石 紅，陳 盈，楊曉燕

(肥城市中醫(yī)醫(yī)院、山東中醫(yī)藥高等專科學校附屬醫(yī)院病理科，山東 肥城 271600)

肺癌是最常見的惡性腫瘤，死亡率較高，GLOBOCAN統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示2018年肺癌患者死亡人數(shù)占所有癌癥死亡人數(shù)的18.4%，嚴重危害人類生命健康[1]。雖然肺癌的診斷方法和治療手段有所改善，但是大多數(shù)肺癌患者被診斷為晚期，患者的5年生存率仍然較低，約為18%[2]。而肺腺癌是肺癌最常見的組織學亞型，其發(fā)病率正在上升[3]。肺腺癌的發(fā)病機制尚未完全明確，因此迫切需要對肺腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機制進一步深入了解。circRNA參與細胞自噬、凋亡、細胞周期和增殖，與人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關[4]。環(huán)狀RNA 核受體相互作用蛋白1(circNRIP1)又稱為circ_0002711，是新近發(fā)現(xiàn)的circRNA之一，有研究[5-7]顯示circNRIP1在宮頸癌、胃癌和卵巢癌等腫瘤中表達升高，促進腫瘤細胞增殖、侵襲和轉移能力，其分子機制可能是通過調控AKT1/mTOR、ERK1/2等腫瘤相關信號通路發(fā)揮作用機制。circNRIP1具有作為抗腫瘤治療分子靶點的潛力，但其在肺腺癌中的作用及生物學功能未知，本研究對circNRIP1在肺腺癌組織中的表達意義及在肺腺癌細胞中發(fā)揮的作用機制進行了探討，以發(fā)掘circNRIP1作為抗肺腺癌治療分子靶點的潛力。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本

收集2016年6月至2020年6月在肥城市中醫(yī)醫(yī)院行手術切除的肺腺癌患者112例的癌組織和癌旁組織。入組標準：1)患者手術前未接受過任何形式的抗腫瘤治療；2)經(jīng)術中冰凍證實后凍存的肺腺癌和癌旁組織；3)原發(fā)性肺腺癌并未合并其他類型的惡性腫瘤；4)患者均簽署知情同意書。所有標本操作倫理均由本院倫理委員會審核通過。

1.2 主要試劑材料

RNA提取試劑盒、細胞周期檢測試劑盒、吉姆薩染液、蛋白上樣緩沖液和BCA蛋白濃度檢測試劑盒均購自上海碧云天試劑有限公司；RT-PCR試劑盒和circNRIP1、GAPDH引物均購自上海生工試劑有限公司；肺腺癌細胞A549購自美國ATCC細胞庫；細胞培養(yǎng)基、FBS和胰酶均購自上海弘順生物科技有限公司；circNRIP1 siRNA購自廣州銳博生物生物技術有限公司；MTS檢測試劑購于中國北京百奧萊博科技有限公司；細胞周期檢測試劑盒購于上海BestBio-貝博生物科技有限公司；Transwell小室購自美國coring公司；蛋白高效裂解液購自北京solarbio試劑有限公司；PVDF膜購自美國Promega公司；PI3K、AKT、pPI3K和pAKT、cyclinD1、MMP2和GAPDH一抗和鼠二抗、兔二抗購自美國proteintech公司；ECL化學發(fā)光試劑盒購自上?；鄯f生物科技有限公司。

1.3 qRT-PCR

取凍存的組織，研磨成粉末后，采用RNA提取試劑盒提取組織中RNA，采用Nanodrop2000檢測RNA的濃度和純度。以RNA為模板，采用AMV One-step RT-PCR試劑盒進行PCR反應，體系為RNA 1 μg、10×One Step RT-PCR Buffer 5 μL、上下游引物各2 μL、AMV RT 0.5 μL、Taq DNA polymerase 10 μL、RNase inhibitor 0.5 μL、無RNA酶的雙蒸水補足50 μL?；靹蚝?500上機進行擴增，首先45 ℃ 20 min逆轉錄、94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸30 s，共計40個循環(huán)，72 ℃終延伸 10 min，獲得各個樣品的循環(huán)閾值(threshold cvcle，Ct)。采用2-ΔΔCt法計算circNRIP1的表達量，以GAPDH基因為內對照。circNRIP1引物F:5′-TCCGGATGACATCAGAGCTAC-3′,R:5′-TCAAGTGTGCATCTTCTGGCT-3′；內參GAPDH引物F:5′- GCACCGTCAAGCTGAGAAC-3′,R:5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。

