楊 瀟，王曙光，梁 慎，婁長城，王利民，師 曼，張和臣

（1. 西南林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650224；2. 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 園藝研究所，河南 鄭州 450002）

楸樹（Catalpa bungei）是紫葳科（Bignoniaceae）梓屬（Catalpa）落葉喬木，栽培歷史悠久，分布地區(qū)廣泛，是我國特有的珍貴優(yōu)質(zhì)木材和園林觀賞樹種，具有很高的生態(tài)效益和經(jīng)濟價值[1-3]。由于楸樹大面積苗圃種植結(jié)構(gòu)單一，管理稍有不善，易受到炭疽病、根結(jié)線蟲病[4]等一些病害的影響。近些年，楸樹人工栽培和繁育面積不斷擴大，一些新的病害也隨之產(chǎn)生，如楸樹莖腐病，其對楸樹危害十分嚴(yán)重，癥狀表現(xiàn)為楸樹苗木在移栽后出現(xiàn)長勢衰弱、樹冠萎蔫、莖基部組織褐色病變的現(xiàn)象，嚴(yán)重時導(dǎo)致植株死亡。目前，國內(nèi)尚未見楸樹莖腐病的相關(guān)報道，鑒于此，采用柯赫氏法則對楸樹莖腐病的病原進行分離鑒定，明確其病原菌，并在此基礎(chǔ)上評價3 個楸樹材料對莖腐病的抗性，以期為楸樹莖腐病的防治及抗性品種選育提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

楸樹莖腐病植株于2020年春、秋兩季采集自位于河南省新鄉(xiāng)市平原新區(qū)的河南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究開發(fā)基地楸樹苗圃。抗病性評價試驗中3種供試楸樹材料均來自上述苗圃，均通過組培繁殖獲得，分別為CJS[金絲楸（Catalpa bungivar.Jinsi）]、CL1（洛楸1號）、CZ2[以豫楸2 號為母本、灰楸（Catalpa fargesiiBur.）為父本雜交選育的后代]。

1.2 培養(yǎng)基

PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯浸粉3 g、葡萄糖20 g、瓊脂10 g、1 000 mL水，分裝燒瓶后高壓滅菌備用。

1.3 病原菌的分離和純化

采集楸樹莖腐病植株（17 株）后，清理掉表面的泥土和砂礫，在流動自來水下沖洗20 min。在植株病健交界處切取面積1 cm×1 cm、厚6 mm 樣品。用75%乙醇處理30 s 后無菌水清洗2 次，然后用0.1%HgCl2處理3 min 后無菌水清洗3 次。在無菌紗布上吸干水分后，用無菌刀片去除表皮，切取內(nèi)部面積5 mm×5 mm、厚3 mm 小塊，每株病樣取3～5塊，切成薄片接種在PDA 培養(yǎng)基上，于28 ℃恒溫光照培養(yǎng)箱中12 h 光/12 h 黑暗培養(yǎng)。待形成一定大小的菌落后，挑取邊緣菌絲進行純化。

1.4 病原菌致病性驗證

將純化后的單孢菌株在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)7～10 d，待其長滿培養(yǎng)皿并產(chǎn)生大量孢子后，用無菌水配制成1×108個/mL 的孢子懸浮液。采用浸根法接種病菌，以株高10 cm 左右的CZ2 缽苗為材料，在上述孢子懸浮液中浸染20 min，以清水處理為對照。然后移栽至裝有滅菌土的盆缽中，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱（濕度75%）中，12 h 光/12 h 黑暗培養(yǎng)。2 d 澆1次水。每個菌株接種3 株CZ2 缽苗，對照1 株。觀察發(fā)病情況，初步篩選病原菌。當(dāng)植株出現(xiàn)發(fā)病癥狀后，觀察是否與田間發(fā)病癥狀一致，并切取病健交界處組織，對病原菌進行再分離和培養(yǎng)，驗證是否與接種菌株一致。

1.5 病菌的形態(tài)和分子鑒定

1.5.1 形態(tài)鑒定 將有致病性的菌株分離純化到PDA 培養(yǎng)基上，28 ℃下培養(yǎng)后觀察形態(tài)學(xué)特征。并參照《植物病原真菌學(xué)》[5]，對病原菌進行形態(tài)學(xué)鑒定。

