韓 波，徐玲霞，曹小迎，張光琴

（1. 徐州生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 徐州 221006；2. 江蘇師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 徐州 221116）

牡丹（Paeonia suffruticosa）是集觀賞、藥用和油用為一身的重要經(jīng)濟植物[1]。鳳丹白（Paeonia ostticv.‘Phoenix White’）為牡丹野生種楊山牡丹（P.ostii）的栽培品種，是目前油用牡丹最主要的品種[2]，具有結(jié)籽量大、出油率高、生長勢強等特點，并且耐干旱、耐瘠薄、耐高寒，具有很強的適應(yīng)性[3]。鳳丹白籽油中含有豐富的不飽和脂肪酸，如亞麻酸、亞油酸和油酸，具有抗腫瘤、抗炎、改善心血管和調(diào)節(jié)免疫等醫(yī)療保健功能，具有極高的研究價值[4]。鳳丹白根皮有鎮(zhèn)痛、解熱、抗過敏、消炎、免疫等作用，與白芍、菊花、茯苓并稱為安徽四大名藥[5]。鳳丹所含的化學(xué)成分有芍藥苷、丹皮酚、丹皮苷、丹皮多糖、苯甲酸、甾醇、揮發(fā)油等多種物質(zhì)，其中丹皮酚含量是檢驗丹皮品質(zhì)優(yōu)劣的主要指標(biāo)[6]。

目前在所有的植物激素中，乙烯的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是研究較為清楚的通路之一。EIN3/EIL 家族基因是乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中一類重要的核轉(zhuǎn)錄因子，定位于細(xì)胞核內(nèi)，在乙烯信號途徑中與下游基因啟動子結(jié)合啟動基因的表達(dá)[7]。目前已經(jīng)從多種高等植物中分離得到EIN3/EIL 家族基因，包括水稻[8]、擬南芥[9]、棉花[10]和丹參[11]等?；蚬δ苎芯勘砻?，EIN3/EIL 參與乙烯信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)[12-13]，參與花的開放、衰老和凋謝過程[14-15]，參與果實成熟軟化調(diào)控[16-18]，參與抗逆境脅迫調(diào)控[19-21]，與MYC2 交叉互作[22]，同時還轉(zhuǎn)錄激活次生代謝物生物合成途徑中關(guān)鍵酶基因的表達(dá)。如丹參毛狀根中的EIN3 基因的過表達(dá)可促進(jìn)丹參酮和丹酚酸合成途徑中部分關(guān)鍵酶基因的上調(diào)表達(dá)[17]。獼猴桃果實中的EIN3/EIL 轉(zhuǎn)錄因子可以轉(zhuǎn)錄激活萜類合成酶基因AaTPS1的表達(dá)[23]。目前，洛陽紅牡丹（Paeonia suffruticosa）乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因EIN3/EIL 有克隆和表達(dá)分析的報道[24-25]，而鳳丹白作為牡丹中開花較早的一個品種，EIN3/EIL 家族基因序列的相似度及表達(dá)情況還不是很清楚。

鑒于此，從NCBI 數(shù)據(jù)庫中搜索得到洛陽紅的3個EIN3/EIL 基因，通過同源克隆，從鳳丹白中克隆到3 個EIN3/EIL 基因（PoEILs）全長cDNA 序列，并對其進(jìn)行信息學(xué)分析，研究其在不同組織及不同花期的表達(dá)水平和表達(dá)模式，為研究鳳丹白抗逆性、提高丹皮中活性成分及調(diào)控花期提供候選基因。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料是鳳丹白，生長于徐州生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院牡丹種植園。開花期取鳳丹白的根、莖、葉，以及不同開花時期（S1—S5期）的花瓣，包括破綻期（S1）、初開期（S2）、盛開期（S3）、盛開末期（S4）、謝花期（S5），取S3 的花瓣、雄蕊、子房、花柱、花托、萼片。液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱用于提取RNA。

