尹卓然，王 馳，軒棟棟，羅 勇，連文力，賈宏昉*

1. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，鄭州市文化路95 號(hào) 450002

2. 廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建省廈門市翔安區(qū)翔安南路4221-120 號(hào) 361000

煙草是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物，在生產(chǎn)過程中常施用硝態(tài)氮肥以提升煙葉的產(chǎn)量和品質(zhì)。硝態(tài)氮（NO3-）不僅是一種營養(yǎng)物質(zhì)還可以作為信號(hào)分子調(diào)節(jié)葉片生長［1］。Tahir 等［2］研究表明植物吸收與利用硝態(tài)氮（NO3-）主要是通過硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Nitrate transporter，NRT）完成的。當(dāng)外部硝酸鹽濃度小于1 mmol/L 時(shí)，主要是NRT2 家族編碼的高親和硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白系統(tǒng)（High-affinity nitrate transporter system，HATS）負(fù)責(zé)吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)硝酸鹽；當(dāng)外部硝酸鹽 濃 度 大 于1 mmol/L 時(shí)，NRT1/PTR（Nitrate transporter 1/Peptide transporters，NPF）家族編碼的低親和硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白系統(tǒng)（Low-affinity nitrate transporter system，LATS）負(fù)責(zé)對(duì)外部硝酸鹽進(jìn)行吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)［3-6］。由于適合煙草幼苗根系生長和葉片生物量積累的氮濃度為4 ～6 mmol/L［7］，故在適宜植物根系與葉片生長條件下硝酸鹽的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和再利用主要由NRT1/PTR家族負(fù)責(zé)，該家族在植物正常的生長發(fā)育過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［8-9］。

目前植物中關(guān)于NRT1 基因家族成員的研究主要集中在擬南芥和水稻中。已發(fā)現(xiàn)擬南芥中有53個(gè)NRT1/PTR家族成員基因［10］，12個(gè)基因的功能已經(jīng)明確［11］，其中：AtNRT1.4 參與葉柄中硝酸鹽的積累［12］；AtNRT1.5 主要參與硝酸根向木質(zhì)部的裝載［13］；AtNRT1.6 主要影響擬南芥胚的早期發(fā)育［14］；AtNRT1.7主要參與介導(dǎo)擬南芥韌皮部硝酸鹽再利用的過程［15-16］。水稻中至少有80 個(gè)NRT1/PRT 家族成員［17-18］，7個(gè)基因的功能已經(jīng)明確［11］，其中：OsNPF7.2［19］是水稻中第一個(gè)鑒定出的參與液泡NO3-運(yùn)輸?shù)腘PF基因，對(duì)根細(xì)胞內(nèi)硝酸根的平衡有重要意義；OsNPF2.2［20］參與了根中NO3-向地上部分的運(yùn)輸。而煙草NRT1/PTR 家族成員至少有9 個(gè)成員，目前僅Liu 等［21］初步研究了煙草NRT1 家族的2 個(gè)基因，其中NtNRT1.1在根系中特異性表達(dá)，而NtNRT1.2主要在衰老葉片中強(qiáng)烈表達(dá)，其余煙草NRT1家族基因的功能研究還鮮見報(bào)道。因此，克隆煙草硝酸鹽蛋白家族成員NtNRT1.7，鑒定其同源關(guān)系，測定不同氮濃度處理和不同非生物脅迫下基因的表達(dá)模式，旨在探究NRT1.7基因在脅迫條件下對(duì)氮素的調(diào)控機(jī)制，為培養(yǎng)氮素高效利用新品種提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

