李紹寬，劉 靜，趙 楠，龐民好，唐博文，趙 斌，劉穎超

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，河北 保定 071001）

玉米穗腐病是玉米常見病害，在世界范圍內(nèi)普遍發(fā)生。玉米穗腐病由多種病原菌侵染引起[1]，其中，擬輪枝鐮孢（Fusarium verticillioides）是玉米穗腐病的主要致病菌之一[2]。擬輪枝鐮孢侵染玉米后會(huì)導(dǎo)致玉米品質(zhì)下降、毒素污染等一系列問(wèn)題，嚴(yán)重影響農(nóng)產(chǎn)品安全和人畜健康[3-4]。伏馬毒素是由擬輪枝鐮孢產(chǎn)生的一種重要的有毒次級(jí)代謝物，目前累計(jì)發(fā)現(xiàn)了數(shù)十種伏馬毒素，它們主要分為A、B、C和P 4 個(gè)類別，自然界中普遍存在的伏馬毒素是FB1、FB2和FB，其中FB1占伏馬毒素總含量的70%～80%[8-9]。有研究表明，伏馬毒素破壞鞘脂生物合成，引起人類和動(dòng)物的多種潛在健康問(wèn)題[10-11]。玉米是主要的糧食作物之一，降低伏馬毒素對(duì)于提升玉米品質(zhì)以及保護(hù)食品健康安全具有重要意義。

嘧啶核苷酸是細(xì)胞重要的基礎(chǔ)組成物質(zhì)之一，在生物發(fā)育過(guò)程中起著重要作用。嘧啶合成途徑是一種廣泛存在于生物體的重要代謝途徑，其中二氫乳清酸氧化酶（DHOD）催化嘧啶合成反應(yīng)中的第4 步反應(yīng)，也是該途徑中唯一的氧化反應(yīng)[12-13]，主要負(fù)責(zé)將二氫乳清酸氧化為乳清酸，然后催化脫羧最終生成尿苷酸，它是嘧啶核苷酸的前體物質(zhì)[14]。乳清酸是生物體維持正常生命活動(dòng)的重要物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，乳清酸可以治療黃疸、肝臟一般功能障礙、痛風(fēng)，改進(jìn)腦血管循環(huán)，增加吞噬細(xì)胞活性，提高組織再生能力等。嘧啶合成途徑在生物的各種代謝反應(yīng)，DNA、RNA 以及磷脂生物合成中均具有重要作用，目前已作為多種疾病的治療靶點(diǎn)[15]。含羞草科植物中嘧啶的代謝物5-氨基尿嘧啶可以阻斷有絲分裂的正常進(jìn)行[16]。在醫(yī)藥領(lǐng)域，目前已有報(bào)道將DHOD 作為靶標(biāo)來(lái)開發(fā)其特異性抑制劑，用于治療利什曼原蟲（Leishmania brasiliensis）、肺炎雙球菌（Streptococcus pneumoniae）、克氏錐蟲（Trypanosomacruzi）以及煙曲霉（Aspergillus fumigatus）等病原物侵染引起的疾病[17]。研究表明，在煙曲霉中嘧啶合成被抑制后，其分生孢子喪失萌發(fā)力從而喪失致病性[18]。雖然目前已有許多靶標(biāo)人體致病性真菌DHOD基因的藥物，但是關(guān)于植物致病真菌DHOD基因的研究報(bào)道卻很少，伏馬毒素的合成受到多種因素的調(diào)節(jié)及制約，尤其是基礎(chǔ)代謝途徑對(duì)其可能會(huì)有更加深遠(yuǎn)的影響。嘧啶合成作為基礎(chǔ)代謝途徑對(duì)于生物的各種代謝反應(yīng)均有調(diào)控作用，有報(bào)道稱植物會(huì)由嘧啶衍生出有毒的次級(jí)代謝物質(zhì)來(lái)保護(hù)自身安全，所以嘧啶代謝途徑相關(guān)產(chǎn)物在真菌中可能具有同樣的作用，可能對(duì)擬輪枝鐮孢產(chǎn)生伏馬毒素有一定的影響[19-20]。伏馬毒素作為鐮孢菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物，其合成是否受到DHOD基因的影響尚不清楚。目前，DHOD基因在植物病原真菌方面的研究較少，關(guān)于DHOD基因?qū)φ婢舅睾铣傻挠绊懷芯恳辔匆妶?bào)道。鑒于此，通過(guò)同源重組技術(shù)獲得擬輪枝鐮孢DHOD基因敲除突變體，對(duì)突變體伏馬毒素合成能力進(jìn)行分析，明確DHOD基因在調(diào)控?cái)M輪枝鐮孢產(chǎn)伏馬毒素過(guò)程中的作用，為伏馬毒素污染的控制提供新的潛在靶點(diǎn)，為玉米中伏馬毒素的污染治理提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