1.4 細胞培養(yǎng)和轉染

肺腺癌細胞A549復蘇后，800 r·min-1離心后重懸于DMEM-F12培養(yǎng)基中，F(xiàn)BS濃度為10%，放置在37 ℃、5%CO2的全濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。胰酶消化收集呈對數(shù)期生長的細胞，以每孔2×105個細胞接種至6孔板中，分為si-NC組和si-circNRIP1-1組、si-circNRIP1-2組。細胞貼壁后采用lip2000轉染circNRIP1 siRNA，si-circNRIP1-1組細胞中加入10 μL lip2000和5 μg circNRIP1 siRNA序列1,si-circNRIP1-2組細胞中加入10 μL lip2000和5 μg circNRIP1 siRNA序列2，si-NC組細胞加入10 μL lip2000和5 μg NC質粒。轉染48 h后收集細胞RNA，采用qRT-PCR檢測各組細胞中circNRIP1 siRNA的轉染效果。

1.5 MTS實驗

收集si-NC組和si-circNRIP1-1組、si-circNRIP1-2組細胞，以每孔2×103個細胞接種至96孔板，在細胞貼壁后計為0點，每隔24 h設計一個時間點，共0、24、48、72、96 h時間點，每個時間點設置6個復孔，放置37 ℃、5%CO2的全濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。于對應的時間點加入20 μL MTS試劑，放置培養(yǎng)箱中孵育2 h。采用酶標儀檢測490 nm處各孔的OD值(吸光度值)。

1.6 平板克隆實驗

收集si-NC組和si-circNRIP1-1組、si-circNRIP1-2組細胞，以每孔200個細胞進行96孔板接種，放置37 ℃、5%CO2的全濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周左右。待肉眼觀察到細胞克隆團形成(細胞數(shù)目大于50個)時，終止細胞培養(yǎng)。PBS洗3次后，加入甲醇固定液固定細胞20 min，加入吉姆薩染液與細胞孵育10 min，PBS洗3次后，計數(shù)細胞克隆團形成數(shù)目。

1.7 細胞周期實驗

收集si-NC組和si-circNRIP1-1組、si-circNRIP1-2組細胞，PBS洗2次后，以每管6×105個細胞收集至流式管中，每組設置3個管，加入500 μL的染色緩沖液，每管加入25 μL的碘化丙啶染色液(PI)、10 μL 的RNA酶混勻。于37 ℃中避光孵育10 min后，采用流式細胞儀檢測各組細胞周期情況。

1.8 Transwell實驗

收集si-NC組和si-circNRIP1-1組、si-circNRIP1-2組細胞，無血清培養(yǎng)基洗2次后，以每孔1×105個細胞接種至Transwell小室中，Transwell小室放至含有10% FBS 500 μL的血清培養(yǎng)基中，放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。棄掉培養(yǎng)基后終止培養(yǎng)，Transwell小室采用PBS洗3次后，加入甲醇固定液固定細胞后，加入吉姆薩染液與細胞孵育10 min，PBS洗3次后，顯微鏡下計數(shù)穿膜細胞數(shù)目。

1.9 Western blot檢測

收集si-NC組和si-circNRIP1-1組、si-circNRIP1-2組細胞，加入高效蛋白裂解液進行裂解，并在4 ℃高速離心獲得細胞總蛋白。檢測蛋白濃度后加入蛋白上樣緩沖液，蛋白經(jīng)沸水中煮沸后變性。10%的SDS-PAGE凝膠80 V電泳100 min，350 mA 100 V濕轉至PVDF膜上。PVDF膜與8%脫脂牛奶常溫孵育1 h，TBST洗3次，與目的一抗稀釋液(稀釋濃度比均為1:500)4 ℃孵育過夜。TBST洗3次，二抗稀釋液(稀釋濃度比為1:8000)室溫孵育1 h。TBST洗3次后進行蛋白條帶曝光。

1.10 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 circNRIP1在肺腺癌組織中的表達

qRT-PCR檢測結果顯示circNRIP1在112例肺腺癌組織和112例癌旁組織中的相對表達量分別為(1.59±0.74)和(0.95±0.39)。與癌旁組織相比，circNRIP1在肺腺癌組織中的表達顯著升高(t=8.097，P<0.001)。

2.2 circNRIP1表達與肺腺癌臨床病理參數(shù)的關系

circNRIP1表達與肺腺癌患者的年齡、性別和吸煙無關(P>0.05)。與肺腺癌腫瘤中高分化、TNM Ⅰ+Ⅱ期、無淋巴結轉移患者相比，腫瘤中低分化、TNM Ⅲ期、有淋巴結轉移患者肺腺癌組織中circNRIP1的表達顯著升高(P<0.05)。見表1。

