劉德志，王維浩,2，全志剛，趙姝婷，武云嬌，王一飛，蘇有韜，曹龍奎,2,

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江大慶 163319；2.國家雜糧工程技術(shù)研究中心，黑龍江大慶 163319）

綠豆（Vigna radiata），又名青小豆，是中國主要豆科作物之一，年產(chǎn)量近100 萬t，約占世界總產(chǎn)量的30%[1]。綠豆具有較高的營養(yǎng)與保健價值，富含淀粉、蛋白質(zhì)、膳食纖維、維生素、鈣、硒等營養(yǎng)素，其中淀粉是豆類種子中最為豐富的碳水化合物，含量約為51.9%~53.7%[2?3]。相比于資源利用較充足的玉米淀粉和馬鈴薯淀粉，由于綠豆淀粉本身具有凝膠性強(qiáng)、易老化回生的特性，對于綠豆淀粉深層次的開發(fā)和利用不夠，因此以綠豆淀粉為原料進(jìn)行綜合利用是今后重點(diǎn)研究方向。

隨著生活水平的日益提高，由于不合理的能量攝入，導(dǎo)致高血糖、高血脂等慢性代謝疾病發(fā)病率逐年增加，有研究表明這與人們?nèi)粘ｏ嬍持械纳攀忱w維攝入量不足有關(guān)[4]?？剐院≧esistant Dextrin，RD），又稱難消化糊精，是以淀粉為原料制備的一種低GI（升糖指數(shù)）水溶性膳食纖維，屬綠色農(nóng)業(yè)深加工產(chǎn)品[5]?？剐院哂懈呷芙舛?、耐酸熱、低粘度的優(yōu)良的加工特性，通常被用于飲料、肉制品、面制品等加工食品中[6]。此外，研究表明抗性糊精不被人體消化酶利用，大部分在結(jié)腸中被腸道微生物發(fā)酵利用發(fā)揮多種生理功能[7]，如降低血漿甘油三酯，減輕肥胖[8]，調(diào)控餐后血糖及胰島素抵抗水平，防治糖尿病等代謝疾病[9]。目前，國內(nèi)外對抗性糊精的研究大多數(shù)集中在制備方法[10]、理化特性[11]、生理功能[12]等方面，但對抗性糊精的分子結(jié)構(gòu)表征及抗消化特性研究鮮有報(bào)道。因此，本研究以綠豆淀粉為原料，采用酸熱法制備綠豆抗性糊精，對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征并通過模擬體外消化探究抗消化特性，為開發(fā)具有低血糖生成指數(shù)的功能性膳食纖維提供理論基礎(chǔ)與數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

綠豆淀粉（純度為89.5%） 實(shí)驗(yàn)室自制；耐高溫α-淀粉酶（4×104U/g）、堿性蛋白酶（6×104U/g）上海金穗生物科技有限公司；糖化酶（1×105U/mL）

北京生化試劑有限公司；豬胰α-淀粉酶（50 U/mg）、黑曲霉淀粉葡萄糖苷酶（1×104U/mL） Sigma 公司；葡萄糖檢測試劑盒（GOPOD） 購于愛爾蘭Megazyme 公司；溴化鉀 光譜級，天津市大茂化學(xué)試劑廠；其余等試劑均為國產(chǎn)分析純。

HD9920 高速空氣循環(huán)加熱器 美的科技有限公司；RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮儀器廠；GPhenomG2 掃描電子顯微鏡 Phenom World 公司；D8ADVANCE X-射線粉末衍射儀 德國布魯克公司；NP-800PRF 偏光顯微鏡 日本奧林巴斯公司；Nicolet 6700 傅里葉變換紅外光譜儀 美國Thermo Fisher 公司；GPC-20A 凝膠滲透色譜儀 日本津島TOSOH 公司；Bruker AVANCE 600 核磁共振儀德國布魯克公司；Ald-2LD plus 真空冷凍干燥機(jī)德國Christ 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 粗糊精的制備 參照陳磊[13]的方法進(jìn)行制備，稱取綠豆淀粉，添加1%的鹽酸，使酸濃度達(dá)到淀粉干基0.10%，再添加1%的檸檬酸占干淀粉0.10%，在鼓風(fēng)干燥箱中預(yù)烘干，使其水分含量低于5%。將預(yù)烘干的酸解淀粉，放入高速循環(huán)氣流加熱器中，設(shè)定溫度170 ℃，加熱時間60 min，進(jìn)行酸熱糊精化反應(yīng)，迅速冷卻至室溫，得到粗糊精。

