程兆瑞，程小平孫誠誼，喻 超

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)a.研究生院; b.附屬醫(yī)院肝膽外科，貴陽 550000； 2.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，南昌 330006)

肝細(xì)胞癌(HCC)是世界上最常見的癌癥之一，在全球癌癥相關(guān)死亡原因中排名第三[1-2]。目前,已知的HCC主要致病因素包括病毒性肝炎、攝入黃曲霉素等有毒物質(zhì)、非酒精性脂肪性肝炎和酒精相關(guān)性肝病等[3-4]。然而，多數(shù)HCC患者確診時已是晚期，預(yù)后往往不佳。因此，尋找一個有效的生物學(xué)標(biāo)志物和新的治療靶點是一項緊迫且意義重大的任務(wù)。microRNA(miRNA)是指序列長度為22～25個堿基的內(nèi)源性非編碼RNA，通過與靶mRNA的3′非翻譯區(qū)(UTR)結(jié)合來誘導(dǎo)mRNA降解或抑制其翻譯[4-5]。miRNAs的失調(diào)常見于多種人類惡性腫瘤，有研究[6-7]發(fā)現(xiàn)miRNAs在細(xì)胞凋亡、增殖、分化等生理過程中具有關(guān)鍵作用。因此，miRNA已被公認(rèn)為是HCC診斷與治療中很有前景的治療和預(yù)后生物標(biāo)志物。最新研究[8]發(fā)現(xiàn)miR-4746-5p是一種新型的癌癥相關(guān)微小RNA，在多種癌癥中異常表達，其表達水平可用于預(yù)測患者存活率。雖然已有研究[9]報道m(xù)iR-4746-5p在肝癌中顯著上調(diào)且與肝癌患者不佳預(yù)后相關(guān)，但未見有探討miR-4746-5p表達與肝癌患者臨床病理特征關(guān)系的獨立研究。本研究基于癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫探索miR-4746-5p在肝癌中的表達及其與臨床病理特征、免疫浸潤的相關(guān)性，以期為miR-4746-5p在HCC診療及預(yù)后預(yù)測中的應(yīng)用提供新的線索和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

從TCGA數(shù)據(jù)庫(https://cancergenome.nih.gov/)下載HCC患者的臨床信息和miR-4746-5p的表達數(shù)據(jù)，用R軟件(v3.6.3)處理并整合數(shù)據(jù)，剔除生存隨訪數(shù)據(jù)不全和miR-4746-5p表達缺失的病例樣本。共獲得375例肝癌和50例癌旁肝組織的數(shù)據(jù)。將375例肝癌以miR-4746-5p表達量的中位數(shù)為界，分為高表達組(n=188)和低表達組(n=187)。

1.2 生物信息學(xué)分析

mirDIP(http://ophid.utoronto.ca/mirDIP/index.jsp#r)綜合了15個miRNA數(shù)據(jù)庫[10]，可用于預(yù)測miR-4746-5p的潛在靶基因。從GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/)網(wǎng)站下載HCC的差異表達基因?；虮倔w(GO)功能、京都基因與基因組百科全書(KEGG)均基于R軟件以“FDR<0.2和P<0.05”為閾值，用“cluster Profiler”包進行富集分析，用“ggplot2”包進行可視化。利用Kaplan-Meier Plotter網(wǎng)站分析miR-4746-5p的潛在靶基因在HCC中的預(yù)后價值。

1.3 通過ssGSEA分析免疫細(xì)胞特征

HCC免疫浸潤水平通過單樣本基因集富集分析(ssGSEA)和R軟件中的GSVA包進行分析。首先對腫瘤樣本中的24種免疫細(xì)胞進行GSEA分析，然后根據(jù)各種免疫細(xì)胞的特征基因，從每個腫瘤樣本的基因表達譜中量化每種免疫細(xì)胞的相對富集分?jǐn)?shù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用R語言edgeR軟件包進行統(tǒng)計分析。miR-4746-5p在肝癌組織與癌旁組織的表達差異比較，如果數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，則采用配對樣本t檢驗比較；如數(shù)據(jù)不服從正態(tài)分布，則采用Wilcoxom秩和檢驗。ROC曲線采用“pROC”包生成。miR-4746-5p表達水平與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系采用Logistic回歸分析。采用Cox單因素、多因素回歸分析和Kaplan-Meier法進行生存分析。采用Spearman相關(guān)性分析miR-4746-5p與免疫細(xì)胞浸潤水平的相關(guān)性以及免疫細(xì)胞浸潤水平與miR-4746-5p不同表達的相關(guān)性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝癌組織miR-4746-5p的表達差異

