譚偉芬 付少萍

摘要：結(jié)核分枝桿菌感染內(nèi)科最常見的感染性疾病，該感染會侵犯全身各器官，其中以肺結(jié)核最為常見，隨著近年來醫(yī)療檢驗技術(shù)的進步，結(jié)核分枝桿菌感染的實驗室診斷及檢測技術(shù)不斷優(yōu)化，為疾病早期大規(guī)?？焖贆z測帶來極大便利。鑒于此，文章就近兩年所發(fā)表的結(jié)核分枝桿菌感染的實驗室診斷方法及檢測技術(shù)文獻結(jié)合我院實際治療開展情況做如下總結(jié)。

關(guān)鍵詞：結(jié)核分枝桿菌感染;實驗室診斷;檢測技術(shù);研究進展

【中圖分類號】 R730.43 【文獻標(biāo)識碼】 A? ? ? 【文章編號】2107-2306（2022）10--01

結(jié)核分枝桿菌感染引起的結(jié)核病是全球范圍流行的疾病，臨床數(shù)據(jù)顯示結(jié)核病是世界十大死亡原因之一，WHO數(shù)據(jù)顯示目前全球范圍內(nèi)結(jié)核病患者數(shù)量約為2000萬人，因此結(jié)核分枝桿菌感染的診療一直是臨床研究的重要方向[1]。隨著近年來醫(yī)療檢驗技術(shù)的進步及對疾病研究的深入，結(jié)核分枝桿菌感染的實驗室診斷方法及檢測技術(shù)已逐漸成熟，涂片鏡檢、免疫血清學(xué)檢查、培養(yǎng)法、分子生物學(xué)檢測等檢查技術(shù)開始廣泛應(yīng)用并在實際應(yīng)用中發(fā)揮著較為理想的診斷效果。本文就目前我國臨床對于結(jié)核分枝桿菌感染實施的實驗室診斷方法及檢測技術(shù)開展情況做以下綜述，現(xiàn)報道如下：

1.涂片鏡檢技術(shù)

涂片鏡檢技術(shù)在生物學(xué)及免疫學(xué)基礎(chǔ)上建立的檢測技術(shù)，包括萋-尼氏抗酸染色和熒光染色鏡檢，后者的敏感度優(yōu)于前者。但該技術(shù)在實際應(yīng)用中尚存在一定缺陷，原因在于肺結(jié)核患者中約40%-60%為菌陰肺結(jié)核，應(yīng)用涂片鏡檢技術(shù)抗酸染色的陽性率相對較低，因此該技術(shù)往往無法有效探查菌落;另外該技術(shù)檢查結(jié)核分枝桿菌感染敏感度相對較低，通常需要平均每毫升5000-10000條抗酸菌才可得出陽性結(jié)果[2]。

2.細(xì)菌培養(yǎng)法

分枝桿菌培養(yǎng)和菌種鑒定是目前臨床針對結(jié)核分枝桿菌感染最精確可靠的檢查，已成為該細(xì)菌感染疾病診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，其中固定培養(yǎng)法是指以雞蛋為基礎(chǔ)，在高溫凝固形成的兩個培養(yǎng)基中實施分枝桿菌培養(yǎng)，一般可在2-3周內(nèi)出現(xiàn)細(xì)菌生長;液體培養(yǎng)法的優(yōu)勢在于液體培養(yǎng)基內(nèi)營養(yǎng)豐富，細(xì)菌可在液體中于營養(yǎng)物質(zhì)充分接觸，因此該技術(shù)能有效縮短培養(yǎng)時間，正常情況下可在1-2周內(nèi)出現(xiàn)細(xì)菌生長。

3.血清學(xué)檢查

血清學(xué)檢查是結(jié)核分枝桿菌感染重要的輔助檢查方法，該檢查具有推廣難度小、操作簡便、無需精密儀器等優(yōu)點。隨著近年來檢測技術(shù)的進步，血清學(xué)檢查結(jié)核分枝桿菌感染受到廣泛重視、聯(lián)合應(yīng)用結(jié)核抗原、酶聯(lián)免疫斑點技術(shù)、蛋白芯片技術(shù)開始逐漸推廣應(yīng)用。其中酶聯(lián)免疫斑點技術(shù)是上述疾病實驗室診斷及檢測技術(shù)發(fā)展最為迅速的部分，該技術(shù)的原理是抗體捕獲培養(yǎng)中的細(xì)胞分泌的細(xì)胞予以酶聯(lián)斑點顯色方式表達。

目前臨床上最常用的方法為IGRAs，基本原理是MTB感染者體內(nèi)致敏的T淋巴細(xì)胞，在體外再次接受MTB特異性抗原刺激后，激活的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞能夠產(chǎn)生特異性IFN-γ，通過對IFN-γ的檢測判斷是否存在MTB感染。根據(jù)檢測技術(shù)和操作程序的不同，IGRAs方法有2類：（1）以基于酶聯(lián)免疫吸附試驗法（ELISA）檢測全血中MTB特異性抗原刺激后釋放的IFN-γ水平;（2）采用酶聯(lián)免疫斑點法（ELISPOT）檢測在MTB特異性抗原刺激下，外周血單個核細(xì)胞中釋放IFN-γ的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞數(shù)目。