1.2.2 抗性糊精的制備 參照張穎等[14]方法略作修改，將粗糊精用0.05 mol/L 的磷酸鹽緩沖溶液（pH=6）配成50%的溶液，加入0.5%的耐高溫α-淀粉酶水浴酶解2 h，0.2%的堿性蛋白酶酶解1 h，0.2%的糖化酶酶解36 h，進(jìn)行離心分離（5000 r/min、10 min），將酶解液添加活性炭充分?jǐn)嚢杳撋?，采用納濾膜脫鹽處理，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至原體積的1/3，加入4 倍體積的95%乙醇沉淀，于4 ℃冰箱中醇沉過夜，冷凍干燥得到抗性糊精。

1.2.3 綠豆抗性糊精的結(jié)構(gòu)表征

1.2.3.1 掃描電子顯微鏡 將待測樣品均勻分散在導(dǎo)電的樣品臺上，貼在圓形存根上進(jìn)行涂金，保持在3.0 kV 加速電壓下，用導(dǎo)電膠將樣品進(jìn)行固定，利用離子濺射鍍膜儀噴金，放大500 和10 倍觀察樣品顆粒的照片。

1.2.3.2 X-射線衍射 將干燥樣品放置玻璃板上，射線衍射在40 kV 和3 mA 的條件下工作，采用廣角衍射儀衍射，掃描區(qū)域?yàn)?~60°（2θ），輻射線為Cu Kα，以2°/min 的速度，掃描步長間隔為0.02，DS-SSRS 設(shè)置分別為1~0.1 mm，并用JADE 6.0 軟件計(jì)算相對結(jié)晶度，并導(dǎo)出相應(yīng)曲線。

1.2.3.3 偏光顯微鏡分析 將樣品配成1%的懸液，混勻使樣品顆粒充分分散，滴1 滴于潔凈的載玻片上，然后將蓋玻片緩慢放置以避免形成氣泡。在目鏡和物鏡10/50 倍的放大倍數(shù)下，捕獲圖像并進(jìn)行分析。

1.2.3.4 傅里葉紅外光譜 稱取一定量樣品與干燥的KBr 粉末以1:100 的質(zhì)量比（樣品:溴化鉀）于瑪瑙研缽研磨混勻，壓片厚度為0.4 mm，放入傅立葉紅外光譜儀光束中進(jìn)行全波段的掃描，在室溫（22±1 ℃）條件下，空氣為背景，分辨率為4 cm?1，掃描范圍為4000~400 cm?1，掃描32 次，進(jìn)行歸一化處理，得到紅外光譜圖并進(jìn)行分析。

1.2.3.5 凝膠色譜分析 參照張婷等[15]測定方法略作修改測定。20 mg 樣品溶解于1 mL 的DMSO 溶液，用注射器吸取上清液分子膜過濾，微量注射器吸取100 μL 濾液，注入GPC 色譜組。采用相對校正法，色譜柱：TSKGELGMPWXL 300 mm×7.8 mm 凝膠色譜柱，控制流速：0.6 mL/min。

1.2.3.6 核磁共振氫譜 將樣品溶解在1 mL 的D2O（10 mg/mL）中，使用500 MHz 核磁共振波譜儀，在25 ℃下，每秒進(jìn)行32 次單獨(dú)掃描，掃描寬度為16 ppm，在相位循環(huán)探測模式下記錄。

