■石瑤瑤 馬 杰 王卓君， 葉元土* 蔣 蓉 孔慶偉

（1.蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，江蘇省水產(chǎn)動(dòng)物營養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 蘇州 215123；2.無錫三智生物科技有限公司，江蘇 無錫 214000；3.遼寧省農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，遼寧 沈陽 110033）

氧化損傷是導(dǎo)致魚體損傷的主要損傷方式，其實(shí)質(zhì)為體內(nèi)氧化與抗氧化的動(dòng)態(tài)失衡。主要表現(xiàn)在自由基含量增加、脂質(zhì)過氧化物增加，蛋白質(zhì)、DNA、脂質(zhì)等大分子物質(zhì)被損傷，體內(nèi)抗氧化酶活性下降[1]。體內(nèi)自由基產(chǎn)生的主要位點(diǎn)在線粒體，線粒體是ATP產(chǎn)生的能量代謝中心，通過氧化作用和氧化磷酸化作用的偶聯(lián)，氫和電子在呼吸鏈傳遞過程中將化學(xué)能轉(zhuǎn)移到ADP上產(chǎn)生ATP，在氫和電子給氧的過程中會(huì)產(chǎn)生過氧化氫和過氧自由基。正常情況下，線粒體產(chǎn)生的過氧化物、自由基等可以經(jīng)體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)清除，維持過氧化物、自由基產(chǎn)生與清除的動(dòng)態(tài)平衡[2]。而一旦失衡，過氧化物、自由基含量增加，對細(xì)胞、器官組織造成氧化損傷。這時(shí)，可以通過飼料途徑，在飼料中增加維生素C（VC）、維生素E（VE）和一些具有抗氧化作用、具有自由基清除作用的物質(zhì)，如天然植物來增強(qiáng)魚體、細(xì)胞的抗氧化能力和自由基清除能力，同時(shí)對氧化損傷的細(xì)胞進(jìn)行修復(fù)。這也是水產(chǎn)動(dòng)物營養(yǎng)和飼料在滿足養(yǎng)殖水產(chǎn)動(dòng)物營養(yǎng)需要為基本目標(biāo)的前提下，增強(qiáng)飼料抗氧化功能的發(fā)展方向之一。

VC是維生素中較為理想的抗氧化劑，但在水產(chǎn)飼料中過量使用也會(huì)產(chǎn)生不良反應(yīng)，需要限量添加，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第2625 號(hào)公告《關(guān)于飼料添加劑安全使用規(guī)范》中，VC在草魚和鯉魚配合飼料中的推薦添加量為300～500 mg/kg[3-4]。需要探索其他功能完整、在多條途徑中發(fā)揮作用的抗氧化性物質(zhì)促進(jìn)動(dòng)物健康生長。天然植物可作為實(shí)現(xiàn)該目標(biāo)的最優(yōu)選擇，依據(jù)《飼料原料目錄》[5]，一些藥、食同源的天然植物允許在飼料中使用。本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)天然植物應(yīng)用在黃顙魚和異育銀鯽的養(yǎng)殖中具有良好的抗氧化能力，可降低肝臟通透性，維護(hù)腸道菌群穩(wěn)態(tài)，減輕體內(nèi)氧化應(yīng)激[6-7]。

在前期研究的基礎(chǔ)上，文章以天然植物復(fù)合物1（RAT 組）、天然植物復(fù)合物2（JLT 組）和訶子（TCR組）水溶物凍干粉以及VC作為試驗(yàn)材料，探討天然植物抗氧化能力的評價(jià)方法，以草魚原代肝臟細(xì)胞作為試驗(yàn)對象，探討不同天然植物水溶物對肝細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用效果及機(jī)制，從細(xì)胞層面探究天然植物修復(fù)損傷肝臟的作用機(jī)理，為研制具有抗氧化性或氧化損傷修復(fù)作用的天然植物飼料提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)草魚

用于原代肝細(xì)胞采集的草魚為平均體重（50.0±2.6）g的一冬齡幼魚，飼養(yǎng)于蘇州大學(xué)室內(nèi)養(yǎng)殖系統(tǒng)，每天投喂草魚商品飼料（粗蛋白28%、粗脂肪7%的膨化飼料）1次，養(yǎng)殖系統(tǒng)水體溫度（24.0±5.0）℃。