擬輪枝鐮孢標(biāo)準(zhǔn)菌株FV7600、含有pUCATPH（攜帶潮霉素抗性基因）載體的大腸桿菌均由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)真菌毒素與植物分子病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存并提供。

1.2 主要儀器和試劑

主要儀器：PCR 擴(kuò)增儀（Applied biosystems）、高效 液 相 色 譜 儀（Agilent 1200）、Real-Time PCR System StepOne Plus（Applied biosystems）。

主要試劑：Fungal RNA Kit（Omega 生物技術(shù)有限 公 司），Hifair?Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（gDNA digester plus，上海翊圣生物科技有限公司），Hieff?qPCR SYBR Green Master Mix（High Rox Plus，上海翊圣生物科技有限公司），F(xiàn)B1、FB2標(biāo)準(zhǔn)品（青島普瑞邦生物工程有限公司），Q5 超保真DNA 聚合酶（New England Biolabs）。試驗(yàn)所用引物（表1）均由金唯智生物科技有限公司合成，F(xiàn)VEG-06288為擬輪枝鐮孢中編碼DHOD 的基因，F(xiàn)VEG-02866是編碼bZIP結(jié)構(gòu)域蛋白的基因，在本研究中被用作內(nèi)參基因。

表1 試驗(yàn)所用引物列表Tab.1 List of primers used in the test

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 DHOD 家族基因系統(tǒng)發(fā)育以及同源性分析

從NCBI 上獲取不同物種的DHOD 氨基酸序列，利用MEGA 7.0 軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹進(jìn)行分析，聚類樹中節(jié)點(diǎn)處的置信度用1 000 次自舉法（Bootstrap）來(lái)完成；使用DNAMAN 對(duì)鐮孢菌分支的DHOD氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)。

1.3.2 擬輪枝鐮孢FV7600基因組DNA 提取 采用CTAB法[21]提取擬輪枝鐮孢基因組DNA。

1.3.3DHOD基因敲除突變體片段構(gòu)建 采用同源重組法構(gòu)建DHOD基因敲除突變體。根據(jù)NCBI 中下載的基因序列設(shè)計(jì)構(gòu)建突變體所需引物（表1，引物 名 稱：FVEG-062881f，F(xiàn)VEG-062881r；FVEG-06288-HPHf，F(xiàn)VEG-06288-HPHr；FVEG-062882f，F(xiàn)VEG-062882r），從擬輪枝鐮孢FV7600 野生型菌株中分別擴(kuò)增得到同源片段，從pUCATPH 載體中擴(kuò)增獲得潮霉素抗性基因（HPH）片段。對(duì)得到的目的片段膠回收，采用融合PCR 方法[22]（所用引物名稱：FVEG-062881f，F(xiàn)VEG-062882r）進(jìn)行連接得到完整片段。

1.3.4 原生質(zhì)體的制備與轉(zhuǎn)化 原生質(zhì)體的制備與轉(zhuǎn)化參考孔祥久[23]的試驗(yàn)方法，得到的轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)5代后通過(guò)PCR以及RT-qPCR進(jìn)行突變體鑒定。

1.3.5 擬輪枝鐮孢DHOD基因敲除突變體伏馬毒素產(chǎn)生量的測(cè)定 取馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 L）上培養(yǎng)5 d 的擬輪枝鐮孢野生型菌株FV7600 與突變體△FvDHOD，分別接種于羧甲基纖維素鈉（CMC）培養(yǎng)基（羧甲基纖維素鈉15 g、磷酸二氫鉀1 g、硫酸銨0.825 g、水1 L、酵母粉1 g、MgSO4·7H2O 0.65 g）中，25 ℃黑暗培養(yǎng)3 d 后，4 000 r/min 離心5 min，棄上清，使用無(wú)菌水清洗得到1×108個(gè)/mL 孢子懸浮液。將孢子懸浮液接種到馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1 L）中，使孢子終濃度為1×106個(gè)/mL，25 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)，9 d 后測(cè)定其伏馬毒素產(chǎn)量。通過(guò)抽濾的方法將菌絲和培養(yǎng)基分離，然后將菌絲用液氮速凍，冷凍干燥后稱取菌絲質(zhì)量；采用高效液相色譜（HPLC）熒光檢測(cè)器（FLD）-柱后衍生法檢測(cè)伏馬毒素的含量[24]，每個(gè)處理設(shè)置5個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