4.結(jié)核菌素皮膚試驗

結(jié)核菌素皮膚試驗又被稱為PDD皮膚實驗，該技術(shù)主要采用結(jié)核分枝桿菌的純蛋白衍生物實施前臂內(nèi)側(cè)皮膚注射，再通過觀察受檢者局部皮膚是否出現(xiàn)紅腫硬結(jié)，但由于我國國民大多接種了卡介苗，故單純依靠結(jié)核菌素皮膚試驗或難以判斷是自然感染或卡介苗的免疫應(yīng)答反應(yīng)，并受患者免疫狀態(tài)及部分非結(jié)核分枝桿菌感染的影響可能出現(xiàn)假陰性或假陽性，在實際應(yīng)用中需綜合使用其他檢查，以此提升診斷效力。

5.分子生物學(xué)檢測

PCR檢查主要利用體外擴增技術(shù)檢查結(jié)核分枝桿菌，是目前臨床針對結(jié)核分枝桿菌感染應(yīng)用率最高的基因檢查技術(shù)。（1）GeneXpert結(jié)核分枝桿菌（MTB）技術(shù)是由美國Cepheid公司研發(fā)的一套半巢式實時熒光定量PCR體外診斷技術(shù)。以利福平耐藥基因rpoB基因為靶向基因，可在2h內(nèi)同時檢測MTB和對利福平是否耐藥。該方法于2010年由WHO推薦用于肺結(jié)核的診斷，2013年WHO又推薦其用于肺外結(jié)核的診斷。目前GeneXpert結(jié)核分枝桿菌（MTB）技術(shù)廣泛應(yīng)用于臨床，成為診斷結(jié)核病重要的檢測手段，大大地提高了病原學(xué)陽性率，初步判斷患者耐藥情況，指導(dǎo)臨床抗結(jié)核治療方案。該檢查具有更高的簡便性及特異性，能最大限度避免交叉感染，進而提升診斷的精準(zhǔn)度。而Xpert MTB/RIF Ultra是新一代檢測技術(shù)，靶基因增加了IS6110和IS1081，其敏感度優(yōu)于Xpert MTB/RIF。（2）交叉引物擴增技術(shù)（cross-priming amplification，CPA）：采用IS6110基因為靶基因。在成人結(jié)核病檢測的敏感度為72%。WHO于2018年在全球結(jié)核病報告中介紹了該方法，認(rèn)為其可作為Xpert MTB/RIF的替代方法，在結(jié)核病的診斷中具有潛在價值。（3）分子線性探針測定法：該技術(shù)主要利用核酸擴增和反向雜交技術(shù)，將不同靶基因的特異性探針置于紙條上，進行一系列的反應(yīng)。該方法可以鑒別MTBC和NTM，并進行耐藥相關(guān)基因檢測，敏感度（92.9%）和特異度（99.3%）高;WHO推薦GenoTypeMTBDR為MDR-TB的快速診斷方法[4]。

高通量測序技術(shù)：采用高通量測序平臺對臨床標(biāo)本或陽性培養(yǎng)物中的核酸進行靶向測序或全基因組測序，通過將測序數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫序列比對明確是否存在MTB特異性序列，獲得MTB的耐藥基因突變情況，從而進行診斷和/或耐藥性預(yù)測。WHO在2018年的技術(shù)指南中指出，高通量測序技術(shù)可以作為檢測耐藥結(jié)核病的病原學(xué)新方法，并建議在有條件的地區(qū)予以推廣。其局限性為檢測步驟復(fù)雜，周期較長，費用高;檢測結(jié)果易受人源宿主及環(huán)境物種遺傳物質(zhì)的干擾。近年來快速發(fā)展的宏基因檢測技術(shù)因其不依賴于已知核酸序列，無需特殊探針設(shè)計，可直接對未知病原微生物進行檢測，打破了傳統(tǒng)微生物檢驗的局限性，一代宏基因檢測只能測量單一的序列，最長可測得1000-1500bp;二代宏基因檢測能測得大量序列，但片段被限制在250-300bp;三代宏基因檢測能測最長可測得10kb[5]。

6.病理學(xué)檢查

典型的病變由融合的上皮樣細(xì)胞結(jié)節(jié)組成，中心為干酪樣壞死，周邊可見朗格漢斯巨細(xì)胞，外層為淋巴細(xì)胞浸潤和增生的纖維結(jié)締組織[6]。主要病理變化包括滲出性病變、增生性病變和壞死性病變，這3種病理變化?；祀s存在，并相互轉(zhuǎn)化。組織病理學(xué)檢查對于結(jié)核病有確診價值，但若病理改變中未找到MTB，需要結(jié)合臨床和影像學(xué)特點以除外真菌感染等疾病引起的肉芽腫改變。病理組織的獲取方法：肺組織、胸內(nèi)淋巴結(jié)可通過內(nèi)鏡檢查、外科手術(shù)、尸檢時獲得。病理結(jié)果陽性判定：（1）組織形態(tài)學(xué)符合結(jié)核病病理基本變化;（2）病理分子生物學(xué)鑒定為MTB[7]。

7.小結(jié)

隨著現(xiàn)代醫(yī)療檢驗技術(shù)的進步，結(jié)核分枝桿菌感染的實驗室診斷方法及檢測技術(shù)越發(fā)成熟，涂片鏡檢技術(shù)、分子生物學(xué)檢測、細(xì)菌培養(yǎng)法、血清學(xué)檢查、結(jié)核菌素皮膚試驗在其中發(fā)揮著重要作用，但各項檢測手段實施需根據(jù)臨床實際情況進行選用，后續(xù)研究需在聯(lián)合運用各項檢測手段的前提下為患者提供最具效力的病理診斷，最大限度提升結(jié)核分枝桿菌感染的診斷精確率及診斷效率。

參考文獻：

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