1.2 天然植物及其水溶物

天然植物復(fù)合物1（RAT）和天然植物復(fù)合物2（JLT）由無錫三智生物科技有限公司提供，原料組成為葛根、絞股藍(lán)、甘草、訶子、金銀花、黃芪等，是將不同的單一天然植物飲片分別進(jìn)行超微粉碎后的混合品；訶子（TCR）為中藥店購買的飲片粉碎后過60目篩樣品。RAT 和JLT 中多酚、多糖、黃酮和皂苷活性成分含量測定結(jié)果如表1。

表1 RAT和JLT部分活性成分含量（%）

分別稱取TCR、RAT和JLT粉末，各按料液比1∶10加雙蒸水?dāng)嚢杈鶆颍? ℃浸泡24 h，濾膜過濾2 遍，將濾液置冷凍干燥機(jī)凍干后制成水溶物凍干粉，-80 ℃冷凍保存待用。

1.3 肝細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

草魚原代肝細(xì)胞的分離參照秦潔等[8]的試驗(yàn)方法并稍作調(diào)整。將草魚消毒后取出肝臟，PBS（0.01 mol/L、pH 7.4）清洗3 遍，剪碎后按體積1∶3 的比例加入0.25%胰蛋白酶、27 ℃搖床消化15 min，1 000 r/min離心1 min，棄上清液。按1∶3 的比例加入PBS 和紅細(xì)胞裂解液，1 000 r/min離心4 min棄上清液。PBS清洗細(xì)胞、800 r/min離心1 min棄上清后，加入含10%胎牛血清的M199培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液。細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（Cyto SMART Technologies B.V.）計(jì)數(shù)后于5% CO2、27 ℃的培養(yǎng)箱（ESCO，新加坡）中培養(yǎng)，24 h換培養(yǎng)液。

1.4 天然植物水溶物對自由基清除率的測定

1.4.1 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH·）清除率

參照陳旭丹等[9]測定DPPH·的方法并稍作改進(jìn)。DPPH溶于無水乙醇中，配成終濃度為8.62×10-5mol/L DPPH。稱取0.128 g 待測樣品（凍干粉），加入20 mL 75%乙醇，超聲提取5 min，8 000 r/min 離心8 min，收集上清，得到初始濃度為6.4 g/L 的待測液母液，用無水乙醇稀釋成不同濃度。操作步驟及DPPH·清除率計(jì)算公式按照陳旭丹等[9]試驗(yàn)的方法，可見分光光度計(jì)測量吸光值。

1.4.2 羥基自由基（·OH）清除率

參照劉茹等[10]測定方法，采用水楊酸法測定樣品對·OH清除率。用純化水將樣品稀釋成不同濃度，操作步驟及·OH清除率計(jì)算公式按照劉茹等[10]試驗(yàn)的方法。

1.5 細(xì)胞活力測定

1.5.1 天然植物水溶物試驗(yàn)濃度的確定

接種2.5×105個(gè)/mL細(xì)胞到96孔板中，24 h后待其覆蓋培養(yǎng)孔底面積80%左右時(shí)，更換培養(yǎng)基，使培養(yǎng)液中RAT、JLT、TCR和VC的濃度為0.01、0.05、0.10、0.50、1.00、5.00 mg/mL，培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL噻唑藍(lán)（MTT）溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄去舊培養(yǎng)液，每孔加入100 μL純度為99.5%的二甲基亞砜，遮光振搖10 min，充分溶解甲瓚（Formazan）。用酶標(biāo)儀（Gene Company Limited）檢測570 nm波長下的各孔吸光度值，根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞活力，篩選對細(xì)胞無毒性的天然植物水溶物濃度，用于后續(xù)修復(fù)損傷細(xì)胞試驗(yàn)。

細(xì)胞活力（%）=處理組OD570nm/對照組OD570nm×100

1.5.2 天然植物水溶物對H2O2損傷肝細(xì)胞活力的測定

取培養(yǎng)24 h后處于對數(shù)生長期的細(xì)胞（細(xì)胞貼壁生長且貼壁細(xì)胞約占80%的培養(yǎng)孔面積），按照前期試驗(yàn)結(jié)果[11]，用濃度為200 μmol/L 的H2O2處理細(xì)胞1 h后建立H2O2損傷模型。對照組和H2O2組換正常培養(yǎng)基，其余組更換濃度為0.10 mg/mL 的RAT、JLT、TCR 和VC 4 種物質(zhì)的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞24 h，MTT 檢測細(xì)胞活力，操作與計(jì)算方法同1.5.1。

