夏圣坤,王 輝,陳曉敏,陳春華,周文淦,黃曉君,聶少平
(南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室,中加食品科學(xué)技術(shù)聯(lián)合實驗室,江西 南昌 330047)
炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease,IBD)包括克羅恩?。–rohn’s disease,CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC),是病因不明的特發(fā)性腸道炎癥。IBD的臨床表現(xiàn)主要為腹瀉、直腸出血、腹痛和體質(zhì)量減輕等癥狀,常常給患者帶來巨大的痛苦[1]。此外,已有研究表明,除了腸道,IBD還會累及全身各器官,進(jìn)而引發(fā)關(guān)節(jié)炎、口腔潰瘍、皮膚黏膜損害、眼部、肝腎臟等病變[2]。IBD發(fā)病率仍持續(xù)上升,已成為全球關(guān)注的健康問題。目前,治療IBD的藥物種類大多為糖皮質(zhì)激素、氨基水楊酸、免疫抑制劑和生物制劑等[3-4]。除藥物醫(yī)治外,現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)一些非藥物類方法也具有改善作用,包括基因治療及糞便移植等。但是這些療法都有其局限性,并非對所有患者都有效。此外,皮質(zhì)類固醇和免疫抑制劑還具有一定副作用,可引起多種不良反應(yīng)。因此,尋找新的手段用于緩解患者癥狀迫在眉睫[5]。
芹菜(Apium graveolensLinn.)屬于傘形花科的草本植物,適宜生長在肥沃的土壤,主要分布于南北美洲、南歐、非洲、亞洲[6]。芹菜具有優(yōu)良的食療效果,已被用于緩解炎癥、便秘、高血壓和高血脂、肝臟病變等疾病[7-9]。黃酮類化合物是植物次生代謝產(chǎn)物,在植物界廣泛分布,大量報道顯示其在細(xì)胞和嚙齒動物模型中具有抗氧化和抗炎活性[10-11]。芹菜中的黃酮類化合物是其重要活性成分之一。目前,芹菜黃酮的研究熱點主要集中在芹菜素,已有研究報道芹菜素具有抗氧化[12]、抗炎[13]、抗腫瘤[14]的生理活性。然而黃酮在植物中主要以其衍生物的形式存在,而非苷元。作為芹菜苷苷元的芹菜素在芹菜中含量較低,質(zhì)量分?jǐn)?shù)僅為0.003%~0.088%[15]。芹菜苷作為芹菜中芹菜素的主要存在形式之一,其含量是芹菜素的10~20 倍[16],然而其相關(guān)的功能活性鮮有報道。
因此,本研究以芹菜苷作為對象,對葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium,DSS)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠給予芹菜苷干預(yù),利用現(xiàn)代生物技術(shù)手段評價芹菜苷緩解結(jié)腸炎的效果,以期提高芹菜的綜合利用,并可為結(jié)腸炎患者膳食選擇提供參考。
5周齡雄性近交系C57BL/6J小鼠((18f2)g)購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司(生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2016-0006),在清潔級動物房中進(jìn)行飼養(yǎng),條件為室溫(25.0f0.5)℃、相對濕度(50f5)%、光/暗循環(huán)為12 h/12 h。
芹菜苷(芹菜苷(67.85f0.89)%、3-甲氧基芹菜苷(9.76f0.23)%和木樨草素-7-O-芹糖苷(10.22f0.05)%)由南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室提供,其結(jié)構(gòu)如圖1所示。
圖1 芹菜苷及其衍生物結(jié)構(gòu)圖Fig. 1 Structures of apiin and its derivatives