1.2.4 模擬體外消化特性 參照Englyst[16]和戚明明等[17]體外模擬消化模型，并略作修改。精確取0.20 g 樣品置于20 mL 的醋酸鈉緩沖液（pH=5.2，0.5 mol/L）的三角錐形瓶中，然后在沸水糊化30 min，冷卻室溫后加5 mL 混合酶液（含有290 U/mL 豬胰α-淀粉酶和20 U/mL 黑曲霉淀粉葡萄糖苷酶），置于37 ℃恒溫?fù)u床中，以190 r/min 充分振蕩培養(yǎng)，測定水解20、60、90、120、180 min 內(nèi)產(chǎn)生葡萄糖含量，分別取0.1 mL 水解液加入1 mL 無水乙醇進(jìn)行滅酶處理，采用GOPOD 試劑盒在50 ℃恒溫水浴鍋顯色20 min 測定還原糖含量，計(jì)算水解率和抗消化特性。

式中：HR 為水解率，%；Gt不同時間還原糖含量，mg；G0初始還原糖含量，mg；M 樣品的質(zhì)量，mg；0.9 葡萄糖換算系數(shù)；RDS 表示易消化淀粉含量、SDS 表示慢消化淀粉含量、RS 表示抗消化淀粉含量，%；G20表示酶解20 min 時葡萄糖質(zhì)量，mg；G120表示酶解120 min 時葡萄糖質(zhì)量，mg；Ts 為底總糖含量，mg。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS22.0 軟件進(jìn)行ANOVA 法分析差異顯著性（P＜0.05），各數(shù)據(jù)重復(fù)測定三次，取用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示，采用Origin 2019、MestReNova4軟件進(jìn)行繪圖處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠豆抗性糊精的結(jié)構(gòu)表征

2.1.1 掃描電鏡分析 通過掃描電子顯微鏡對綠豆淀粉與綠豆抗性糊精的顆粒表面形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較。由圖1 可知，天然綠豆淀粉顆形態(tài)呈橢圓形，少量顆粒呈球形狀結(jié)構(gòu)，表面光滑且無裂痕；相反，綠豆抗性糊精的顆粒呈大小不一的不規(guī)則碎片結(jié)構(gòu)，表面局部隆起呈現(xiàn)片層狀，有明顯凹坑且發(fā)生聚集現(xiàn)象，這表明在酸熱條件作用下，淀粉顆粒的無定形區(qū)域的晶體片層被破壞，不能再形成周期性的片層結(jié)構(gòu)，此研究結(jié)果與Zhen 等[18]研究抗性糊精的顆粒形態(tài)結(jié)構(gòu)相符合。由于發(fā)生酸熱糊精化反應(yīng)，淀粉顆粒發(fā)生破裂，內(nèi)部結(jié)構(gòu)遭到一定程度的破壞，使淀粉分子發(fā)生一定程度的降解，而降解后的小分子物質(zhì)，進(jìn)一步發(fā)生糖基轉(zhuǎn)移和聚合反應(yīng)，重新聚合成大小不一，表面粗糙的致密顆粒[19]。研究表明致密、結(jié)構(gòu)不規(guī)則的顆粒具有較強(qiáng)的抗酶解特性，顆粒形態(tài)的變化與其消化性密切相關(guān)[20]，由此推斷粗糙表面且有致密結(jié)構(gòu)的綠豆抗性糊精具有更強(qiáng)的耐酶解特性。

圖1 綠豆淀粉（A）和綠豆抗性糊精（B）的掃描電子顯微鏡圖Fig.1 SEM of mung bean starch（A） and resistant dextrin（B）