1.6 細(xì)胞抗氧化酶活性的檢測

接種4×106個(gè)/mL細(xì)胞到12孔板里，分組按照1.5.2處理細(xì)胞，加入0.25%胰蛋白酶200 μL 消化細(xì)胞2-3 min，加入等體積完全培養(yǎng)基終止消化，棄上清，收集細(xì)胞后，加入1 mL PBS，利用細(xì)胞超聲破碎儀低溫裂解細(xì)胞（功率30%，裂解3 min），按照南京建成生物研究所有限公司的試劑盒方法檢測超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）活性和丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）含量。

1.7 細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平的檢測

按照1.6 中的方法收集各組細(xì)胞，按南京建成生物研究所有限公司ROS試劑盒方法加樣，用流式細(xì)胞儀（Beckman Coulter，美國）進(jìn)行檢測。

1.8 細(xì)胞凋亡的檢測

按照1.6 中的方法收集各組細(xì)胞，處理細(xì)胞按試劑盒（杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司）方法，Annexin VFITC和PI雙染，流式細(xì)胞儀檢測。CXP Analysis軟件分析計(jì)算結(jié)果。

1.9 線粒體膜電位（MMP）的檢測

按照1.6 收集各組細(xì)胞后，按照南京建成生物研究有限公司MMP試劑盒方法操作，流式細(xì)胞儀檢測。

1.10 透射電鏡觀察肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

細(xì)胞分組及處理同1.5.2，每個(gè)樣本處理3 個(gè)復(fù)孔，用2.5%的常溫戊二醛避光固定細(xì)胞5 min，細(xì)胞刮輕輕刮下細(xì)胞，用吸管把細(xì)胞吸進(jìn)離心管，1 000×g離心2 min，換上新的固定液室溫避光30 min，經(jīng)過PBS沖洗后1%鋨酸固定2 h，PBS沖洗，先用50%乙醇脫水逐漸過渡到用100%乙醇脫水，使用環(huán)氧樹脂和硬化劑對樣品浸透包埋，3 mm直徑銅網(wǎng)收集、切片，檸檬酸鉛和醋酸鈾進(jìn)行染色，于透射電鏡下觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，選取2 000倍鏡和10 000倍鏡下各10個(gè)視野，觀察線粒體、細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體形態(tài)數(shù)量及分布情況。

1.11 Western Blot試驗(yàn)

①將各處理組的細(xì)胞棄掉上清，離心后收集細(xì)胞，按1∶10 的比例加入樣本和裂解液，充分裂解細(xì)胞，離心收集上清。用BCA檢測試劑盒測定細(xì)胞蛋白質(zhì)含量。

②制備SDS-PAGE 凝膠電泳，將蛋白Marker 和細(xì)胞樣品加到膠孔內(nèi)，電壓設(shè)置在80～100 V。待溴酚藍(lán)未接觸膠的底端即結(jié)束電泳。

③轉(zhuǎn)膜（PVDF 膜）后加入Western 封閉液，加入一抗4 ℃過夜，TBST 緩沖液洗膜30 min（3 次），室溫加入二抗2 h，同前步驟洗膜3 次，清洗完畢后放入Chemiscope 6000 Pro化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，掃描拍照。

1.12 轉(zhuǎn)錄組分析

將各組細(xì)胞分別進(jìn)行收集后，委托北京百邁客生物科技有限公司進(jìn)行RNA-seq測序和基因注釋。

1.13 數(shù)據(jù)處理和分析

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），組間差異顯著性用Duncan’s 法多重比較進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（Duncan’s multiple range test），試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）”表示，P＜0.05 表示顯著差異，P＜0.01表示極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 天然植物水溶物體外抗氧化效果（見表2）

以VC 為陽性對照，測定天然植物水溶物清除自由基的效果，結(jié)果都以IC50值來表示。IC50定義為：自由基數(shù)目減少50%時(shí)所需要的樣品濃度，即為自由基清除率下降50%時(shí)樣品的濃度，IC50值越小表明清除能力越強(qiáng)。由表2 所示，VC 是清除DPPH·和·OH能力最強(qiáng)的，RAT和JLT清除·OH能力二者之間無顯著性差異，IC50值約為1.50 mg/mL，其清除能力是訶子的7.8 倍；訶子清除DPPH·IC50值為0.01 mg/mL、RAT IC50值為0.26 mg/mL，JLT IC50值為1.31 mg/mL。