DSS 美國MP Biomedical公司;0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)(pH 7.2~7.4)、4%多聚甲醛溶液 上海碧云天生物技術(shù)有限公司;蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)、阿利新藍(lán)(alcian blue,AB)-過碘酸席夫(periodic acid Schiff,PAS)染色試劑盒 武漢賽維爾生物有限公司;髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducable nitric oxide synthase,iNOS)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α與白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-6酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzymelinked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒 南京森貝伽生物科技有限公司;其他化學(xué)試劑均為分析純。
Feica APERIO LV1型病理切片掃描儀、倒置熒光顯微鏡德國徠卡顯微系統(tǒng)公司;3K15冷凍離心機(jī) 美國Sigma-Aldrich公司;Varioshan Flash多功能酶標(biāo)儀、702型-80 ℃冰箱 美國賽默飛世爾科技公司。
1.3.1 動物實驗設(shè)計
1.3.1.1 小鼠飼料配方的確定
AIN93G飼料定制于上海帆泊生物技術(shù)有限公司。飼料成分如表1所示,芹菜苷飲食配方基于AIN93G飼料進(jìn)行調(diào)整。以小鼠3 g/d的飲食劑量為參照,芹菜苷劑量為25 mg/kgmb,相當(dāng)于人的劑量為2.75 mg/kgmb[17]。
表1 飲食成分表Table 1 Ingredients of experimental diets
1.3.1.2 動物實驗分組及模型建立
參照文獻(xiàn)[18]方法并適當(dāng)修改,利用DSS誘導(dǎo)建立小鼠結(jié)腸炎模型。靜養(yǎng)1周后,選用30只C57BL/6小鼠為實驗對象,將小鼠隨機(jī)分成3 組(n=10):正常組、模型組、芹菜苷組。正常組和模型組全程給予AIN93G正常飼料,芹菜苷組全程給予根據(jù)AIN93G飼料配方調(diào)整的芹菜苷定制飼料。飼喂7 d后,模型組和芹菜苷組的飲水更換為含質(zhì)量分?jǐn)?shù)3% DSS的無菌水進(jìn)行腸炎造模;正常組依然給予正常無菌水。造模6 d后,停止給予DSS無菌水(正常組也停止給予無菌水),24 h后,小鼠稱質(zhì)量后脫頸處死,眼眶取血,室溫下靜置1 h,3 000 r/min離心20 min,取上清液(血清),-80 ℃凍存待用。量取升結(jié)腸到直腸末端的距離作為小鼠結(jié)腸長度,稱量脾臟質(zhì)量并記錄,收集小鼠各器官部分保存于-80 ℃冰箱或多聚甲醛溶液中。實驗期間記錄每天小鼠的體質(zhì)量和飲食量。本研究中涉及動物的所有程序均按照國家衛(wèi)生研究院實驗動物護(hù)理和使用指南進(jìn)行,并經(jīng)南昌大學(xué)實驗動物護(hù)理和使用委員會批準(zhǔn)。
1.3.2 疾病活動指數(shù)測定
從第8天開始到動物飼養(yǎng)結(jié)束,參照文獻(xiàn)[19]的方法,對小鼠的糞便形態(tài)、便血情況和體質(zhì)量下降率3 個方面進(jìn)行評分,評分標(biāo)準(zhǔn)如表2所示。疾病活動指數(shù)(disease activity index,DAI)為以上3 個指標(biāo)得分總和的平均值。
表2 DAI評分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Scoring criteria for DAI