2.1.2 X-ray 衍射分析 通過X-衍射表征可以直觀判斷顆粒結(jié)晶區(qū)和無定形區(qū)的變化，觀察衍射峰角度和特征峰的強(qiáng)弱，可以確定晶體結(jié)構(gòu)類型。由圖2所示：A 為綠豆淀粉衍射曲線，其衍射峰對應(yīng)的衍射角度在15.07°、17.25°、和23.10°處附近出現(xiàn)，經(jīng)擬合分析相對結(jié)晶度為34.37%，為典型的C 型半結(jié)晶的高聚物[21]；與綠豆淀粉相比，B 綠豆抗性糊精的衍射結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，有序的結(jié)晶結(jié)構(gòu)被破壞導(dǎo)致結(jié)晶峰完全消失，僅在2θ=20°附近出現(xiàn)峰型較寬、彌散的非晶型衍射峰，表明抗性糊精的結(jié)構(gòu)是以葡萄糖為主體的葡聚糖[22]。由于高溫酸熱轉(zhuǎn)化過程中，H+加速了淀粉晶體結(jié)構(gòu)的破壞，淀粉分子由有序晶體向無序晶體轉(zhuǎn)化，促進(jìn)了小分子的重新聚合和分子間的糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，該峰的形成主要?dú)w因于小分子物質(zhì)發(fā)生聚合反應(yīng)的重結(jié)晶，形成的非淀粉的糖苷鍵且具有高度分支結(jié)構(gòu)，形成的空間位阻不能被消化酶破壞，具有抗酶解特性[23]，從而使綠豆抗性糊精具有耐酶解的抗消化特性。

圖2 綠豆淀粉（A）和綠豆抗性糊精（B）的X-衍射圖譜Fig.2 X-ray spectra of mung bean starch（A） and resistant dextrin（B）

2.1.3 偏光十字分析 淀粉顆粒偏光十字的變化可反映其結(jié)晶結(jié)構(gòu)與分子鏈的排列變化，淀粉顆粒存在結(jié)晶區(qū)和非結(jié)晶區(qū)，由于分子的排列有序程度和折射率不同，產(chǎn)生各向異性，使淀粉顆粒呈現(xiàn)偏光十字現(xiàn)象[24]。由圖3 可知，綠豆淀粉具有雙折射特性，產(chǎn)生偏振光，呈現(xiàn)明顯的偏光十字現(xiàn)象，而本實(shí)驗(yàn)所制備綠豆抗性糊精雙折射特性和偏光十字完全消失。由于淀粉在制備抗性糊精過程中受酸熱高溫條件的影響，超過玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，淀粉顆粒外殼中的無定形區(qū)域變得柔韌，淀粉通過空隙間產(chǎn)生壓力膨脹發(fā)生裂解，從而導(dǎo)致顆粒內(nèi)部分子鏈徑向有序排列的結(jié)晶結(jié)構(gòu)受到破壞，但由于聚合反應(yīng)發(fā)生，顆粒內(nèi)部的分子鏈依舊存在一定有序排列的結(jié)構(gòu)，促進(jìn)了抗性糊精的形成[25?26]，此研究結(jié)果與上述X-衍射探究結(jié)果相符合。

圖3 綠豆淀粉（A）與抗性糊精（B）的偏光十字圖譜Fig.3 Polarized cross spectrum of mung bean starch（A） and resistant dextrin（B）

2.1.4 紅外光譜分析 通過FT-IR 探究抗性糊精分子結(jié)構(gòu)中的相關(guān)化學(xué)鍵和官能團(tuán)變化。如圖4 所示，在3405 cm?1處有較寬的-OH 伸縮振動峰，表明抗性糊精具有較強(qiáng)的親水性基團(tuán)，在2924 cm?1處是由C-H 伸縮振動形成的吸收峰，1151 和1024 cm?1處分別為C-O-C 的非伸縮振動峰和C-O 的對稱振動吸收峰，858 和922 cm?1處的特征吸收帶與α和β-糖苷鍵特殊吸收峰相關(guān)，發(fā)生一定強(qiáng)度伸縮振動[27]。由于發(fā)生糊精化反應(yīng)導(dǎo)致連接淀粉分子主要的α-1,4 糖苷鍵顯著遭到破壞，在降解的淀粉分子發(fā)生誘導(dǎo)解聚，攻擊周圍分子的羥基和短鏈交聯(lián)聚合，誘導(dǎo)分子內(nèi)新的耐消化糖苷鍵的形成[28]。綠豆抗性糊精形成過程未產(chǎn)生新官能團(tuán)，與綠豆淀粉結(jié)構(gòu)相似，但發(fā)生一定條件的糖苷鍵斷裂和聚合反應(yīng)。由于在高溫酸熱條件下，發(fā)生糊精化反應(yīng)，其轉(zhuǎn)化過程中發(fā)生轉(zhuǎn)葡萄糖苷化和再聚合反應(yīng)[29]，導(dǎo)致新的耐消化糖苷鍵生成使抗性糊精具有極強(qiáng)抗消化特性。