通過對TCGA數(shù)據(jù)庫分析顯示，miR-4746-5p在肝癌組織中的表達明顯高于正常肝組織(P<0.01，圖1A)及配對癌旁組織(P<0.01，圖1B)；T3/T4期肝癌患者miR-4746-5p表達水平較T1/T2期患者明顯增高(均P<0.05，圖1C)，Ⅲ/Ⅳ期(TNM分期)肝癌患者miR-4746-5p表達水平較Ⅰ/Ⅱ期患者明顯增高(P<0.05，圖1D)，組織學(xué)水平G3/G4級肝癌患者較G1/G2級患者明顯增高(P<0.05，圖1E)。miR-4746-5p在肝癌ROC曲線下面積為0.891(圖1F)。

圖1 miR-4746-5p在肝癌組織中的表達差異及ROC曲線

2.2 miR-4746-5p表達與肝癌患者臨床病理特征的關(guān)系

miR-4746-5p表達水平與TNM分期、組織學(xué)分級、年齡、甲胎蛋白水平、是否伴血管侵犯及T分期顯著相關(guān)(P<0.05)，見表1。

表1 miR-4746-5p表達與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 miR-4746-5p表達水平與肝癌患者不良預(yù)后的關(guān)系

Kaplan-Meier分析顯示，高表達組總生存期和疾病特異生存時間較低表達組明顯縮短(P=0.018、0.016,圖2A—B)。單因素Cox分析顯示，T分期、M分期、TNM分期及miR-4746-5p表達水平是影響肝癌患者總生存率的危險因素(P<0.05)，進一步多因素Cox分析顯示，TNM分期和miR-4746-5p表達水平是影響肝癌患者總生存率的獨立危險因素(P<0.01)，見表2。

圖2 miR-4746-5p表達與肝癌患者不良預(yù)后的關(guān)系

表2 肝癌預(yù)后影響因素的單因素和多因素Cox回歸分析

2.4 miR-4746-5p靶基因富集分析

通過miRDIP數(shù)據(jù)庫預(yù)測，可找到miR-4746-5p的潛在靶基因共821個，利用GO/KEGG對821個靶基因進行GO/KEGG富集分析后發(fā)現(xiàn)：生物過程類(BP)靶基因主要富集的條目是“正調(diào)節(jié)分化相關(guān)的細(xì)胞形態(tài)”“小GTP酶結(jié)合活性”“軸突部的組成”(圖3A)；靶基因主要富集的信號通路是MAPK信號通路、軸突引導(dǎo)信號通路、自噬信號通路等(圖3B)。

圖3 miR-4746-5p靶基因的富集分析

2.5 miR-4746-5p表達與HCC免疫浸潤水平的關(guān)系

Spearman相關(guān)分析顯示，miR-4746-5p表達與癌組織中性粒細(xì)胞(Neutrophils)、NK細(xì)胞(NK cells)、巨噬細(xì)胞(Macrophages)、CD8 T細(xì)胞(CD8 T cells)等免疫細(xì)胞的豐度呈負(fù)相關(guān)，而與Th2細(xì)胞(Th2 cells)、輔助性T細(xì)胞(T helper cells)、濾泡性輔助T細(xì)胞(TFH)、樹突狀細(xì)胞(aDC)等的豐度呈正相關(guān)(圖4A)；miR-4746-5p表達水平與 Th2 細(xì)胞浸潤水平呈顯著正相關(guān)(r=0.546、P<0.001，圖4B)。Wilcoxon秩和檢驗結(jié)果也同樣顯示，miR-4746-5p高表達組中Th2細(xì)胞的富集評分較低表達組顯著升高(圖4B)。

圖4 miR-4746-5p表達與HCC免疫浸潤水平的關(guān)系

2.6 miR-4746-5p靶基因的表達水平及其預(yù)后分析

首先使用GEPIA數(shù)據(jù)庫來鑒定肝細(xì)胞癌樣本和正常樣本之間的差異表達基因(篩選條件：|Log2FC|臨界值=1，P臨界值=0.01)，共篩選出了2207個差異表達基因(圖5A)。并對HCC的差異基因和miR-4746-5p的下游靶基因進行綜合分析后，交集出67個差異靶基因，其中22個基因在HCC中下調(diào)(圖5B)，進一步通過Kaplan-Meier Plotter網(wǎng)站評估這22個下調(diào)基因在HCC預(yù)后中的作用(以P<0.05作為篩選條件)，結(jié)果顯示，ASPG、CXCL12、IGF2、c11orf96、SEC31B 5個基因的表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖5C)。

圖5 miR-4746-5p靶基因表達水平及其預(yù)后生存率分析

圖5(續(xù))