1.2 試驗方法

1.2.1 鳳丹白EIN3/EIL 基因的克隆 采用艾德萊生物公司的EASYspin 通用植物RNA 快速提取試劑盒提取各組織、各花期樣品的總RNA。用諾唯贊生物科技有限公司的HiScript Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）按照最終反轉(zhuǎn)錄量為1μg，對各樣品的RNA 進(jìn)行cDNA 合成，反應(yīng)體系20μL。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物保存于-20 ℃?zhèn)溆?。根?jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中洛陽紅的EIL1—EIL3 序列設(shè)計引物進(jìn)行PCR，擴增鳳丹白莖的EIL1—EIL3 的編碼區(qū)序列（CDS）。3 對 引 物 序 列 見 表1。PCR 反 應(yīng) 體 系（25μL）：10 μmol/L 上、下 游 引 物 各0.5 μL，2×Phanta Max Master Mix（諾唯贊）12.5μL，莖的cDNA 1 μL，其余用ddH2O 補足。PCR 擴增程序：95 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃變性10 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸2 min，30 個循環(huán)；最后再72 ℃延伸5 min。PCR 產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳，利用DNA 凝膠回收試劑盒（諾唯贊）回收目的DNA，并連接至平末端克隆載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌液PCR鑒定后送生工生物工程有限公司測序。

表1 鳳丹白EIL基因克隆及表達(dá)分析所用引物Tab.1 Primers for PoEILs cloning and expression analysis

1.2.2 鳳丹白EIL基因家族的生物信息學(xué)分析 利用NCBI 中的BLAST 進(jìn)行序列相似度分析，ORF 進(jìn)行開放閱讀框預(yù)測；利用在線分析軟件Protparam 進(jìn)行理化性質(zhì)分析；使用MEGA 7 以及Clustal X 軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析；EIN3/EIL 家族蛋白質(zhì)保守基序分布使用在線軟件MEME（https://meme-suite.org/meme/tools/meme）進(jìn)行分析。

1.2.3 鳳丹白EIL 基因定量表達(dá)分析 以Tubulin基因作為標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)參基因。引物信息如表1 所示。采用ChamQ SYBR qPCR Master Mix（諾唯贊）進(jìn)行qPCR，反應(yīng)在StepOnePlus qPCR（ABI，USA）熒光定量PCR儀上進(jìn)行。共進(jìn)行3組生物學(xué)重復(fù)，每組5次技術(shù)重復(fù)。使用2-ΔΔCT方法計算基因表達(dá)水平的相對變化。反應(yīng)體系和反應(yīng)程序參照試劑盒說明書。

2 結(jié)果與分析

2.1 鳳丹白EIL基因克隆

以牡丹拉丁名Paeonia suffruticosa搜索NCBI 上nucleotide 數(shù)據(jù)庫，獲得3 條EIL 基因序列（GenBank登錄號為JQ771469.1、JQ771470.1、JQ771471.1），以擬南芥的EIN3/EIL 家族基因序列在NCBI網(wǎng)站上分別比對牡丹和鳳丹白轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，結(jié)果未搜索到其他的EIN3/EIL 基因片段。推測牡丹中EIN3/EIL基因家族只有這3 個基因。以牡丹的這3 個EIL 基因序列設(shè)計引物擴增鳳丹白EIL 基因的CDS，得到了預(yù)期大小的電泳條帶（圖1）。經(jīng)克隆測序得到3條片段CDS 長度，PoEIL1為1 833 bp，PoEIL2為1 824 bp，PoEIL3為1 959 bp。序列已提交NCBI 數(shù)據(jù)庫，GenBank 登陸號為MZ648327—MZ648329。這3 條CDS 序列與數(shù)據(jù)庫中的牡丹EIL 相似度為99%以上，僅有5～10 個堿基的差異，推斷分別編碼610、607、652個氨基酸。

