，但這種差異比較小。

使用UPGMA方法對各個番茄潛葉蛾地理種群進行聚類分析，結果如圖2所示，當遺傳一致性系數(shù)為0.94時，20個地理種群的聚類分為5組，最先分出的是特克斯縣(TKS)、察布查爾縣(CBCE)、喀什市(KS)、新源縣(XY)，其余各地理為一組。其中:云南玉溪(YNYX)種群夾雜在新疆阿克蘇地區(qū)的地理種群中；哈薩克斯坦阿拉木圖州、云南、貴州、伊犁地區(qū)與喀什地區(qū)的部分地理種群交叉在一個分支里。在本研究中，番茄潛葉蛾的遺傳一致性較高，并未形成明顯的遺傳結構，同時各個地理種群間與地理空間并未體現(xiàn)出一致的關系。

圖2 20個番茄潛葉蛾地理種群間的聚類分析圖Fig.2 Cluster analysis of 20 geographical populations of T. absoluta KS：阿克蘇市;YNYX：云南省玉溪市;ALE：阿拉爾市;HEGS：霍爾果斯市;SL：疏勒縣;BC：巴楚縣;SF：疏附縣;JS：伽師縣;HSKST： 哈薩克斯坦阿拉木圖州;YNKM：云南省昆明市;WS：溫宿縣;YN：伊寧市;GZ：貴州省清鎮(zhèn)市;HC：霍城縣;SC：莎車縣; YC：葉城縣;XY：新源縣;KS：喀什市;CBCE：察布查爾縣;TKS：特克斯縣。 AKS: Aksu City; YNYX: Yuxi City, Yunnan Province; ALE: Alar City; HEGS: Horgos City; SL: Shule County; BC: Bachu County; SF: Shufu County; JS: Jiashi County; HSKST: Almaty Prefecture, Kazakhstan; YNKM: Kunming City, Yunnan Province; WS: Wensu County; YN: Yining City; GZ: Qingzhen City, Guizhou Province; HC: Huocheng County; SC: Shache County; YC: Yecheng County; XY: Xinyuan County; KS: Kashgar City; CBCE: Qapqal County; TKS: Tekes County.

3 討論與結論

一個物種目前現(xiàn)有的遺傳多樣性及遺傳結構是根據(jù)自身原因與所在的環(huán)境因素共同作用的結果,如地理分布、基因漂變、基因流、物種進化的歷史及交配系統(tǒng)等。就番茄潛葉蛾而言，該蟲于2006年入侵歐洲，目前已入侵世界上105個國家。該蟲繁殖力強、世代重疊嚴重、適應性強，可借助人類活動進行遠擴散，這些特征有助于番茄潛葉蛾各種群間的基因交流，減小了遺傳漂變的影響。

本研究所選取的番茄潛葉蛾種群來自于哈薩克斯坦阿拉木圖州、云南、貴州以及新疆喀什、阿克蘇、伊犁地區(qū)，其各個不同地理種群間的遺傳多樣性豐富及遺傳結構變異不大，造成這種差異的主要原因可能是番茄潛葉蛾入侵我國時間尚短，可能是由同一種群入侵，通過苗木運輸、番茄產(chǎn)品的輸送等在多個地點擴散。

本文初步分析了番茄潛葉蛾的遺傳多樣性，為番茄潛葉蛾部分種群遺傳結構的研究提供了分子水平的基礎資料及試驗證據(jù)。但是，ISSR分子標記在估算種群遺傳的變異上還存在一些缺點，如對于標記的顯性基因，不能區(qū)分純合體及雜合體等，為各種群遺傳變異的分析所呈現(xiàn)的統(tǒng)計信息有局限(張民照和康樂，2002)。此外，本試驗所采集的地理種群及個體數(shù)量有限，難以全面反映番茄潛葉蛾在我國各入侵地的具體情況，還需更深入研究。

ISSR研究結果表明，番茄潛葉蛾尚處在入侵早期階段，且具備頻繁入侵和多點的特征。防控上要注意加強檢疫，阻絕多點入侵來源。