圖4 綠豆淀粉（A）與抗性糊精（B）的傅里葉紅外光譜圖Fig.4 FT-IR spectra of mung bean starch(A) and resistant dextrin(B)

2.1.5 分子量測定結(jié)果 根據(jù)GPC 色譜分析可得到樣品的重均分子質(zhì)量MW、數(shù)均分子質(zhì)量Mn、分散度PDI 情況。如表1 所示，綠豆抗性糊精的分子量Mn 為2.24×103g/mol，MW為5.24×103g/mol，且PDI為2.33；綠豆淀粉的分子量Mn 為7.49×104g/mol，MW為3.12×105g/mol，且PDI 為4.17，分散度PDI均小于10，樣品純度均較高，由此表明綠豆抗性糊精的分子量遠(yuǎn)小于綠豆淀粉的分子量，將其歸類為低分子量的聚合物。由于前期較強(qiáng)酸熱水解作用，淀粉顆粒的無定形區(qū)和結(jié)晶區(qū)都遭到破壞，分子鏈被切斷造成嚴(yán)重的主鏈結(jié)構(gòu)解聚，導(dǎo)致分子發(fā)生降解，但糊精化過程中具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)重排，結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，鏈狀結(jié)構(gòu)被破環(huán)，產(chǎn)生分子量較小的高度支化短鏈聚合物，這些重排的分子發(fā)生聚合反應(yīng)，導(dǎo)致抗消化糊精部分含量增加，從而導(dǎo)致在體內(nèi)的消化率降低[30]，此結(jié)果與徐佩琳[31]制備山藥抗性糊精研究結(jié)果相符。

表1 綠豆淀粉與綠豆抗性糊精的分子量測定結(jié)果Table 1 Molecular weight determination results of mung bean starch and mung bean resistant dextrin

2.1.6 核磁共振氫譜 由于大部分葡萄糖單元上的質(zhì)子（如甲基和亞甲基質(zhì)子）在3.0~4.0 ppm 高場光譜區(qū)上發(fā)生化學(xué)位移，存共振擁擠區(qū)，但糖環(huán)上異頭氫質(zhì)子在4.5~5.5 ppm 的低場光譜區(qū)發(fā)生化學(xué)位移，不在共振擁擠區(qū)，從而被分離和分辨，因此利用1HNMR 分析抗性糊精的分子結(jié)構(gòu)及糖苷鍵變化[32]。本研究采用1H-NMR 結(jié)合1H1HOCSY 分析，其結(jié)果如圖5 所示：在1H-NMR 譜δ4.0~5.5×10?6區(qū)域內(nèi)有5.27、4.84、4.74、4.53~4.52、4.39、4.06 ppm 處出現(xiàn)異頭氫信號，其中4.74 ppm 為D2O 質(zhì)子峰，α-型吡喃糖H-1 質(zhì)子的化學(xué)位移大于4.95 ppm，β型吡喃糖H-1 質(zhì)子的化學(xué)位移小于4.95 ppm[33]，由此表明抗性糊精同時含有α和β兩種端基差向異構(gòu)構(gòu)型，存在吡喃環(huán)非對稱伸縮振動峰和呋喃環(huán)CH 變角振動峰，進(jìn)一步證實(shí)了綠豆抗性糊精在傅里葉中發(fā)生糖苷鍵斷裂和轉(zhuǎn)苷反應(yīng)導(dǎo)致糖環(huán)發(fā)生振動?？剐院?H-NMR 中5.27、4.53、4.52 ppm 處的共振結(jié)合1H1HOCSY 光譜中二倍體圖可知，發(fā)生質(zhì)子化學(xué)位移，糖殘基連接方式復(fù)雜，隨著氧碳離子或自由基的形成而攻擊了相鄰的羥基，與相鄰糖環(huán)的羥基發(fā)生轉(zhuǎn)苷反應(yīng)生成α（β）-1,2 糖苷鍵和α（β）-1,6 糖苷鍵[34]，Weil 等[35]研究結(jié)果顯示，在高溫糊精化下，更容易使α-1,4 糖苷鍵斷裂，且抗性糊精的抗性含量與含有的α-1,4-糖苷鍵的量成反比。因此，通過核磁共振光譜進(jìn)一步表明，大量易消化α-1,4 糖苷鍵的斷裂以及新的難消化糖苷鍵的生成，導(dǎo)致抗性糊精具有抗酶解消化特性。