表2 不同天然植物對自由基的清除率（IC50，n=3，mg/mL）

2.2 天然植物水溶物在細(xì)胞培養(yǎng)液中的適宜濃度（見圖1）

圖1 同濃度天然植物水溶物和VC對細(xì)胞活力的影響（n=3）

由圖1 結(jié)果所示，0.01～1.00 mg/mL 濃度的JLT 組水溶物培養(yǎng)肝細(xì)胞24 h 的細(xì)胞活力無顯著性差異（P＞0.05），JLT 濃度增加到5.00 mg/mL 時(shí)細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.05）；0.01～0.50 mg/mL 濃度的RAT 組培養(yǎng)肝細(xì)胞24 h 細(xì)胞活力隨濃度的升高呈顯著性上升趨勢（P＜0.05）；同等濃度范圍的TCR培養(yǎng)肝細(xì)胞24 h，細(xì)胞活力無顯著性差異（P＞0.05）；RAT和TCR濃度達(dá)到1.00～5.00 mg/mL時(shí)肝細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.05）；VC 作為陽性對照在0.01～0.10 mg/mL 濃度范圍內(nèi)與Con 組（正常細(xì)胞）相比無顯著性差異，0.50 mg/mL和1.00 mg/mL 兩個(gè)濃度下細(xì)胞活力顯著升高，但在5.00 mg/mL時(shí)又出現(xiàn)了下降。因此，可以選用濃度為0.01～0.50 mg/mL的3種天然植物水溶物和VC陽性對照進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 天然植物水溶物對H2O2損傷肝細(xì)胞活力的影響（見圖2）

圖2 天然植物水溶物和VC對損傷細(xì)胞活力的影響（n=3）

從篩選出來的安全范圍濃度中，選擇相同濃度（0.10 mg/mL）的4 種物質(zhì)，分別加入到H2O2損傷的細(xì)胞中，作用24 h 后檢測細(xì)胞活力，結(jié)果如圖2 所示，H2O2組與對照組（Con組）相比有顯著降低的趨勢（P＜0.05）；除JLT 組外，RAT、TCR 和VC 組與H2O2組相比都能顯著性提高細(xì)胞活力（P＜0.05）；VC組效果最好，達(dá)到與Con組無顯著差異水平；RAT和TCR組間無顯著性差異（P＞0.05），且均高于H2O2組的結(jié)果。結(jié)果表明，JLT、RAT、TCR和VC均具有恢復(fù)H2O2損傷草魚肝細(xì)胞生長活力的功能，且以RAT、TCR和VC活性更強(qiáng)。

2.4 天然植物水溶物對H2O2損傷肝細(xì)胞抗氧化酶活性的影響（見圖3）

如圖3所示，與Con組相比，H2O2組的MDA含量極顯著上升（P＜0.01），與H2O2組相比，加入不同天然植物水溶物和VC 后，MDA 含量呈顯著下降趨勢。H2O2組GSH含量與Con組相比極顯著降低；與H2O2組相比，天然植物水溶物和VC組都極顯著提高了GSH含量（P＜0.01）。與Con 組相比，H2O2組CAT 活性極顯著降低；與H2O2組相比，天然植物水溶物和VC 組CAT 活性有升高趨勢，除JLT 組，其余3 組都具有極顯著性差異（P＜0.01）。與Con 組相比，H2O2組的SOD 活性顯著提高，加入天然植物水溶物組和VC后SOD活性與H2O組相比極顯著下降（P＜0.01）。結(jié)果表明，添加天然植物水溶物能夠降低H2O2損傷細(xì)胞MDA含量，提高CAT活性，增加GSH含量。

圖3 天然植物水溶物和VC對損傷細(xì)胞酶活性的影響（n=3）

2.5 天然植物水溶物對H2O2損傷肝細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）含量的影響（見圖4）

由圖4 所示，H2O2組胞內(nèi)ROS 水平極顯著高于Con組（P＜0.01）；與H2O2組相比，加入天然植物水溶物和VC 培養(yǎng)細(xì)胞24 h后，細(xì)胞內(nèi)的ROS 水平均極顯著降低（P＜0.01），其中VC 組降低最顯著。RAT 和JLT兩組之間無顯著性差異（P＞0.05）。結(jié)果表明，JLT、RAT、TCR 和VC 均具有降低H2O2損傷草魚肝細(xì)胞內(nèi)多余活性氧的功能。