圖1 鳳丹白3個EIL基因CDS擴增產(chǎn)物Fig.1 CDS amplification products of three PoEILs

2.2 3個基因氨基酸序列的生物信息學(xué)分析

利用在線分析軟件Protparam 對PoEIL1—PoEIL3基因編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，PoEIL1基因編碼蛋白質(zhì)分子式為C2955H4669N847O942S24，原子總數(shù)為9 437 個，分子質(zhì)量67.90 ku，理論等電點為5.57，親水性平均值為-0.722，不穩(wěn)定指數(shù)為54.30，預(yù)測為不穩(wěn)定親水蛋白；PoEIL2基因編碼蛋白分子式為C3003H4650N844O933S39，原子總數(shù)為9 469 個，分子質(zhì)量68.76 ku，理論等電點為5.69，親水性平均值為-0.757，不穩(wěn)定指數(shù)為47.37，預(yù)測為不穩(wěn)定親水蛋白；PoEIL3基因編碼蛋白質(zhì)分子式為C3241H5017N879O1006S34，原子總數(shù)為10 177 個，分子質(zhì)量73.48 ku，理論等電點為5.31，親水性平均值為-0.673，不穩(wěn)定指數(shù)為56.80，預(yù)測為不穩(wěn)定親水蛋白。

用MEGA 7 軟件構(gòu)建3 個鳳丹白EIL 和擬南芥EIL 家族系統(tǒng)發(fā)生樹。用最大似然法（Maximum likelihood）選擇自舉檢驗（Bootstrap test）并設(shè)定重復(fù)次數(shù)為1 000 次，獲得的系統(tǒng)發(fā)生樹（圖2）中各EIN3/EIL 蛋白序列在大多數(shù)節(jié)點的可信度都較高，表明該家族基因在進(jìn)化中高度保守。鳳丹白的PoEIL1與擬南芥的AtEIL3聚為一支，推斷PoEIL1的功能可能與AtEIL3類似。PoEIL2和PoEIL3與擬南芥的AtEIN3和AtEIL1聚在一起，AtEIN3和AtEIL1基因同源性最高，且存在功能冗余，推測PoEIL2和PoEIL3功能類似于擬南芥的AtEIN3和AtEIL1。鳳丹白中沒有基因與AtEIL2、AtEIL4和AtEIL5聚在一起。

圖2 鳳丹白和擬南芥EIN3/EIL基因家族系統(tǒng)發(fā)生及蛋白質(zhì)保守基序分析Fig.2 Phylogeny and conserved motifs analysis of EIN3/EIL family genes in Paeonia ostti cv.‘Phoenix White’and Arabidopsis

利用MEME 在線分析軟件對以上構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的幾個基因保守基序（Motif）進(jìn)行分析，結(jié)果（圖2）顯示，每條序列至少存在5個相同位置的保守基序，并且分布順序完全一致，說明該基因家族具有高度保守的結(jié)構(gòu)域，這與前人研究結(jié)果相符[26]。PoEIL1與AtEIL3基序的數(shù)量和位置一致，預(yù)測PoEIL1的功能可能與AtEIL3類似。

2.3 鳳丹白EIL基因在不同器官及花發(fā)育過程的表達(dá)分析

為了明確鳳丹白各EIL 基因的組織表達(dá)情況，利用qRT-PCR 技術(shù)對EIL 在鳳丹白根、莖、葉、花托、子房、花柱、萼片、花瓣和雄蕊中的表達(dá)進(jìn)行分析（圖3）。結(jié)果表明，PoEIL1在葉中表達(dá)量非常低，幾乎沒有表達(dá)，其他2 個EIL 在各個部位均有表達(dá)。PoEIL1在莖、花柱和子房中的相對表達(dá)量較其他2個EIL 高，PoEIL2在根中的表達(dá)量較其他2 個EIL高，PoEIL3在葉和盛開期萼片、花托、花瓣、雄蕊中的表達(dá)量相對較高。這些結(jié)果表明，PoEIL1可能參與鳳丹白花的器官形態(tài)建成，而PoEIL3可能同時參與花和葉片的器官形態(tài)建成。

圖3 鳳丹白3個EIL基因在不同器官中的表達(dá)情況Fig.3 Relative transcript levels of three PoEILs in different tissues