普通煙草品種K326在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱周期設(shè)置為16 h/8 h（光/暗），光強(qiáng)設(shè)置為300 μmol·m-2·s-1，溫度設(shè)置為28 ℃/22 ℃（光/暗），相對(duì)濕度設(shè)置為60%。對(duì)其進(jìn)行不同氮素條件、鹽處理、干旱處理和低溫處理。正常處理所采用的營養(yǎng)液試劑及其濃度為：5 mmol/L NaNO3；1 mmol/L NaH2PO4·2H2O；1 mmol/L K2SO4；0.75 mmol/L CaCl2·2H2O；0.5 mmol/L MgSO4·7H2O；9 μmol/L MnCl2·4H2O；0.03 μmol/L（NH4）2MoO4；46 μmol/L H3BO3；8 μmol/L ZnSO4·7H2O；3 μmol/L CuSO4·5H2O；20 μmol/L FeSO4·7H2O和Na2-EDTA螯合物，pH調(diào)至7.0。采用霍格蘭營養(yǎng)液水培法，在種子露白后使用1/4正常營養(yǎng)液培養(yǎng)3 d，之后更換為1/2 正常營養(yǎng)液培養(yǎng)3 d，最后更換為正常營養(yǎng)液培養(yǎng)4 d，培養(yǎng)結(jié)束后開始處理。氮素處理：設(shè)置正常處理（CK：5 mmol/L NO3-）和低氮處理（LN：0.25 mmol/L NO3-）2 個(gè)處理，處理時(shí)間分別為7 d；鹽脅迫處理：150 mmol/L NaCl 處理7 d；干旱處理：10%的PEG-6000處理7 d；低溫處理：4 ℃處理3 h。結(jié)束后取各處理長勢(shì)一致的3株幼苗用去離子水洗滌，提取樣品的根、莖、幼葉和老葉（幼葉為完全展開的葉片從上往下數(shù)第2片，老葉為完全展開的葉片從上往下數(shù)第7片），獲得檢測基因表達(dá)模式分析的供試材料。

1.2 目的基因的克隆

參考煙草、擬南芥和水稻等物種在GenBank 收錄的NRT1 基因序列，應(yīng)用Sol Genomics Network 和NCBI網(wǎng)站Blast程序搜索煙草EST序列數(shù)據(jù)庫。使用Primer Premier 6軟件設(shè)計(jì)煙草引物（表1），以煙草cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：94 ℃5 min；94 ℃30 s，58 ℃30 s，72 ℃2 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃5 min。將擴(kuò)增目的片段連接在中間載體pMD19-T 上，后送Invitrogen 生物公司測序驗(yàn)證，獲得全長cDNA序列信息。

表1 RT-PCR和定量PCR擴(kuò)增引物序列Tab.1 RT-PCR and quantitative PCR amplification primer sequences

1.3 序列分析方法

利 用NCBI 軟 件 的ORF finder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）進(jìn)行基因序列的蛋白翻譯。利用Expasy（https：//web.expasy.org/protparam/）和PRABI（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_auto mat.pl?page=/NPSA/npsa_sopm.html）分析NtNRT1.7的蛋白結(jié)構(gòu)，利用NetPhos 3.1（https：//services.health tech.dtu.dk/service.php?NetPhos-3.1）預(yù)測NRT1.7 的磷酸化位點(diǎn)。利用TMHMM 2.0（https：//services.hea lthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0）預(yù)測NRT1.7蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域。利用DNAMAN 進(jìn)行蛋白質(zhì)多序列比對(duì)分析；利用MEGA 6.0 制作鄰接樹（Neighbor-Joining Tree），分析NtNRT1.7 與NRT1 家族成員的親緣關(guān)系；在線網(wǎng)站MEME（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）分析序列基序（Motif），利用TBtools［22］將系統(tǒng)進(jìn)化樹和Motif組合，對(duì)NRT1.7 與煙草、擬南芥和水稻中的NRT1 家族進(jìn)行對(duì)比分析。

1.4 啟動(dòng)子分析

以煙草NtNRT1.7 基因全長序列為探針，利用Sol Genomics Network 網(wǎng)站進(jìn)行Blast 搜索基因全長，在起始密碼子ATG 上游取一段長1 500 bp 的啟動(dòng)子序列，利用PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在線工具分析啟動(dòng)子序列的順式元件。