伏馬毒素含量按以下公式計(jì)算：伏馬毒素含量（mg/g）=樣品峰面積×標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度×培養(yǎng)基體積/（標(biāo)準(zhǔn)樣品峰面積×菌絲干質(zhì)量）。

1.3.6 RT-qPCR 檢測(cè)基因表達(dá)量 取1.3.5 中凍干的菌絲提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以FV7600 野生型作為對(duì)照組，通過(guò)RT-qPCR 檢測(cè)突變體中DHOD基因以及伏馬毒素產(chǎn)毒相關(guān)基因（fum1、fum6、fum8、fum13）的相對(duì)表達(dá)量，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，通過(guò)2-△△Ct計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量[25]。

反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：

（1）去 除 基 因 組DNA：5×gDNA digester Mix 3μL；模 板RNA 1 μg；RNase free ddH2O 補(bǔ) 足 至15μL。使用移液器輕輕吹打混勻，42 ℃孵育2 min。

（2）逆轉(zhuǎn)錄：在第一步反應(yīng)管中直接加入5 μL 4×HifairⅢSuperMix plus，用移液器吹打混勻。

溫度程序設(shè)置為：25 ℃5 min；55 ℃15 mim；85 ℃5 min。將反應(yīng)產(chǎn)物放入-20 ℃保存，使用時(shí)對(duì)其進(jìn)行10倍稀釋。

RT-qPCR 反應(yīng)體系（冰上配制）：Hieff?qPCR SYBR Green Master Mix 10 μL、Forward Primer（10μmol/L，引 物 為FVEG-06288qPCRf）0.4 μL、Reverse Primer（10 μmol/L，引 物 為FVEG-06288qPCRr）0.4μL、cDNA模板2μL、ddH2O 7.2μL。

RT-qPCR 反應(yīng)程序：預(yù)變性95 ℃10 min；變性95 ℃15 s，退火/延伸55 ℃1 mim，共40個(gè)循環(huán)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用單因素AOVNA 分析中的Duncan’s法對(duì)基因表達(dá)量以及產(chǎn)毒量進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 DHOD家族基因的系統(tǒng)發(fā)育分析及同源性分析

為了分析擬輪枝鐮孢DHOD 的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，從NCBI上獲取了層出鐮孢（Fusarium proliferatum）、尖 孢 鐮 孢（F.oxysporum）、擬 輪 枝 鐮 孢（F.verticillioides）以及牛肺線蟲（Dictyocaulus viviparus）等DHOD 的氨基酸序列，使用MEGA 7.0 軟件采用鄰接法構(gòu)建DHOD 氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1A），可以看出，擬輪枝鐮孢的DHOD 與鐮孢菌的DHOD聚類到同一分支上。對(duì)鐮孢菌分支上的DHOD 氨基酸序列進(jìn)行同源性對(duì)比分析，結(jié)果（圖1B）表明，擬輪枝鐮孢與Fusarium avenaceum的同源性為86.99%，與Fusarium heterosporum的同源性為88.70%，與Fusarium oxysporum的同源性為97.23%，與Fusarium proliferatum的同源性為97.87%，與Fusarium subglutinans的同源性為97.87%。系統(tǒng)發(fā)育分析及同源性分析結(jié)果表明，DHOD基因在真菌中相對(duì)保守。

圖1 DHOD氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育分析及同源比對(duì)分析Fig.1 Phylogenetic analysis and alignment of amino acid sequences of dihydroorotate oxidase

2.2 同源重組獲得△FvDHOD突變體

利用同源重組的方法獲得了4 株FvDHOD基因敲除突變體的轉(zhuǎn)化子菌株（圖2），將轉(zhuǎn)化子和野生型菌株分別接種到PDA 培養(yǎng)基平板中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化子菌株色素顏色較野生型更深。在加入了潮霉素B 抗性的培養(yǎng)基上，野生型菌株不再生長(zhǎng)而轉(zhuǎn)化子菌株正常生長(zhǎng)。以轉(zhuǎn)化子和野生型菌株的基因組DNA為模板，分別對(duì)其前同源臂+抗性片段（引物為FVEG-062881f+FVEG-06288-HPHr）、后同源臂+抗性片段（引物為FVEG-06288-HPHf+FVEG-062882r）、潮霉素抗性基因片段（引物為FVEG-06288-HPHf+FVEG-06288-HPHr）、DHOD基因片段（引物為FVEG-06288yzF+FVEG-06288yzR）進(jìn)行PCR 檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示。由圖3 可見，前同源臂+抗性片段大小為2 689 bp、后同源臂+抗性片段大小為2 802 bp、抗性片段大小為2 114 bp、DHOD基因片段大小為2 635 bp，根據(jù)電泳結(jié)果分析，得到條帶與預(yù)期片段大小一致。