對鳳丹白不同開花時期EIL基因的相對表達(dá)量進(jìn)行檢測分析，結(jié)果表明，鳳丹白各EIL基因在不同開花時期的表達(dá)豐度差異很大（圖4）。3 個基因都在破綻期（S1）相對表達(dá)量最低。PoEIL1基因在花開放過程中相對表達(dá)量逐漸增高，在盛開末期（S4）相對表達(dá)量達(dá)到最大，隨后相對表達(dá)量又迅速降低。PoEIL2基因在初開期相對表達(dá)量達(dá)到最大，隨后下降，在盛開末期（S4）有點回升，隨后又下降。PoEIL3基因在初開期相對表達(dá)量達(dá)到最大，隨后相對表達(dá)量一直在這個水平波動。

圖4 鳳丹白3個EIL基因在5個開花時期的表達(dá)情況Fig.4 Relative transcript levels of three PoEILs in 5 flower opening stages

3 結(jié)論與討論

EIN3/EIL 家族基因作為乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中比較重要的核轉(zhuǎn)錄因子，越來越受到研究者的重視。本研究以NCBI 數(shù)據(jù)庫中牡丹的3 個EIN3/EIL基因為參照設(shè)計引物，獲得鳳丹白的3 個基因的開放閱讀框序列。這3 個基因序列與牡丹的3 個EIL基因序列分別有5～10個堿基的差異，推測EIN3/EIL基因在牡丹的不同種的變異不大。以擬南芥AtEIN3基因為探針，從NCBI 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫鳳丹白轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)中篩選具有EIN3 結(jié)構(gòu)域的基因序列。結(jié)果表明，除了已經(jīng)擴增的3 個EIL 基因序列，未發(fā)現(xiàn)鳳丹白中有其他的EIN3/EIL基因。

將鳳丹白和擬南芥的EIN3/EIL 家族基因一起構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果顯示，鳳丹白的PoEIL1與擬南芥的AtEIL3聚為一支，PoEIL2和PoEIL3與擬南芥的AtEIN3和AtEIL1聚在一起，但鳳丹白中沒有基因與AtEIL2、AtEIL4和AtEIL5聚在一起。有研究表明，擬南芥中EIN3和EIL1的功能重疊，同時EIN3和EIL1是乙烯信號傳導(dǎo)的主要成員[27]，本研究中PoEIL2和PoEIL3基因與擬南芥的AtEIN3和AtEIL1基因保守基序的數(shù)量和順序基本一致，預(yù)測其功能也類似于擬南芥的AtEIN3和AtEIL1基因。EIL3 是乙烯調(diào)控基因表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，還是參與植物對生物和非生物應(yīng)激反應(yīng)的信號網(wǎng)絡(luò)的一部分[28]。鳳丹白EIL1與AtEIL3基因的保守基序的數(shù)量與順序完全一致，預(yù)測PoEIL1也參與了鳳丹白的應(yīng)激反應(yīng)。

不同器官中各基因的表達(dá)分析結(jié)果顯示，鳳丹白EIL 基因在不同的器官中表達(dá)情況不一致，這與高等植物EIN3/EIL 轉(zhuǎn)錄因子家族成員間顯示不同的表達(dá)特性及調(diào)控模式結(jié)論一致[29]。PoEIL1在葉、花瓣（S3）和雄蕊（S3）中的相對表達(dá)量較低，而在莖、子房（S3）和花柱（S3）中的相對表達(dá)量較高。PoEIL2在根中的相對表達(dá)量最高，而PoEIL3在各組織中的相對表達(dá)量都不低。鳳丹白不同開花時期EIL 基因的相對表達(dá)量分析結(jié)果顯示，PoEIL1隨著花的盛開相對表達(dá)量增加，至盛開末期相對表達(dá)量達(dá)到最大，在謝花期相對表達(dá)量下降，推測PoEIL1與花的發(fā)育有關(guān)，可以通過調(diào)控PoEIL1的表達(dá)來調(diào)控花期。

本研究克隆了鳳丹白中3 個EIN3/EIL 基因，初步明確了3 個基因在各組織及不同花期的表達(dá)模式，為今后進(jìn)一步揭示鳳丹白中這3 個基因各自的功能及分子機制奠定了基礎(chǔ)。