圖5 核磁共振氫譜（A）及二維氫譜圖（B）Fig.5 1H NMR（A） and1H1H COSY（B）

2.2 模擬體外消化特性

為更好闡明抗性糊精的抗消化機(jī)理，通過模擬體外消化探究其消化特性，如圖6 所示，在模擬消化20~180 min 中，隨著時間延長綠豆淀粉的水解率明顯增加，而綠豆抗性糊精的水解率呈平緩增加，表明抗性糊精比淀粉具有明顯的抗酶解消化能力。通過模擬體外消化進(jìn)一步得出綠豆淀粉的RDS 為44.98%、SDS 為32.32%、RS 為22.7%，相比綠豆抗性糊精RDS 為4.61%，SDS 為3.11%，RS 為92.28%，此結(jié)果與郭峰等[36]研究抗性糊精的RS 含量為90.81%相似。進(jìn)一步表明綠豆抗性糊精具有極低的體外消化率和抗消化特性，有利于降低餐后血糖和維持胰島素水平，符合膳食纖維的功能特性[37]。根據(jù)上述對抗性糊精結(jié)構(gòu)表征的變化可進(jìn)一步解釋抗性糊精抗消化特性機(jī)理，由于在抗性糊精制備過程，淀粉顆粒結(jié)構(gòu)在酸熱處理過程中消失，裂解后的小分子糊精聚合后形成較為致密的顆粒且高度分支結(jié)構(gòu)，因而降低了消化酶對淀粉的敏感。此外，抗性糊精的抗消化能力很大程度上歸因于在糊精化過程中，α-1,4 和α-1,6糖苷鍵斷裂，重新聚合生成耐消化糖苷鍵，抵抗消化酶的作用，從而減少單位時間對葡萄糖的吸收[4]。

圖6 綠豆淀粉和抗性糊精的水解率和體外模擬消化特性Fig.6 Hydrolysis rate andin vitrosimulated digestion characteristics of mung bean starch and RD注：**代表P＜0.01 差異顯著。

3 結(jié)論

本研究對綠豆抗性糊精的顆粒形態(tài)、晶形結(jié)構(gòu)、偏光十字、官能團(tuán)、分子量、糖苷鍵的變化規(guī)律進(jìn)行表征，探究綠豆抗性糊精的抗消化機(jī)理。結(jié)果表明，在高溫酸熱條件下，發(fā)生復(fù)雜的糊精化反應(yīng)，導(dǎo)致抗性糊精呈現(xiàn)形狀不規(guī)則、大小不一的碎片結(jié)構(gòu)，偏光十字消失，結(jié)晶結(jié)構(gòu)顯著被破壞，分子發(fā)生降解和糖苷鍵發(fā)生斷裂，降解小分子物質(zhì)重新聚合，形成高度支化以葡萄糖為主體的葡聚糖，此外，通過轉(zhuǎn)苷作用形成α（β）-1,2 和α（β）-1,6 的耐消化糖苷鍵，導(dǎo)致空間位阻不能被消化酶酶解破壞，通過模擬體外消化進(jìn)一步驗(yàn)證抗性糊精具有極強(qiáng)抗消化特性。因此，通過對綠豆抗性糊精結(jié)構(gòu)和抗消化性的研究，為功能性膳食纖維的開發(fā)提供理論與數(shù)據(jù)支持。