于釗江，趙春雪

（安陽師范學(xué)院1.化學(xué)化工學(xué)院；2.數(shù)學(xué)與統(tǒng)計學(xué)院，河南 安陽 455000）

干細(xì)胞因具有高度的自我復(fù)制、增值和多向分化的潛能而備受關(guān)注［1］。大量的體外實驗結(jié)果表明，在生長因子、趨化因子等生物大分子或力學(xué)因素作用下，體外培養(yǎng)的干細(xì)胞具有向某個方向特定分化的潛能。近年來，力學(xué)微環(huán)境被認(rèn)為是一種強(qiáng)有力的影響干細(xì)胞分化的物理因素，引起越來越多的關(guān)注。

基于力學(xué)微環(huán)境對干細(xì)胞分化的影響，大量體外調(diào)控干細(xì)胞分化的生物材料被成功制備。如SAHA 等［2］制備了一種含有不同硬度表面精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸多肽（RGD）序列的互穿聚合物網(wǎng)絡(luò)，不同的基底硬度影響?zhàn)ぶ叩纳L和延伸，從而調(diào)控干細(xì)胞的分化；文獻(xiàn)報道，KILIAN等［3］、MCBEATH 等［4］、KURPINSKI 等［5］設(shè)計了圓形、方形、星形、條紋、網(wǎng)格、微槽、微樁等多種微圖案表面，利用微圖案表面調(diào)控干細(xì)胞的分化；另外，研究者選擇利用外部設(shè)備通過一定的應(yīng)力類型和加載方式對不同基底材料進(jìn)行機(jī)械循環(huán)拉伸，進(jìn)而調(diào)控干細(xì)胞的分化，如雙軸拉伸［6］、單軸拉伸［7］、單軸壓縮［8］等。但是，機(jī)械拉伸模式存在價格昂貴、操作繁瑣、可重復(fù)性差等問題，越來越多的研究者將目光轉(zhuǎn)向刺激響應(yīng)性智能材料的設(shè)計，如KIZILKAN 等［9］利用偶氮苯類液晶彈性體的光敏特性，成功制備了一種光刺激響應(yīng)的復(fù)合材料；DEFOREST 等［10］利用兩個離子正交光化學(xué)實現(xiàn)了生物活性全長蛋白的可逆固定化，實現(xiàn)了人間充質(zhì)干細(xì)胞的可逆分化調(diào)控；FUHRER 等［11］合成了一種軟性磁性水凝膠，通過磁場控制水凝膠的循環(huán)變形，誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化；LIM 等［12］制備了一種電響應(yīng)水凝膠多功能基質(zhì)，可以通過水凝膠交聯(lián)密度和電勢梯度調(diào)節(jié)可逆調(diào)節(jié)水凝膠的各向異性彎曲?；诖?，本文將單壁碳納米管（SWNTs）、聚（N-異丙基丙烯酰胺）（PNIPAM）通過光交聯(lián)的方式制備雙層水凝膠，基于光熱能量轉(zhuǎn)換機(jī)理，對雙層水凝膠進(jìn)行可逆形變調(diào)控，從而制備一中新型可用于智能調(diào)控干細(xì)胞分化的生物材料。

1 材料和儀器

主要材料和儀器：SWNTs，高純，上海巷田納米材料有限公司；N-異丙基丙烯酰胺（NIPAM）、N，N-亞甲基雙丙烯酰胺（BisAA）、過二硫酸銨（APS）、N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED）、二苯甲酮功能化KGYSGRGDSPAS（BP-RGD），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；近紅外激光光源，功率最大5 W，中川光電。

2 實驗方法

2.1 SWNTs-PNIPAM 水凝膠制備

①羧基化SWNTs 處理。未修飾的SWNTs 在2.6 mol/L 的硝酸中回流45 h，然后酸純化的SWNTs在35～40°C 的硫酸和硝酸混合液（H2SO4/HNO3，3∶1，98%和70%）中處理24 h，引入羧基。②重結(jié)晶NIPAM。取5 g NIPAM 溶解于60℃的8 mL 甲苯中，再加入20 mL 正己烷重結(jié)晶。重復(fù)上面步驟兩次，放入真空干燥箱中干燥，然后密封放4℃的冰箱內(nèi)保存。③NIPAM（791 mg,7 mmol），BisAA（5.47 mg,0.035 mmol），TEMED（7.7 mg,10 μL），羧基化SWNTs（4.3 mg）溶于10 mL 水中。④液面下通氮氣并攪拌60 min 除去水中殘余氧氣。然后將4.0 mg APS，即重量百分比20%（20 wt%）水溶液20 μL 加入到溶液中。⑤迅速倒入自制的模具中（體積為2 cm×1 cm×0.2 cm），室溫下，紫外照射24 h，使完全聚合。模具由2 個載玻片和橡膠墊圈制作。⑥制備好的水凝膠浸泡在透析袋（3 500 mm）中，在去離子水中浸泡并攪拌5 h，除去未反應(yīng)完的單體和其他雜質(zhì)。

2.2 SWNTs-PNIPAM 雙層水凝膠制備

①將NIPAM 單體、引發(fā)劑和交聯(lián)劑混合液，迅速倒入模具中SWNTs-PNIPAM 水凝膠層上表面，用蓋玻片使厚度達(dá)到2 mm；然后，室溫下紫外照射24 h，使完全聚合。②將制備好的雙層水凝膠浸泡在去離子水中，除去殘余物質(zhì)。