1.3.3 脾臟指數(shù)測定
稱取小鼠脾臟質(zhì)量并記錄,按如下公式計算小鼠脾臟指數(shù)。
1.3.4 炎癥因子水平測定
根據(jù)ELISA試劑盒操作說明,測定小鼠血清中炎癥因子TNF-α與IL-6的質(zhì)量濃度。
1.3.5 氧化應(yīng)激指標(biāo)測定
稱取適量結(jié)腸樣本,向其中加入預(yù)冷(4 ℃)的PBS勻漿,4 ℃、3 000 r/min離心10 min獲得結(jié)腸上清液,根據(jù)ELISA試劑盒操作說明,測定小鼠結(jié)腸中MPO及iNOS活力。
1.3.6 結(jié)腸組織病理學(xué)分析
4%多聚甲醛固定結(jié)腸組織樣本,石蠟包埋后,經(jīng)切片、脫蠟、覆水、蘇木精染色、乙酸分化、伊紅染色、脫水和封片后,在病理切片掃描儀下觀察各組的結(jié)腸組織學(xué)形態(tài),并用相機(jī)采集圖像。結(jié)腸組織學(xué)損傷評分標(biāo)準(zhǔn)如表3所示,組織損傷評分為各項指標(biāo)評分的總和[20]。
表3 結(jié)腸組織學(xué)損傷評分標(biāo)準(zhǔn)Table 3 Scoring criteria for colonic histological injury
1.3.7 結(jié)腸杯狀細(xì)胞觀察
AB可以將唾液黏蛋白、硫黏蛋白和蛋白多糖染成藍(lán)色,而PAS可以將既含中性黏蛋白又含酸性黏蛋白的組織和細(xì)胞染成深淺不同的紫色,因此常用AB-PAS技術(shù)研究腸道杯狀細(xì)胞的生長狀況[21]。根據(jù)AB-PAS染色試劑盒說明書,對結(jié)腸切片進(jìn)行AB-PAS染色。石蠟切片脫蠟復(fù)水,使用染液進(jìn)行浸染,切片用無水乙醇脫水、中性樹膠封片。在病理切片掃描儀下采集切片圖像信息。采用Image pro plus 6.0軟件對切片中杯狀細(xì)胞面積占結(jié)腸總面積的百分比(杯狀細(xì)胞面積占比)進(jìn)行計算。
通過Graph Pad Prism 8.0軟件繪制統(tǒng)計圖表,采用SPSS Statistics 23軟件對數(shù)據(jù)通過單因素方差分析進(jìn)行最小顯著差異(least significant difference,LSD)的事后分析檢驗,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。
對各處理組小鼠飲食量進(jìn)行統(tǒng)計,并計算平均每只小鼠飲食量,結(jié)果如圖2所示,在第2~9天,各處理組小鼠飲食量之間沒有明顯差異,均穩(wěn)定在2.1~3.2 g之間,而從第10天開始,模型組和芹菜苷組小鼠飲食量開始逐漸下降,這可能是DSS處理使得小鼠腸道損傷所引起的。
圖2 各處理組小鼠飲食量Fig. 2 Food intake of mice in each treatment group
為評估芹菜苷對DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠體質(zhì)量的影響,對小鼠體質(zhì)量進(jìn)行統(tǒng)計。從圖3A可以看出,在第1~8天,各組小鼠體質(zhì)量均緩慢上升,而在給予DSS后,模型組和芹菜苷組小鼠體質(zhì)量逐漸下降。對比模型組,芹菜苷可減緩體質(zhì)量降低,且在第14天時,芹菜苷組小鼠體質(zhì)量顯著高于模型組(P<0.05)。為消除前7 d芹菜苷干預(yù)對體質(zhì)量的影響,以第8天小鼠體質(zhì)量為基準(zhǔn),計算8~14 d的體質(zhì)量與第8天體質(zhì)量的比值(相對體質(zhì)量)(圖3B)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在第14天,模型組的體質(zhì)量降至第8天時的89.34%,而芹菜苷可顯著緩解由DSS誘導(dǎo)的體質(zhì)量降低(P<0.05)。