表1 circNRIP1表達與患者臨床病理參數(shù)的關系

2.3 circNRIP1表達對肺腺癌患者生存的影響

采用Kaplan-Meier繪制生存曲線，Log Rank分析circNRIP1表達對肺腺癌患者生存預后的影響。與低表達circNRIP1的肺腺癌患者相比，高表達circNRIP1的肺腺癌患者預后較差(χ2=15.55，P<0.001)，見圖1。

2.4 circNRIP1 siRNA轉染肺腺癌細胞的效果

采用qRT-PCR檢測circNRIP1 siRNA轉染肺腺癌細胞A549的效果，結果顯示，與si-NC組相比，si-circNRIP1-1、si-circNRIP1-2組細胞中circNRIP1相對表達量顯著降低(P<0.001)，見圖2。

t/個月

*P<0.001與si-NC組相比。

2.5 circNRIP1 siRNA對肺腺癌細胞增殖能力的影響

MTS實驗結果顯示，與si-NC組相比，circNRIP1 siRNA轉染后si-circNRIP1-1組、si-circNRIP1-2組A549細胞增殖能力顯著降低(P<0.001)，見表2。

表2 不同時間點各組A549細胞OD值比較

2.6 circNRIP1 siRNA對肺腺癌細胞克隆形成能力的影響

平板克隆實驗檢測結果顯示，si-NC組和si-circNRIP1-1組、si-circNRIP1-2組細胞克隆團形成數(shù)目分別為(95.33±14.27)、(32.33±7.38)、(53.67±9.16)個，與si-NC組相比，si-circNRIP1-1組、si-circNRIP1-2組A549細胞克隆形成能力顯著降低(F=27.017,P<0.001)，見圖3。

2.7 circNRIP1 siRNA對肺腺癌細胞周期的影響

流式細胞儀檢測結果顯示，與si-NC組相比，si-circNRIP1-1組、si-circNRIP1-2組A549細胞周期阻滯在G0/G1期(P=0.004)，見表3。

圖3 平板克隆實驗檢測circNRIP1對肺腺癌細胞克隆形成能力的影響

表3 干擾circNRIP1的表達對肺腺癌細胞周期的影響

2.8 circNRIP1 siRNA對肺腺癌細胞轉移能力的影響

Transwell實驗結果顯示，si-NC組和si-circNRIP1-1組、si-circNRIP1-2組穿膜細胞數(shù)目為(112.33±15.24)、(21.67±6.58)、(26.67±5.73)個，與si-NC組相比，si-circNRIP1-1組、si-circNRIP1-2組A549細胞轉移能力顯著降低(F=75.791,P<0.001)，見圖4。

圖4 Transwell實驗檢測circNRIP1 siRNA對肺腺癌細胞A549轉移能力的影響

2.9 circNRIP1 siRNA對PI3K/AKT信號通路及其下游基因表達的影響

Western blot實驗檢測結果顯示，與si-NC組相比，si-circNRIP1-1組、si-circNRIP1-2組A549細胞中PI3K/AKT信號通路相關蛋白pPI3K和pAKT的表達顯著減少(P<0.001)，總蛋白PI3K和AKT蛋白的表達無顯著變化(P>0.05)；PI3K/AKT信號通路下游蛋白cyclinD1和MMP2的表達顯著減少(P<0.001)，見圖5、表4。

圖5 Western-blot實驗檢測circNRIP1對PI3K/AKT信號通路及其下游基因表達的影響

表4 干擾circNRIP1的表達對PI3K/AKT信號通路及其下游基因表達的影響

3 討論

目前肺腺癌的治療手段包括手術切除、放療、化療和分子靶向治療，其中對于早期患者手術切除具有較好的療效，而放療和化療對晚期患者的治療療效有限[3]。有研究[8]顯示肺腺癌患者存在ALK、KRAS、EGFR等基因的突變，針對突變基因的分子靶向療法顯著改善了患者的無進展生存期和總生存期，是目前治療肺腺癌患者最有前途的方法。分子靶向藥物的耐藥以及未存在突變基因導致肺腺癌患者的總體存活率仍然遠遠不能令人滿意。肺腺癌治療的復雜性在于其在腫瘤組織內的異質性，其異質性不僅與遺傳因素密切相關，同時還受到表觀遺傳學改變的調控[9]。因此研究肺腺癌表觀遺傳學改變可能是尋找新型分子治療靶點的重要途徑。