圖2 擬輪枝鐮孢野生型與轉(zhuǎn)化子在PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Fig.2 Colony morphology of wild type and transformants of F.verticillioides on PDA medium

圖3 擬輪枝鐮孢野生型與DHOD基因敲除突變體不同片段PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.3 Electrophoresis results of PCR products of different fragments from wild type and DHOD gene knockout mutants of F.verticillioides

2.3 △FvDHOD突變體RT-qPCR驗(yàn)證

利用RT-qPCR 技術(shù)對(duì)突變體DHOD基因表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，4 株△FvDHOD突變體的DHOD基因表達(dá)量均顯著低于野生型，說(shuō)明獲得了DHOD基因敲除的突變體菌株（圖4）。

圖4 擬輪枝鐮孢野生型與DHOD基因敲除突變體中DHOD基因相對(duì)表達(dá)量Fig.4 Expression levels of DHOD in wild type and DHOD gene knockout mutants of F.verticillioides

2.4 擬輪枝鐮孢伏馬毒素合成能力

通過(guò)HPLC 檢測(cè)擬輪枝鐮孢野生型與DHOD基因敲除突變體的伏馬毒素生物合成量，結(jié)果（圖5）發(fā)現(xiàn)，野生型擬輪枝鐮孢的伏馬毒素產(chǎn)量為（51.27±6.20）mg/g，4 個(gè)突變體伏馬毒素產(chǎn)量分別為（5.99±0.48）、（5.68±0.88）、（1.37±0.15）、（5.23±0.86）mg/g，較野生型下降88.32%～93.56%?？梢姡珼HOD基因與伏馬毒素的生物合成呈正相關(guān)。

圖5 擬輪枝鐮孢野生型與DHOD基因敲除突變體的伏馬毒素產(chǎn)量Fig.5 Fumonisins production of wild type and DHOD gene knockout mutants of F.verticillioides

2.5 伏馬毒素生物合成基因簇的表達(dá)

試驗(yàn)進(jìn)一步通過(guò)RT-qPCR 檢測(cè)了擬輪枝鐮孢突變體中部分產(chǎn)毒相關(guān)基因（fum1、fum6、fum8和fum13，均正調(diào)控伏馬毒素FBs 的生物合成[20]）表達(dá)。對(duì)野生型以及DHOD基因敲除突變體的fum1、fum6、fum8和fum13基因進(jìn)行表達(dá)量分析，結(jié)果（圖6）表明，DHOD基因敲除突變體中4 個(gè)基因的表達(dá)量均顯著低于野生型，DHOD基因的敲除使伏馬毒素合成相關(guān)基因的表達(dá)受到明顯抑制，說(shuō)明DHOD基因與伏馬毒素合成相關(guān)基因的表達(dá)呈正相關(guān)。

圖6 擬輪枝鐮孢野生型與DHOD基因敲除突變體伏馬毒素合成相關(guān)基因表達(dá)量Fig.6 Expression levels of fumonisins synthesis related genes in wild type and DHOD gene knockout mutants of F.verticillioides

3 結(jié)論與討論

嘧啶合成途徑是所有生物體中極為重要的一個(gè)基礎(chǔ)代謝途徑，嘧啶合成途徑的代謝產(chǎn)物是生命體內(nèi)多種物質(zhì)的前體，嘧啶被分解成簡(jiǎn)單的代謝物，如其中的氮和碳會(huì)被回收到細(xì)胞代謝池中重新利用[26]。嘧啶核苷酸可以衍生為萜類和酚類化合物等多種生物合成的活性中間物，參與細(xì)胞內(nèi)多個(gè)代謝途徑。例如糖原合成過(guò)程中的UDP-葡萄糖，又是轉(zhuǎn)化為UDP-木糖、UDP-半乳糖、UDP-鼠李糖等其他糖類物質(zhì)的底物；以及磷脂合成過(guò)程中的CDP-乙醇胺、CDP-二酯酰甘油等[27]；在馬鈴薯塊莖片培養(yǎng)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，乳清酸和尿嘧啶促進(jìn)了UTP（尿苷三磷酸）、UDP（尿苷二磷酸）和UDP-葡萄糖的含量提高[28]；香豌豆氨酸是由尿嘧啶衍生出來(lái)的一種次生代謝物，用于抵抗微生物侵染[26]。嘧啶類化合物是合成DNA、RNA 和其他代謝物（如磷脂和糖蛋白）的重要前體分子[29]，與機(jī)體內(nèi)大多數(shù)代謝途徑均有聯(lián)系，而DHOD基因所表達(dá)的二氫乳清酸氧化酶對(duì)于該途徑具有十分重要的意義。