2.3 RGD 化水凝膠

①一定濃度（1 mg/mL）的BP-RGD 均勻滴在載玻片上，無SWNTs 層水凝膠向下，輕放到載玻片上。②從載玻片底面紫外（365 nm）照射30 min，使其充分聚合。③制備完成的SWNTs/PNIPAM-PNIPAM/RGD 雙層水凝膠在PBS 中清洗2 h，除去未反應(yīng)的BP-RGD。

2.4 光照實驗

2.4.1 SWNTs 吸光性實驗 室溫下，將1.5 mg/mL SWNTs 放置在試管中，用波長為808 nm 的近紅外激光均勻照射SWNTs 水溶液，水凝膠與光源距離為30 cm，光源功率為1 W，間隔3 min 測量樣品溫度。對照組為水溶液。

2.4.2 SWNTs/PNIPAM-PNIPAM/RGD 水凝膠光敏實驗 室溫下，將SWNTs/PNIPAM-PNIPAM/RGD 水凝膠放置在載玻片上，用近紅外激光照射水凝膠，測量在照射0、15、30 min 時水凝膠體積，然后將水凝膠放置在冷水中15 min 并測量體積。對照組為無近紅外激光照射的SWNTs/PNIPAM-PNIPAM/RGD 水凝膠。

2.4.3 SWNTs/PNIPAM-PNIPAM/RGD 水凝膠光刺激可逆形變實驗 室溫下，將SWNTs/PNIPAMPNIPAM/RGD 水凝膠放置在載玻片上，用近紅外激光照射水凝膠，測量在照射30 min 時水凝膠體積，然后將水凝膠放置在冷水中15 min 并測量體積，重復(fù)10 次。對照組為無近紅外激光照射的SWNTs/PNIPAM-PNIPAM/RGD 水凝膠。

3 結(jié)果

3.1 SWNTs 光熱能量轉(zhuǎn)換分析

本文使用的PNIPAM 是一種典型的溫敏性水凝膠，在低溫條件下，PNIPAM 在水中具有較高的溶脹度，體積增大；當(dāng)溫度升高，超過其相轉(zhuǎn)變溫度時，PNIPAM 水凝膠溶脹度降低，體積收縮。從圖1 中可以看到，SWNTs 吸收近紅外光的能量，轉(zhuǎn)換成熱量，使溶液的溫度隨光照射時間的增加而升高，15 min 時達(dá)到39℃，之后變化不明顯。從圖中可以明顯的看到，SWNTs 吸收近紅外光的能量可以達(dá)到水凝膠的相轉(zhuǎn)變溫度，實現(xiàn)水凝膠的形變。

圖1 不同近紅外光照時間下SWNTs 水溶液的溫度曲線

3.2 SWNTs/PNIPAM-PNIPAM/RGD 水凝膠光敏性分析

通過圖2 可以發(fā)現(xiàn)復(fù)合水凝膠在近紅外激光的照射下，隨時間的延長，體積發(fā)生了明顯的變化，在30 min 時水凝膠體積減小近20%；之后將變形水凝膠放入冷水中15 min，水凝膠體積恢復(fù)。這是因為當(dāng)近紅外激光照射水雙層凝膠時，SWNTs 吸收了近紅外光的能量，進(jìn)行光熱轉(zhuǎn)換，使水凝膠溫度超過了其相變溫度，導(dǎo)致含SWNTs層水凝膠發(fā)生相體積的變化，從而使雙層水凝膠發(fā)生體積變化；當(dāng)形變水凝膠放入冷水時，水凝膠溫度低于其相變溫度，變形水凝膠溶脹度增加，恢復(fù)形狀。

圖2 SWNTs/PNIPAM-PNIPAM/RGD 水凝膠光刺激響應(yīng)曲線

3.3 SWNTs/PNIPAM-PNIPAM/RGD 水凝膠光刺激可逆性分析

根據(jù)光熱能量轉(zhuǎn)換和溫敏性水凝膠相體積轉(zhuǎn)變機(jī)理，在近紅外光均勻照射在碳納米管層水凝膠時，溫度升高，使水凝膠超過其相變溫度，使碳納米管層水凝膠產(chǎn)生內(nèi)應(yīng)力，產(chǎn)生形變，隨后僅使用冷水即可恢復(fù)形狀。通過圖3 可知，進(jìn)行10 次循環(huán)后，雙層水凝膠體積的變化和恢復(fù)效果依然良好。

圖3 SWNTs/PNIPAM-PNIPAM/RGD 水凝膠光刺激可逆曲線

4 結(jié)論

利用光熱轉(zhuǎn)換的基本原理，成功制備了一種光刺激響應(yīng)型雙層水凝膠，一層為SWNTs 水凝膠，一層為表面修飾RGD 水凝膠。通過碳納米管層水凝膠對近紅外光的吸收，實現(xiàn)了溫度在雙層水凝膠之間不均勻分布，進(jìn)而誘發(fā)形變。在該試驗中，材料的形變僅通過冷水就可恢復(fù)到原始狀態(tài)。因此，可以通過調(diào)節(jié)SWNTs 的濃度和光強(qiáng)度實現(xiàn)對水凝膠的不同頻率、不同變形程度的調(diào)控，進(jìn)而控制用于培養(yǎng)干細(xì)胞的RGD 水凝膠層，實現(xiàn)對干細(xì)胞分化的體外調(diào)控，最終實現(xiàn)將攜帶已分化的干細(xì)胞水凝膠層用于皮膚、軟骨、肌肉等組織的修復(fù)。