1.5 亞細(xì)胞定位分析

設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)的特異引物，將擴(kuò)增得到的PCR 產(chǎn)物連到經(jīng)內(nèi)切酶酶切的pBWA（V）HS-GLosgfp 載體上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a 中，對(duì)陽性克隆進(jìn)行測序驗(yàn)證，獲得融合載體pBWA（V）HS-NtNRT1.7-GLosgfp。采用注射煙草表皮細(xì)胞的方法，將表達(dá)載體導(dǎo)入煙草表皮細(xì)胞，并置于22 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30～60 h 后，利用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光蛋白在煙草表皮細(xì)胞中的位置，未插入NtNRT1.7基因的pBWA（V）HS-GLosgfp空載體作對(duì)照。

1.6 基因表達(dá)分析

按 照Invitrogen 公 司 的RealMasterMix（SYBR Green）試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測，實(shí)時(shí)定量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以煙草組成型表達(dá)基因NtL25（GenBank：L18908.1）為內(nèi)參基因，進(jìn)行3 次重復(fù)試驗(yàn)，采用2-ΔΔCT）算法進(jìn)行分析。假設(shè)目的基因在脅迫處理下的表達(dá)量是對(duì)照（正常培養(yǎng)）的N 倍，N =2-ΔΔCT，ΔΔCT=Treat（CT樣品-CTL25）-CK（CT樣品-CTL25）［23］。

1.7 數(shù)據(jù)分析

使用DPS 7.5 軟件進(jìn)行單因素完全隨機(jī)試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，運(yùn)用LSD 法進(jìn)行多重比較，分析1%水平下的顯著性，運(yùn)用Origin 2018 制作基因相對(duì)表達(dá)量柱形圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因的克隆與序列分析

以K326 的cDNA 作為模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，瓊脂凝膠電泳結(jié)果（圖1）顯示克隆基因全長在1 500 bp和2 000 bp之間。進(jìn)一步對(duì)克隆基因NtNRT1.7的全長進(jìn)行序列分析，該序列全長為1 839 bp，可編碼612個(gè)氨基酸。

圖1 NtNRT1.7全長基因PCR擴(kuò)增電泳圖譜Fig.1 Electrophoretogram of PCR amplification of full-length NtNRT1.7

2.2 生物學(xué)分析

2.2.1 NtNRT1.7蛋白結(jié)構(gòu)

分析NtNRT1.7 蛋白結(jié)構(gòu)可知，其分子式為C3133H4877N793O859S30，分子量為68 358.78，理論等電點(diǎn)（pI）為8.91，含有45 個(gè)酸性氨基酸和53 個(gè)堿性氨基酸，不穩(wěn)定性指數(shù)（Ⅱ）為40.08，屬于不穩(wěn)定蛋白。該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要包含了46.08%的α螺旋，12.42%的β折疊結(jié)構(gòu)和37.91%的不規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)。

由磷酸化位點(diǎn)分析結(jié)果可知，NtNRT1.7 中含有37個(gè)絲氨酸、16個(gè)蘇氨酸和7個(gè)酪氨酸，推測在這些位點(diǎn)可能發(fā)生磷酸化。

2.2.2 NtNRT1.7的跨膜結(jié)構(gòu)域分析

圖2（0～1 之間）表示氨基酸位于螺旋、內(nèi)部或外部的總概率，頂部（1～1.2 之間）表示NtNRT1.7 跨膜結(jié)構(gòu)的最佳預(yù)測，也是總體最可能的結(jié)構(gòu)。預(yù)測結(jié)果顯示NtNRT1.7含有12個(gè)疏水的跨膜螺旋區(qū)，其中在第6 個(gè)和第7 個(gè)跨膜區(qū)之間有一個(gè)中央親水環(huán)將其分隔為2組。