具有環(huán)狀共價封閉結構的circRNA來源于數(shù)千個真核基因的前體mRNA反向剪接，先前認為circRNA不具有生物學功能，隨著高通量測序分析和生物信息學方法的發(fā)展，更多的circRNA及功能被發(fā)現(xiàn)，其中circRNA充當miRNA海綿，并與RNA結合蛋白相互作用調節(jié)轉錄，屬于表觀遺傳學范疇[10]。越來越多的研究[4]表明，circRNA與肺腺癌等多種腫瘤密切相關，已成為新型生物標志物和診斷、治療潛在生物標記。circNRIP1源自NRIP1基因座的circRNA，位于染色體chr21：16,386,664-16,415,895上，多項研究[5-6]顯示circNRIP1為腫瘤進展的驅動因素。LI等[5]研究報道，circNRIP1在宮頸癌組織中表達上調，其表達水平與淋巴管浸潤相關。LIANG等[6]研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌組織和細胞中circNRIP1表達增強，并且circNRIP1的高表達與患者生存期較差有關。circNRIP1在肺腺癌中的表達水平及臨床意義未見有報道。本研究采用qRT-PCR檢測結果顯示，circNRIP1在肺腺癌組織中表達顯著上調，統(tǒng)計分析顯示circNRIP1高表達與肺腺癌患者腫瘤分化程度、TNM分期和淋巴結轉移顯著相關，并且高表達circNRIP1的肺腺癌患者預后較差，與上述研究報道一致。同時表明circNRIP1高表達促進肺腺癌的惡性進展，可能是肺腺癌患者預后不良的潛在分子標志物。既往研究[5-7]顯示circNRIP1促進宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲能力，敲除circNRIP1可抑制胃癌細胞遷移和侵襲能力，誘導細胞周期阻滯在G0-G1期，并促進細胞的凋亡。本研究為了探討circNRIP1在肺腺癌中發(fā)揮的生物學功能，首先采用小干擾RNA敲減肺腺癌細胞A549中circNRIP1的表達，功能實驗顯示肺腺癌細胞的增殖、平板克隆形成能力和轉移能力均顯著降低，并且將細胞周期阻滯在G0/G1期。

circNRIP1促進肺腺癌細胞增殖和轉移能力的作用已經(jīng)明確，但是其作用機制仍需進一步探討。LIN等[11]報道circNRIP1通過與miR-515-5p競爭性結合，抑制miR-515-5p與IL-25的結合，從而抑制miR-515-5p在轉錄后水平對IL-25的調控，最終促進鼻咽癌細胞對5-FU和順鉑的耐藥。在宮頸癌中circNRIP1通過部分作用于miR-629-3p，調節(jié)PTP4A1/ERK1/2途徑促進細胞增殖和轉移[5]。circNRIP1通過調控AKT1/mTOR信號通路促進胃癌細胞增殖、侵襲和轉移[6]。ERK1/2、AKT1/mTOR信號通路的激活是促進腫瘤惡性進展的重要作用機制[12-13]，PI3K是調控AKT1/mTOR的上游分子，mTOR是PI3K/AKT的靶基因之一，PI3K/AKT是調控腫瘤增殖和轉移的腫瘤經(jīng)典信號通路之一，其在肺腺癌惡性進展過程中處于激活狀態(tài)[14]。PI3K、AKT蛋白磷酸化為pPI3K、pAKT是激活PI3K/AKT信號通路的關鍵，其激活后促進靶基因的表達發(fā)揮調控腫瘤惡性進展的作用。筆者發(fā)現(xiàn)抑制circNRIP1的表達后，肺腺癌細胞中pPI3K和pAKT蛋白的表達降低。其中PI3K/AKT信號通路靶基因之一cyclinD1是細胞周期調控蛋白，其表達增加促進細胞周期由G0/G1期至S期的轉變，進而促進細胞增殖[15]。本研究顯示敲減circNRIP1的表達后，肺腺癌細胞周期阻滯在G0/G1期，同時肺腺癌細胞中cyclinD1的表達也降低，表明circNRIP1通過調控PI3K/AKT/cyclinD1信號通路促進肺腺癌細胞增殖。有研究[16]報道PI3K/AKT/MMP2信號軸是促進肺腺癌轉移的分子機制之一，MMP2屬于基質金屬蛋白酶家族蛋白，通過破壞細胞基質促進腫瘤細胞轉移。本研究發(fā)現(xiàn)干擾circNRIP1的表達可抑制肺腺癌細胞中MMP2蛋白的表達。

綜上所述，circNRIP1在肺腺癌中表達上調，促進肺腺癌惡性進展。干擾circNRIP1的表達抑制肺腺癌細胞增殖和轉移能力，可能是通過調控PI3K/AKT信號通路發(fā)揮作用。circNRIP1是肺腺癌治療的潛在分子靶點。