圖4 天然植物水溶物和VC對細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響（n=3）

2.6 天然植物對H2O2損傷肝細(xì)胞凋亡率的影響（見圖5）

圖5 天然植物水溶物和VC對肝細(xì)胞凋亡率的影響

如圖5所示，H2O2組的細(xì)胞早期凋亡率為（35.72±0.93）%，與Con組相比增加14.07%（P＜0.01）。RAT組和JLT組細(xì)胞凋亡率分別為（24.87±0.53）%和（23.71±1.32）%，兩者與H2O2組相比凋亡率顯著降低（P＜0.05）。VC 組細(xì)胞凋亡率達(dá)到了最少，為（17.61±1.06）%，TCR組細(xì)胞凋亡率為（26.21±4.41）%，與H2O2組有顯著性差異（P＜0.05），但是活細(xì)胞明顯減少。試驗(yàn)結(jié)果表明，JLT、RAT、TCR和VC均能降低H2O2損傷草魚肝細(xì)胞的凋亡率，效果較強(qiáng)的是VC、RAT和JLT。

2.7 天然植物水溶物對H2O2損傷肝細(xì)胞線粒體膜電位的影響（見圖6）

由圖6所示，與Con組相比，H2O2組的線粒體膜電位極顯著下降（P＜0.01）。與H2O2組相比，加入天然植物水溶物和VC 后，僅JLT 組和TCR 組有顯著性上升的趨勢。尤其是TCR組的MMP最高，RAT組和VC組MMP 與H2O2組無顯著性差異（P＞0.05）。結(jié)果表明，RAT、JLT 和TCR 能夠升高H2O2損傷草魚肝細(xì)胞細(xì)胞膜電位，緩解線粒體途徑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

圖6 天然植物水溶物和VC對MMP的影響（n=3）

2.8 天然植物對H2O2損傷肝細(xì)胞透射電鏡的觀察結(jié)果（見圖7）

圖7 肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化

由圖7 所示，Con 組肝細(xì)胞細(xì)胞核呈現(xiàn)圓形或者橢圓形，染色質(zhì)集中于細(xì)胞核中央，細(xì)胞質(zhì)均勻分布，線粒體豐富，結(jié)構(gòu)完整，嵴清晰（見圖7A 和圖7A1）；H2O2組的細(xì)胞有嚴(yán)重空泡化現(xiàn)象，細(xì)胞質(zhì)分布不均勻，大片面積缺失，細(xì)胞核染色質(zhì)邊集化特征顯著，線粒體腫脹，嵴消失，細(xì)胞器減少，內(nèi)含脂滴，有少量自噬小體和自噬溶酶體（見圖7B 和圖7B1）；RAT 組（見圖7C 和圖7C1）、JLT 組（見圖7D 和圖7D1）、TCR 組（見圖7E和圖7E1）和VC組（見圖7F和圖7F1）與H2O2組相比，嵴消失情況有所緩解，但依舊有線粒體腫脹現(xiàn)象，線粒體數(shù)量略有升高，自噬小體和自噬溶酶體聚集趨于增多。上述結(jié)果表明，H2O2損傷肝細(xì)胞后能夠造成肝細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)顯著性的改變，天然植物水溶物和VC 能夠緩和細(xì)胞受損情況，主要是通過線粒體形態(tài)、自噬溶酶體數(shù)量的變化起到作用。

2.9 凋亡蛋白的檢測結(jié)果（見圖8）

圖8 天然植物水溶物對細(xì)胞凋亡蛋白相對表達(dá)量的影響

Western Blot 試驗(yàn)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Con 組相比，H2O2組的凋亡蛋白Caspase-3 的表達(dá)極顯著性升高（P＜0.01）；與H2O2組相比，RAT 組和TCR 組的Caspase-3的表達(dá)極顯著性降低（P＜0.01），凋亡蛋白活性被抑制，說明RAT 和TCR 能夠通過抑制Caspase-3 的表達(dá)活性對草魚原代肝細(xì)胞起到保護(hù)作用。H2O2組Bax 蛋白的表達(dá)較Con 組有極顯著性升高趨勢（P＜0.01），RAT 組、JLT 組和TCR 組與H2O2組相比有顯著或極顯著降低的趨勢（P＜0.05或P＜0.01），RAT、JLT和TCR能抑制Bax蛋白的表達(dá)活性，緩解細(xì)胞凋亡。