圖2 NtNRT1.7蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域分析Fig.2 Transmembrane domain analysis of NtNRT1.7 protein

2.2.3 NtNRT1.7同源性與系統(tǒng)發(fā)育樹分析

NtNRT1.7 與擬南芥、水稻中NRT1 家族成員的同源性分析結(jié)果如圖3 所示。 NtNRT1.7 與NtNRT1.1 和NtNRT1.2 同源性分別為30.95%和31.43%；與AtNRT1.7 的同源性達(dá)到57.23%；與水稻OsNRT1.7 的同源性達(dá)35.51%。NtNRT1.7 與擬南芥AtNRT1.7、AtNRT1.6 的親緣關(guān)系較近（圖4），同時(shí)NtNRT1.7與擬南芥AtNRT1.7含有相似的Motif。

圖3 氨基酸序列同源性分析Fig.3 Homology analysis of amino acid sequences

圖4 NtNRT1.7系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of NtNRT1.7

2.3 啟動(dòng)子分析

如圖5 所示，NtNRT1.7 除含有啟動(dòng)子所必需的TATA-box和CAAT-box外，還含有3個(gè)脫落酸反應(yīng)性涉及的順式元件（ABRE），1 個(gè)生長素反應(yīng)元件（TGA-element）和3 個(gè)MBS。其中，ABRE 與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，促進(jìn)或抑制脫落酸誘導(dǎo)基因的表達(dá)，從而表現(xiàn)出加速或減緩植株衰老過程；TGA-element與生長素響應(yīng)因子結(jié)合后可以促進(jìn)或抑制基因的轉(zhuǎn)錄，從而影響植株的生長；MYB 與CAACTG 基序（MBS）結(jié)合激活了基因的表達(dá)，參與苯丙烷類代謝途徑，進(jìn)而增強(qiáng)抗植株抗逆性。

圖5 NtNRT1.7啟動(dòng)子克隆及啟動(dòng)子順式元件分析Fig.5 NtNRT1.7 promoter cloning and analysis of its cis-elements

2.4 亞細(xì)胞定位

激光共聚焦顯微鏡下觀察到在細(xì)胞膜上存在GFP 信號(hào)（圖6），說明轉(zhuǎn)pBWA（V）HS-NtNRT1.7-GLosgfp 融合蛋白存在于細(xì)胞膜上，NtNRT1.7 為膜蛋白，可作為載體轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞。

圖6 NtNRAT1.7亞細(xì)胞定位Fig.6 Subcellular localization of NtNRT1.7

2.5 表達(dá)特性

2.5.1 氮素處理下不同部位NtNRT1.7 基因的表達(dá)特性

圖7 可見，在正常處理下（CK：5 mmol/L NO3-），NtNRT1.7 主要在葉片中高表達(dá)，老葉相對(duì)表達(dá)量是根部相對(duì)表達(dá)量的105倍，葉片與根部的相對(duì)表達(dá)量間存在極顯著差異。在低氮處理下（LN：0.25 mmol/L NO），NtNRT1.7 在幼葉和根中的相對(duì)表達(dá)量有所增加，老葉中的相對(duì)表達(dá)量是正常處理下的20%，NtNRT1.7的相對(duì)表達(dá)量總體不及正常處理。整體來看，NtNRT1.7主要在葉片，尤其是衰老的葉片中高表達(dá)，低硝態(tài)氮處理時(shí)會(huì)抑制表達(dá)。

2.5.2 不同非生物脅迫下NtNRT1.7基因的表達(dá)特性圖8 可見，在不同生物脅迫下NtNRT1.7 基因的相對(duì)表達(dá)量均顯著增加。與正常處理相比，鹽脅迫、干旱脅迫與低溫脅迫條件下NtNRT1.7 相對(duì)表達(dá)量分別增加1.16 倍、1.29 倍和2.76 倍，存在極顯著差異。以上結(jié)果表明，NtNRT1.7 在煙草非生物脅迫應(yīng)答方面發(fā)揮著重要的作用。