伏馬毒素是擬輪枝鐮孢等少數(shù)菌種所特有的次生代謝物質(zhì)，對(duì)于擬輪枝鐮孢是非常重要的。本試驗(yàn)構(gòu)建了DHOD基因敲除突變體，并觀察到突變體伏馬毒素合成能力顯著降低，并且毒素合成相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量也呈顯著下降的現(xiàn)象。伏馬毒素是擬輪枝鐮孢產(chǎn)生的有毒次級(jí)代謝產(chǎn)物，其合成受到伏馬毒素合成相關(guān)家族基因簇（FUM）的調(diào)控[30]。本試驗(yàn)中，所檢測(cè)的FUM 家族基因簇中的4個(gè)基因表達(dá)量在DHOD基因突變體中均受到明顯抑制，且DHOD基因敲除突變體的伏馬毒素合成量也明顯下降，基于目前的試驗(yàn)結(jié)果可以得出，DHOD基因表達(dá)的二氫乳清酸氧化酶作為嘧啶合成的關(guān)鍵酶之一，對(duì)于擬輪枝鐮孢中伏馬毒素的產(chǎn)生具有非常重要的影響。當(dāng)擬輪枝鐮孢中DHOD基因表達(dá)受到抑制時(shí)，伏馬毒素的產(chǎn)生量以及與伏馬毒素合成直接相關(guān)的基因的表達(dá)量均受到明顯的抑制作用，基于此，認(rèn)為DHOD基因通過(guò)正調(diào)控伏馬毒素合成基因簇的表達(dá)來(lái)調(diào)控?cái)M輪枝鐮孢伏馬毒素的產(chǎn)生，但是嘧啶合成途徑是否影響伏馬毒素的合成還需要通過(guò)進(jìn)一步試驗(yàn)進(jìn)行探究。雖然本試驗(yàn)明確了DHOD基因影響擬輪枝鐮孢伏馬毒素的產(chǎn)生，與伏馬毒素的產(chǎn)生具有正相關(guān)關(guān)系，但是具體如何調(diào)控伏馬毒素合成基因簇的表達(dá)來(lái)調(diào)控伏馬毒素產(chǎn)生仍未可知，需要進(jìn)一步試驗(yàn)進(jìn)行探究。

目前，以二氫乳清酸氧化酶作為靶標(biāo)開發(fā)的藥物已經(jīng)出現(xiàn)很多，例如化合物奧落洛芬（Olorofim）已被證明對(duì)各種霉菌和多種真菌具有強(qiáng)大的體外活性，包括曲霉菌、球莖孢子菌、頂孢霉、擬青霉、短柄擬青霉、皮炎芽生菌、莢膜組織胞漿菌和球孢子菌等，尤其是對(duì)煙曲霉具有特異活性，可以使其失去致病力[31-32]?；谖锓N間的DHOD基因編碼的二氫乳清酸氧化酶對(duì)于靶標(biāo)藥物具有不同的敏感性，可以開發(fā)特異性的DHOD抑制劑，例如發(fā)現(xiàn)一種吡唑類化合物對(duì)幽門螺桿菌具有抑制作用，但對(duì)其他革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽(yáng)性菌或人類細(xì)胞的抑制作用較差，通過(guò)結(jié)構(gòu)修飾對(duì)該化合物的側(cè)鏈結(jié)構(gòu)進(jìn)行一些改變，提高了其對(duì)幽門螺桿菌的特異性抑制活性[33]。因此，通過(guò)靶向二氫乳清酸氧化酶來(lái)防治真菌病害及其次生代謝產(chǎn)物污染是可行的。本試驗(yàn)明確了DHOD基因影響擬輪枝鐮孢伏馬毒素的產(chǎn)生，但其具體是通過(guò)何種方式來(lái)正調(diào)控?cái)M輪枝鐮孢產(chǎn)毒還需要進(jìn)一步試驗(yàn)進(jìn)行探究。后期可以通過(guò)對(duì)野生型及突變體進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等，進(jìn)一步明確DHOD基因調(diào)控伏馬毒素產(chǎn)生的機(jī)制，以及對(duì)已報(bào)道的抑制劑進(jìn)行篩選，得到擬輪枝鐮孢的特異性抑制劑。就目前結(jié)果而言，以擬輪枝鐮孢中DHOD基因作為潛在藥物靶標(biāo)控制伏馬毒素產(chǎn)生是具有可行性的。