3 討論

盡管關(guān)于HCC的靶向藥物開發(fā)和臨床綜合治療的研究不斷取得新進展，但仍有很大一部分肝癌患者因疾病發(fā)展到晚期才得到診斷，導(dǎo)致預(yù)后不佳而死亡。因此，迫切需要尋找一個新的生物標(biāo)志物來幫助患者確診，改善預(yù)后[11]。近年來，隨著大數(shù)據(jù)發(fā)展和高通量測序技術(shù)的進步，TCGA數(shù)據(jù)庫收集并公開共享了大量各種癌癥患者的原始數(shù)據(jù)，供研究人員進行各種生物信息學(xué)研究，為腫瘤的診斷和治療提供重要的生物標(biāo)志物[12]。最近研究[8，13-15]發(fā)現(xiàn)miR-4746-5p作為一種新型的促癌因子，在頭頸鱗癌、肝癌、乳腺癌等腫瘤中顯著上調(diào)，并且與患者不良預(yù)后相關(guān)。ZHANG等[13]研究報道m(xù)iR-4746-5p在頭頸部鱗癌中過表達，并通過EMT相關(guān)通路參與HPV16陽性頭頸癌的進展，影響患者預(yù)后。KUMARAN等[15]研究發(fā)現(xiàn)miR-4746-5p在乳腺癌組織中特異性表達。

本研究基于TCGA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)：miR-4746-5p在肝癌中的表達顯著高于正常肝組織及配對的癌旁組織；并且miR-4746-5p在HCC中的高表達與晚期臨床病理特征(年齡、病理分期、組織學(xué)類型、血管侵犯、AFP水平)和短生存期有關(guān)；ROC特異性分析也表明miR-4746-5p對HCC具有較高的診斷價值，這些結(jié)果都提示miR-4746-5p可能是HCC的潛在分子靶標(biāo)。為了進一步探究miR-4746-5p的生物學(xué)功能及作用機制，本文利用miRDIP數(shù)據(jù)庫對miR-4746-5p進行了靶基因預(yù)測，共獲得821個潛在靶基因，并在此基礎(chǔ)上進行GO功能注釋及KEGG富集分析。結(jié)果顯示其靶基因參與的主要生物學(xué)過程有：正調(diào)節(jié)分化相關(guān)的細(xì)胞形態(tài)、小GTP酶結(jié)合活性和軸突部的組成；且主要富集于MAPK信號通路、軸突引導(dǎo)信號通路、自噬信號通路等通路來參與肝癌的惡性發(fā)展。本研究還利用GEPIA數(shù)據(jù)庫下載了HCC中2207個顯著差異基因并與下游靶基因交集后得到67個基因，其中22個基因在肝癌中呈低表達，進一步利用Kaplan-Meier Plotter網(wǎng)站分析并篩選出與肝癌患者預(yù)后相關(guān)的5個基因(ASPG、CXCL12、IGF2、C11orf96、SEC31B)。BELVISO等[16]研究發(fā)現(xiàn)ASPG能夠顯著誘導(dǎo)K562細(xì)胞的凋亡從而抑制白血病的發(fā)展，是一種有前途的抗癌靶標(biāo)。KHARE等[17]發(fā)現(xiàn)CXCL12可與CXCR4參與結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲、血管生成和轉(zhuǎn)移。本文結(jié)果提示miR-4746-5p可能通過調(diào)控ASPG/CXCL12/IGF2/C11orf96/SEC31B軸來促進HCC的發(fā)生與發(fā)展并導(dǎo)致患者不良預(yù)后。本研究還發(fā)現(xiàn)，miR-4746-5p表達水平與HCC中多種免疫細(xì)胞浸潤水平相關(guān)：與Th2細(xì)胞和aDC的浸潤水平之間存在中到強的正相關(guān)；與TFH細(xì)胞、輔助型T細(xì)胞的浸潤水平呈顯著正相關(guān),但與巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、NK細(xì)胞浸潤水平呈負(fù)相關(guān)。有研究[18]表明Th1/Th2平衡的異常變化與多種腫瘤患者的不良預(yù)后相關(guān)，過高水平的Th2細(xì)胞是引起肝癌患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的重要危險因素[19]。因此miR-4746-5p可能通過改變免疫細(xì)胞浸潤水平來促進HCC的惡性發(fā)展，提示miR-4746-5p或是HCC的潛在治療靶點。但是，本研究僅進行了生物信息學(xué)分析，未進行臨床樣本收集及細(xì)胞水平驗證，后續(xù)計劃將在肝癌細(xì)胞系中進行關(guān)于miR-4746-5p生物學(xué)功能及機制的研究。