2.10 基因差異表達(dá)和通路分析

采用EdgeR 軟件對Con 組、H2O2組、TCR 組、RAT組、JLT 組和VC 組細(xì)胞進(jìn)行差異表達(dá)基因統(tǒng)計(jì)分析，默認(rèn)參數(shù)：p-adjust＜0.05、| |log2FC ≥1，結(jié)果見表3。H2O2組與Con 組相比，有1 073 個(gè)基因差異表達(dá)，其中有363 個(gè)基因差異表達(dá)上調(diào)、710個(gè)基因差異表達(dá)下調(diào)；H2O2組與TCR組相比，有3 637個(gè)基因差異表達(dá)，其中1 565 個(gè)基因差異表達(dá)上調(diào)，2 072個(gè)基因差異表達(dá)下調(diào)；H2O2組與JLT組相比，有482個(gè)基因差異表達(dá)，其中有156個(gè)基因差異表達(dá)上調(diào)，326個(gè)基因差異表達(dá)下調(diào)；H2O2組與RAT 相比，有200 個(gè)基因差異表達(dá)，其中有89 個(gè)基因差異表達(dá)上調(diào)，111 個(gè)基因差異表達(dá)下調(diào)；H2O2組與VC 相比，有359 個(gè)基因差異表達(dá)，其中有103個(gè)基因差異表達(dá)上調(diào)，有256個(gè)基因差異表達(dá)下調(diào)。

表3 差異表達(dá)基因

對部分GEGs 進(jìn)行整理，結(jié)果見表4，H2O2組“內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工通路”中Calpain-2catalytic subunit基因表達(dá)上調(diào)，造成細(xì)胞內(nèi)Ca2+紊亂；“胰島素信號(hào)通路”中Insulin receptor substrate2 基因表達(dá)下調(diào)，receptor-type tyrosine-protein phosphatase F-like基因差異表達(dá)倍數(shù)上調(diào)9.48倍，影響胰島素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；“類固醇生物合成通路”中Delta(24)-sterol reductase基因表達(dá)下調(diào)，影響固醇合成途徑，氧化還原酶失衡造成氧化損傷。TCR 組中Glutathione peroxidase4 基因表達(dá)上調(diào)，“鐵下垂通路”中Phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase基因表達(dá)上調(diào)，transferrin receptor protein1-like基因表達(dá)下調(diào)，表明TCR可能通過抑制鐵死亡保護(hù)細(xì)胞。JLT組“自噬通路”中high mobility group protein基因差異表達(dá)上調(diào)，death-associated protein kinases基因差異表達(dá)倍數(shù)下調(diào)7.43 倍，beclin-1protein基因差異表達(dá)倍數(shù)上調(diào)10.25倍，可通過促進(jìn)細(xì)胞自噬保護(hù)細(xì)胞。RAT 組“自噬通路”中beclin-1protein基因差異表達(dá)倍數(shù)上調(diào)10.80倍，“內(nèi)分泌和其他因素調(diào)節(jié)鈣重吸收通路”中calbindin-like基因表達(dá)上調(diào)，參與鈣離子的結(jié)合、調(diào)節(jié)鈣平衡。VC 組“甲狀腺激素合成通路”中Thyroxine基因表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)甲狀腺激素合成緩解細(xì)胞凋亡。

表4 差異表達(dá)基因

3 討論

3.1 天然植物的抗氧化作用

本試驗(yàn)結(jié)果表明，三種天然植物水溶物都具有較好的清除DPPH·和·OH 的能力，VC 是清除DPPH·和·OH 能力最強(qiáng)的，RAT和JLT清除·OH能力較強(qiáng)且兩者無顯著性差異，清除率是TCR 的7.8 倍；清除DPPH·能力由強(qiáng)到弱分別是TCR、RAT 和JLT，說明3種物質(zhì)都具有較強(qiáng)的抗氧化效果。

具有藥食同源的天然植物具有很高的營養(yǎng)價(jià)值和藥用功效，尤其是含有多酚類物質(zhì)而具有較強(qiáng)的抗氧化能力和清除自由基的能力，這是希望通過飼料途徑篩選單一或復(fù)合的天然植物進(jìn)入飼料配方的基本依據(jù)。需要關(guān)注的問題：一是不同天然植物產(chǎn)品含有的抗氧化、清除自由基的有效成分種類有差異，因而會(huì)在相同條件下顯示出不同的抗氧化、清除自由基的效率；二是不同于體外試驗(yàn)，對于活體動(dòng)物或活體細(xì)胞，不同的天然植物產(chǎn)品、不同的有效成分在抗氧化、清除自由基效率等方面存在一個(gè)適宜劑量效應(yīng)的問題，過多的添加量可能導(dǎo)致活體動(dòng)物或活體細(xì)胞出現(xiàn)損傷的情況。例如，有研究表明，當(dāng)植物多糖超過一定范圍后，會(huì)對細(xì)胞的生長造成負(fù)面影響[12]。首先確定天然植物水溶物試驗(yàn)濃度用于后續(xù)修復(fù)損傷細(xì)胞是必要的工作。與H2O2組相比，4種物質(zhì)都有提高細(xì)胞活力的趨勢，且RAT、TCR和VC組具有顯著性差異。除VC組外，細(xì)胞相對活力提升效果由高到低分別是：TCR＞RAT＞JLT，這也顯示了對H2O2損傷肝細(xì)胞修復(fù)能力的大小順序。