圖3 芹菜苷對小鼠體質(zhì)量的影響Fig. 3 Effect of apiin on body mass in mice
脾臟是最大的免疫器官,炎癥反應(yīng)會使脾臟發(fā)生腫大,導(dǎo)致質(zhì)量增加。如圖4所示,模型組小鼠脾臟指數(shù)與正常組小鼠相比高度顯著升高(P<0.001),芹菜苷可高度顯著降低腸炎小鼠脾臟指數(shù)(P<0.001)。
圖4 芹菜苷對小鼠脾臟指數(shù)的影響Fig. 4 Effect of apiin on spleen index in mice
為判斷小鼠結(jié)腸炎的嚴(yán)重程度,對小鼠DAI進(jìn)行評分,結(jié)果如圖5所示。在造模期間,正常組DAI基本保持為0。給予3% DSS 2 d(第10天)后,與正常組相比,模型組DAI顯著升高(P<0.05),且在第14天DAI達(dá)到約3.5。而芹菜苷可顯著降低結(jié)腸炎小鼠的DAI,芹菜苷組在第14天DAI為2,高度顯著低于模型組(P<0.001)。
圖5 芹菜苷對小鼠DAI的影響Fig. 5 Effect of apiin on DAI in mice
結(jié)腸炎會引起結(jié)腸長度縮短,因此結(jié)腸長度變化是評價小鼠結(jié)腸炎嚴(yán)重程度的又一重要參數(shù)[22]。如圖6所示,正常小鼠結(jié)腸長度為6.5 cm,而模型組小鼠的結(jié)腸平均長度僅為5.0 cm,高度顯著低于正常組(P<0.001),而芹菜苷飲食干預(yù)可極顯著緩解結(jié)腸炎小鼠的結(jié)腸縮短(P<0.01)。
圖6 芹菜苷對小鼠結(jié)腸長度的影響Fig. 6 Effect of apiin on colonic length
為評價芹菜苷對氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)能力,測定了結(jié)腸中MPO及iNOS的活力,結(jié)果如圖7所示。正常組的MPO和iNOS活力分別為15 U/μg和0.75 U/μg,DSS的攝入會引起小鼠氧化應(yīng)激反應(yīng),表現(xiàn)為模型組小鼠的MPO和iNOS活力顯著增加(P<0.001、P<0.01),然而芹菜苷的攝入可以高度顯著抑制MPO與iNOS活力的增加(P<0.001),說明芹菜苷具有較強(qiáng)的調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激能力。
圖7 芹菜苷對小鼠氧化應(yīng)激的影響Fig. 7 Effect of apiin on oxidative stress in mice
結(jié)腸炎患者常伴有嚴(yán)重的炎癥反應(yīng),進(jìn)而體內(nèi)產(chǎn)生高濃度的促炎因子[23],為了評價芹菜苷的抗炎能力,本實驗測定了血清中TNF-α與IL-6的質(zhì)量濃度,結(jié)果如圖8所示。與正常組相比,模型組小鼠血清中促炎因子TNF-α和IL-6分泌水平顯著升高(P<0.05),質(zhì)量濃度分別達(dá)到493 ng/L、99 pg/mL,而芹菜苷干預(yù)可顯著降低血清中這兩種炎癥因子質(zhì)量濃度(P<0.001、P<0.01),并達(dá)到與正常組相近的水平。
圖8 芹菜苷對小鼠血清TNF-α(A)和IL-6(B)質(zhì)量濃度的影響Fig. 8 Effect of apiin on serum TNF-α (A) and IL-6 (B) levels in mice
為評價芹菜苷對DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)和形態(tài)的影響,對小鼠結(jié)腸組織進(jìn)行HE染色及組織病理學(xué)綜合評分。如圖9A所示,正常組小鼠結(jié)腸上皮及隱窩結(jié)構(gòu)正常,且無炎癥細(xì)胞浸潤發(fā)生;模型組小鼠結(jié)腸出現(xiàn)嚴(yán)重的腸上皮損傷、隱窩結(jié)構(gòu)變形或消失,以及大范圍的炎癥浸潤;芹菜苷組小鼠結(jié)腸結(jié)構(gòu)較為完整,組織損傷輕微,黏膜上皮結(jié)構(gòu)較為完整,隱窩結(jié)構(gòu)基本完整與規(guī)則。如圖9B所示,與模型組相比,芹菜苷組結(jié)腸組織損傷得分高度顯著降低(P<0.001),說明芹菜苷可顯著減輕DSS引起的小鼠結(jié)腸組織損傷。