圖8 不同非生物脅迫下NtNRT1.7基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.8 Relative expression of NtNRT1.7 gene under different abiotic stresses

3 討論

在煙草K326 中克隆出了NtNRT1.7 基因，對(duì)NtNRT1.7 進(jìn)行了生物學(xué)分析。結(jié)果顯示NtNRT1.7包含12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，且在第6和第7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)間有1個(gè)中央親水環(huán)，這與Tsay等［24］高等植物NRT1/PTR（NPF）在第6和第7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)間有1個(gè)中央親水環(huán)的研究結(jié)果一致。NtNRT1.7與AtNRT1.7高度同源，親緣關(guān)系較近，此外還發(fā)現(xiàn)NtNRT1.7蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)膜上，F(xiàn)an 等［16］的研究中也證實(shí)AtNRT1.7 蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)膜上，參與硝酸鹽的再利用，初步猜測NtNRT1.7是具有吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)硝酸鹽功能的膜蛋白。

進(jìn)一步分析煙草NtNRT1.7 的表達(dá)特征發(fā)現(xiàn)該基因主要在衰老的葉片中表達(dá)，其表達(dá)量為幼葉的8倍，根部的105 倍；在低氮條件下，NtNRT1.7 在幼葉中表達(dá)增強(qiáng)，在老葉和莖中表達(dá)減弱，這是因?yàn)闊熤晡障跛猁}后優(yōu)先供給幼葉生長，之后轉(zhuǎn)運(yùn)至中下部葉，最后到達(dá)根部［25］。在老葉中高表達(dá)暗示了NtNRT1.7 可能參與硝酸鹽的轉(zhuǎn)運(yùn)和再利用；老葉和莖中表達(dá)量降低暗示了低氮條件抑制了NtNRT1.7對(duì)硝酸鹽的轉(zhuǎn)運(yùn)。下一步可通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得NtNRT1.7過量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株系，研究NtNRT1.7在提高煙草氮素利用效率方面的功能。

NtNRT1.7 的啟動(dòng)子中除含有TATA-box 和CAAT-box等組織特異性元件外，還含有參與防御和應(yīng)激反應(yīng)的特異轉(zhuǎn)錄因子［26-27］結(jié)合的順式元件。其中MYB 通過調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)來促進(jìn)特定代謝產(chǎn)物花青素［28］的生成與積累，進(jìn)而增強(qiáng)抗干旱能力，暗示該基因可能參與各種非生物脅迫的調(diào)控。因此，通過qRT-PCR 進(jìn)一步研究NtNRT1.7 在不同非生物脅迫處理?xiàng)l件下的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)NtNRT1.7 基因受干旱、高鹽和冷害的脅迫誘導(dǎo)并增強(qiáng)表達(dá)，這和啟動(dòng)子序列分析的結(jié)果（含有3 個(gè)ABRE 基序，3 個(gè)MBS基序）一致，表明該基因可能參與了多種非生物脅迫下氮素的吸收與再利用。

4 結(jié)論

在煙草中克隆了低親和硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因NtNRT1.7，研究了NtNRT1.7 的蛋白結(jié)構(gòu)、跨膜結(jié)構(gòu)域、同源性和亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)該蛋白是膜蛋白，可能參與硝酸鹽的轉(zhuǎn)運(yùn)。啟動(dòng)子順式元件分析與基因的表達(dá)模式分析結(jié)果顯示，正常處理下NtNRT1.7 在老葉中高表達(dá)，低氮處理后NtNRT1.7 在老葉的表達(dá)量降低，非生物脅迫下表達(dá)量增強(qiáng)，說明該基因在受低硝態(tài)氮處理時(shí)抑制表達(dá)，可能參與調(diào)控?zé)熑~非生物脅迫下硝酸鹽的轉(zhuǎn)運(yùn)和再利用。