MDA是生物膜中不飽和脂肪酸被氧化后的代謝產(chǎn)物，對細(xì)胞有毒性，能反映細(xì)胞損傷和動(dòng)物脂質(zhì)過氧化程度[13]。SOD、CAT作為體內(nèi)重要的抗氧化酶，其活性能夠檢測水生動(dòng)物的抗氧化能力[14]。GSH 是動(dòng)物體內(nèi)一種天然的抗氧化劑，具有多個(gè)特殊功能的化學(xué)基團(tuán)，能清除體內(nèi)O2-·，保護(hù)細(xì)胞膜的完整性，具有抗脂質(zhì)氧化作用，能提高動(dòng)物抗氧化應(yīng)激能力[15]。本試驗(yàn)觀察到H2O2組CAT的抗氧化酶活性顯著性降低，MDA水平顯著上升，說明細(xì)胞膜受損且脂質(zhì)發(fā)生過氧化，抗氧化酶系統(tǒng)受損。在損傷細(xì)胞培養(yǎng)液中加入RAT、JLT、TCR的水溶物以及VC后，培養(yǎng)細(xì)胞24 h后，檢測到胞內(nèi)的CAT活性及GSH水平上升，MDA含量顯著下降。說明天然植物水溶物可以增加損傷細(xì)胞的抗氧化酶活性，減少M(fèi)DA積累，逆轉(zhuǎn)草魚肝胰臟細(xì)胞氧化應(yīng)激標(biāo)志物（O2-·、MDA）的變化。但是SOD活性卻在H2O2損傷后呈現(xiàn)上升的趨勢，這可能因?yàn)镾OD是機(jī)體內(nèi)清除O2-·唯一的清除劑。由于受到適當(dāng)?shù)难趸瘧?yīng)激后出于自身的保護(hù)作用呈現(xiàn)升高趨勢，F(xiàn)utakawa等[16]研究與本研究結(jié)果一致。

線粒體在調(diào)節(jié)細(xì)胞能量代謝中起關(guān)鍵作用，線粒體動(dòng)力學(xué)被認(rèn)為對維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的重要生理作用。線粒體動(dòng)力學(xué)降低，說明線粒體功能已損害，細(xì)胞可能已經(jīng)處于衰老或者死亡狀態(tài)。氧化應(yīng)激時(shí)自由基的增強(qiáng)進(jìn)一步惡化線粒體損傷，并打開線粒體通透性轉(zhuǎn)變孔（mtPTPs），這個(gè)過程誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[17]。本試驗(yàn)檢測結(jié)果顯示：與Con 組相比，H2O2組胞內(nèi)ROS 水平顯著升高，MMP顯著降低，RAT、JLT和TCR組的MMP與H2O2組相比有上升趨勢，降低胞內(nèi)ROS水平，保護(hù)線粒體膜的完整性。H2O2組的細(xì)胞凋亡百分比達(dá)到（35.72±0.93）%，與Con組相比有顯著升高趨勢，而加入天然植物水溶物和VC后降低了細(xì)胞凋亡率。自噬屬于細(xì)胞調(diào)控應(yīng)激和防御應(yīng)激的適應(yīng)性反應(yīng)，能降解受損細(xì)胞器，參與損傷修復(fù)，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[18-19]。有相關(guān)研究表明藥根堿能夠清除細(xì)胞ROS，可能與其對線粒體自噬有促進(jìn)作用有關(guān)[20]。本試驗(yàn)透射電鏡結(jié)果顯示，細(xì)胞受損傷后線粒體腫脹，嵴消失，加入RAT、JLT、TCR和VC后能夠緩解線粒體嵴消失情況，并且自噬小體和溶酶體數(shù)量增加，說明天然植物水溶物能促進(jìn)H2O2損傷細(xì)胞自噬，并緩解線粒體結(jié)構(gòu)的損傷促進(jìn)細(xì)胞清除受損結(jié)構(gòu)，抑制細(xì)胞氧化損傷。