圖9 芹菜苷對小鼠結(jié)腸病理組織的影響Fig. 9 Effect of apiin on colonic damage score in mice
與正常組相比,模型組小鼠組織學(xué)檢查結(jié)果顯示隱窩結(jié)構(gòu)變形或消失,這表明芹菜苷可能通過刺激杯狀細(xì)胞分泌黏液對腸道上皮細(xì)胞產(chǎn)生有益作用。因此用ABPAS進(jìn)行特異性染色,以評估芹菜苷處理后的小鼠杯狀細(xì)胞的生長情況。如圖10A所示,在模型組小鼠結(jié)腸中,杯狀細(xì)胞萎縮且?guī)缀醣煌耆茐?,而芹菜苷組小鼠結(jié)腸杯狀細(xì)胞數(shù)量眾多并均勻地分布在隱窩當(dāng)中,且分泌有大量黏液。如圖10B所示,與模型組相比,芹菜苷處理小鼠杯狀細(xì)胞的AB-PAS染色面積百分比顯著更高(P<0.05),這表明芹菜苷的攝入對杯狀細(xì)胞具有明顯的保護(hù)作用。
圖10 芹菜苷對結(jié)腸組織中杯狀細(xì)胞的影響Fig. 10 Effect of apiin on number of goblet cells in colon tissue
DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎具有與人類UC相似的病理特征,表現(xiàn)為體質(zhì)量減輕、糞便出血、腸上皮細(xì)胞丟失和中性粒細(xì)胞浸潤等病理改變[24]。在本研究中,通過連續(xù)6 d在雄性C57BL/6小鼠的飲水中添加3%的DSS誘導(dǎo)急性結(jié)腸炎。模型組體質(zhì)量急劇下降,肛門可見血便,組織病理改變,結(jié)腸組織出現(xiàn)隱窩破壞、杯狀細(xì)胞的丟失、黏膜下水腫和上皮結(jié)構(gòu)損傷以及大范圍的炎癥浸潤等現(xiàn)象。而芹菜苷能減輕DSS處理小鼠的結(jié)腸炎癥狀和炎癥反應(yīng),維持正常的腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)。
氧化應(yīng)激和氧化細(xì)胞損傷是結(jié)腸炎的標(biāo)志之一。氧化應(yīng)激酶活力升高會導(dǎo)致自由基大量生成,而自由基會與腸細(xì)胞膜上脂類物質(zhì)發(fā)生相互作用,導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化,從而破壞腸道黏膜屏障,加重炎癥反應(yīng)[25-26]。MPO是一種中性粒細(xì)胞溶酶體中富含的酶,其活性與炎癥直接相關(guān),在特定條件下,MPO催化反應(yīng)生成過量的氧化自由基,會導(dǎo)致氧化應(yīng)激和氧化性組織損傷[27]。iNOS是催化NO生成的協(xié)助巨噬細(xì)胞在免疫系統(tǒng)中對抗病原體的一類氧化應(yīng)激酶。研究發(fā)現(xiàn),結(jié)腸炎患者內(nèi)NO含量超過正常值時,iNOS表達(dá)合成量升高[28]。本研究發(fā)現(xiàn),與正常組相比,DSS處理的模型組小鼠MPO和iNOS活力顯著升高,而添加芹菜苷處理后,這兩種酶活力恢復(fù)至正常水平,表明芹菜苷具有較強(qiáng)的調(diào)節(jié)機(jī)體氧化應(yīng)激能力。賈佳等[29]在對芹菜苷體外活性研究中發(fā)現(xiàn),芹菜苷具有強(qiáng)抗氧化能力,能減緩油脂過氧化。
炎癥因子是一類主要由免疫系統(tǒng)細(xì)胞分泌的具有許多強(qiáng)大生物學(xué)效應(yīng)的內(nèi)源性多肽,可介導(dǎo)單核細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤腸組織,從而引起腸組織損傷[29]。TNF-α是炎癥反應(yīng)過程中出現(xiàn)的最早、最重要的炎性介質(zhì),能激活中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞,使血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加。IL-6能誘導(dǎo)B細(xì)胞分化和產(chǎn)生抗體,并誘導(dǎo)T細(xì)胞活化增殖、分化,參與機(jī)體免疫應(yīng)答,是炎癥反應(yīng)的促發(fā)劑[30]。IL-6水平常與結(jié)腸炎患者疾病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[31]。研究結(jié)果表明,促炎因子(如TNF-α和IL-6)的表達(dá)量升高可促使腸道炎癥發(fā)生,導(dǎo)致疾病惡化和組織破壞[32]。也有研究發(fā)現(xiàn),TNF-α可以通過調(diào)節(jié)核因子(nuclear factor,NF)-κB誘導(dǎo)激酶和抑制酶比例(NF-κB-inducing kinase/inhibitory-κB kinase α,NIK/IKK-α)激活NF-κB通路促進(jìn)腸道通透性增加[33]。據(jù)報道,NO產(chǎn)量的增加與促炎細(xì)胞因子釋放的增加成正比,而iNOS活力增加會導(dǎo)致產(chǎn)生大量的NO[34]。因此,本研究利用ELISA法測定血清中的TNF-α及IL-6的質(zhì)量濃度,結(jié)果表明,DSS誘導(dǎo)能顯著提高血清中這些炎癥因子的質(zhì)量濃度,而芹菜苷可顯著抑制這些細(xì)胞因子的表達(dá),提示芹菜苷可以緩解全身性的炎癥。
腸道黏液層作為腸道屏障的重要組成部分,主要由杯狀細(xì)胞及其分泌的黏蛋白組成。黏蛋白是一類糖蛋白,其結(jié)合位點可與腸上皮細(xì)胞上的結(jié)合位點競爭,以阻止細(xì)菌與腸上皮結(jié)合,使細(xì)菌處于黏液層,以利于腸蠕動時被清除,以維護(hù)腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[35]。結(jié)腸組織中過多的炎癥細(xì)胞因子會引起杯狀細(xì)胞凋亡,從而導(dǎo)致黏膜屏障完整性嚴(yán)重被破壞[36]。因此,利用AB-PAS進(jìn)行特異性染色,以評估芹菜苷處理后的杯狀細(xì)胞生長情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn),芹菜苷組小鼠的杯狀細(xì)胞數(shù)量顯著高于模型組,這表明芹菜苷可能通過刺激杯狀細(xì)胞增殖分泌黏液對腸道屏障產(chǎn)生有益作用。也有研究表明,一些黃酮具有上調(diào)黏蛋白和保護(hù)結(jié)腸黏液層完整性的功能[37],與本實驗研究結(jié)果相似。
芹菜苷作為芹菜素的天然存在形式,其結(jié)構(gòu)上比芹菜素多連有兩個糖苷;且與芹菜素相比,芹菜苷在體外幾乎不被細(xì)胞吸收,并且沒有表現(xiàn)出明顯抗炎活性[38]。這表明芹菜苷發(fā)揮抗炎作用可能涉及到其他機(jī)制,如機(jī)體代謝及腸道菌群的改變,有待進(jìn)一步研究。
綜上所述,芹菜苷可以緩解結(jié)腸炎小鼠的體質(zhì)量降低和結(jié)腸縮短,降低DAI;并減弱DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎的組織病理學(xué)改變。此外,芹菜苷能抑制結(jié)腸炎小鼠血清中促炎細(xì)胞因子表達(dá)水平的增加,調(diào)節(jié)結(jié)腸氧化應(yīng)激酶MPO及iNOS活力,促進(jìn)杯狀細(xì)胞增殖,保護(hù)腸道屏障完整性,修復(fù)結(jié)腸炎導(dǎo)致的腸道損傷。因此,芹菜苷可作為緩解結(jié)腸炎的潛在天然活性物質(zhì)。