細(xì)胞凋亡的兩條主要途徑都與Caspase-3有關(guān)[21]。半胱天冬酶在凋亡的啟動(dòng)中發(fā)揮重要作用，Caspase-3 蛋白位于細(xì)胞質(zhì)中，是細(xì)胞凋亡的主要執(zhí)行者[22]。有報(bào)道稱H2O2能夠增加促凋亡蛋白Bax、Caspase-3和Caspase-9的表達(dá)，介導(dǎo)線粒體途徑凋亡[23]。本試驗(yàn)中顯示H2O2組的Caspase-3蛋白和Bax蛋白表達(dá)顯著升高，說明H2O2能夠通過線粒體途徑引起細(xì)胞凋亡，3種天然植物水溶物處理細(xì)胞后Caspase-3 蛋白（除JLT組外）和Bax蛋白表達(dá)呈現(xiàn)降低趨勢，推測3種物質(zhì)可能通過抑制促凋亡蛋白的表達(dá)，從而抑制H2O2誘導(dǎo)線粒體途徑的肝細(xì)胞凋亡。

3.2 天然植物對損傷肝細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制

H2O2組與Con組的基因差異表達(dá)主要涉及“內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工”“胰島素信號(hào)通路”“MAPK 信號(hào)通路”“類固醇生物合成”等通路。

“鐵死亡”是一種鐵離子依賴性的程序性細(xì)胞死亡方式，能引起線粒體改變的氧化損傷[24]。與H2O2組相比，TCR組的基因差異表達(dá)主要涉及的與細(xì)胞凋亡相關(guān)通路有“鐵下垂”，TCR可能通過上調(diào)GPX4，降低鐵死亡的發(fā)生來緩解細(xì)胞凋亡；細(xì)胞自噬能調(diào)節(jié)物質(zhì)合成、平衡代謝、清除受損細(xì)胞器、促進(jìn)發(fā)育和分化，是細(xì)胞在惡性環(huán)境下確保生存的應(yīng)激反應(yīng)[25]。JLT組主要涉及“自噬”相關(guān)通路，影響其上游的HMGB1、DAPK基因引起B(yǎng)eclin-1上調(diào)來降解和回收利用細(xì)胞內(nèi)受損蛋白質(zhì)和細(xì)胞器，緩解受損細(xì)胞發(fā)生嚴(yán)重凋亡；鈣結(jié)合蛋白在體內(nèi)參與鈣離子的結(jié)合、調(diào)節(jié)鈣平衡、防止細(xì)胞損傷中起到了積極作用[26]。RAT組主要涉及“內(nèi)分泌和其他因素調(diào)節(jié)鈣重吸收”以及“自噬”相關(guān)通路，通過上調(diào)CALB1、CaBp28k、ATG6 和ATG9 的表達(dá)，調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬以及細(xì)胞內(nèi)Ca2+平衡，恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，修復(fù)細(xì)胞損傷凋亡；甲狀腺合成的甲狀腺素在維持動(dòng)物體的正常發(fā)育和促進(jìn)新陳代謝中起重要作用[27]，VC組主要涉及“甲狀腺激素合成”相關(guān)通路，通過TG表達(dá)上調(diào)促進(jìn)甲狀腺素合成以緩解細(xì)胞凋亡，有研究表明甲狀腺素可以改善重型顱腦損傷后的神經(jīng)細(xì)胞凋亡[28]。

4 結(jié)論

H2O2可能通過線粒體途徑導(dǎo)致草魚肝細(xì)胞氧化性損傷。天然植物復(fù)合物1、天然植物復(fù)合物2、訶子水溶物對草魚原代肝細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷具有緩解、修復(fù)作用，表現(xiàn)在具有清除體內(nèi)自由基和過氧化物的功能作用，具有提高細(xì)胞相對活力、提高細(xì)胞抗氧化能力的作用，具有促進(jìn)H2O2損傷細(xì)胞自噬、并緩解細(xì)胞核和線粒體結(jié)構(gòu)的損傷，通過調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)、下調(diào)Caspase-3和Bax蛋白的表達(dá)等途徑，從而減輕Caspase-3介導(dǎo)的線粒體途徑的凋亡和氧化損傷的作用，對肝胰臟的損傷修復(fù)和氧化損傷的保護(hù)具有一定的作用效果。