1.5.2 分子鑒定及發(fā)育樹構(gòu)建 采用機械微波破壁法獲取致病菌株的DNA，用于PCR 擴增[6]。取菌絲100 mg 于2 mL 離心管，加300μL 10×TE 溶液，放入一顆鋼珠，置于機械破碎儀（3 000 r/min）中3 min。打開管蓋置于微波爐加熱至微沸，蓋上管蓋趁熱置于離心機中，常溫12 000 r/min離心5 min，取上清液冷凍保存以備PCR 擴增。采用ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′） 和 ITS4 （5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）進 行PCR 擴 增，PCR 反應(yīng)體系為30μL：2×TaqMaster Mix 15μL，引物ITS1 0.5 μL，引物ITS4 0.5 μL，DNA 模板1 μL，ddH2O 13 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1.5 min，共30 個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。取2μL PCR 產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，以250 bp DNA Ladder Marker 為對照。PCR 產(chǎn)物由尚亞生物公司進行測序，將測序結(jié)果上傳至GenBank，與已發(fā)表的基因進行同源性比對，利用MEGA 7.0 軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap為1 000次。

1.6 不同楸樹的抗病性評價

1.6.1 離體葉片穿刺法 在培養(yǎng)皿中放入2層滅菌濾紙，用無菌水浸濕。取成熟度一致、葉面積大小相近的葉片，用75%乙醇消毒后用無菌水清洗，擦干放入培養(yǎng)皿中，用接種針在葉片正面扎取3 個穿刺孔，切取生長10 d 并產(chǎn)生孢子的致病菌菌絲塊（4 mm×4 mm）覆蓋上面，于28 ℃恒溫光照培養(yǎng)箱（12 h 光/12 h 暗）中培養(yǎng)，5 d 后觀察發(fā)病情況。每個楸樹材料10 皿為一個重復(fù)，3 次重復(fù)，每次重復(fù)以相同大小無菌PDA 培養(yǎng)基切塊為對照，設(shè)2 皿。運用Image J 軟件統(tǒng)計病斑面積（Lesion area，LA）。葉片病斑分級依照文獻[7-8]稍加改進，按照LA大小分為5 個病級，0 級：未出現(xiàn)病斑；1 級：0＜LA≤5%；2級：5%＜LA≤10%；3 級：10%＜LA≤20%；4 級：20%＜LA≤30%；5級：LA＞30%。

病葉率=發(fā)病葉數(shù)/總?cè)~數(shù)×100%，

病情指數(shù)=∑（各級病斑葉數(shù)×相應(yīng)級數(shù)值）/（調(diào)查總?cè)~數(shù)×最高級數(shù)）×100。

1.6.2 植株浸根法 采用浸根法分別對3個楸樹材料進行接種處理，選取健康、長勢優(yōu)良、株高為25～35 cm 的楸樹缽苗，將根部沖洗干凈后浸泡在1×108個/mL 的致病菌孢子懸浮液中20 min，每個楸樹材料3次重復(fù)，每次重復(fù)10盆，每次重復(fù)設(shè)清水對照2盆。置于溫室中培養(yǎng)，7 d 后開始觀察，每隔1 d 觀察統(tǒng)計1 次發(fā)病情況，共觀察5 次。依照張亮[9]的方法，稍作改良，統(tǒng)計并計算發(fā)病率和病情指數(shù)。

楸樹病菌侵染發(fā)病的程度分級標(biāo)準(zhǔn)為，0 級：植株健康，無任何癥狀；1 級：輕微感病，有1～3 片葉子出現(xiàn)退綠發(fā)黃，無明顯卷曲癥狀；2級：癥狀較明顯，有1/3 數(shù)量的葉片出現(xiàn)退綠發(fā)黃，伴有萎蔫、卷曲癥狀，葉柄無明顯大幅度下垂；3 級：癥狀較嚴(yán)重，有1/2 數(shù)量的葉片出現(xiàn)枯黃，萎蔫，并且葉柄下垂；4級：超過半數(shù)的葉片都出現(xiàn)不同程度的癥狀，且大量樹葉葉柄下垂，健康葉片所剩無幾；5級：整棵植株無任何綠葉，植株基本死亡。

發(fā)病率=發(fā)病株數(shù)/總株數(shù)×100%，

病情指數(shù)=∑（病情級數(shù)×該級病情株數(shù)）/（病情最高級數(shù)×調(diào)查總株數(shù)）×100。

1.7 感病后楸樹材料葉片酶活性測定

采用浸根法對3個楸樹材料進行病原菌接種處理，每個楸樹材料處理30 株，以無菌水為對照。取樣時間為接種前0 d 和接種后3、6、9、12 d。隨機采取葉位、葉齡、葉面積相近的葉片進行檢測，設(shè)3 次重復(fù)。β-1，3-葡聚糖酶、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）活性分別使用北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)的β-1，3-葡聚糖酶活性檢測試劑盒（微量法）、SOD 活性檢測試劑盒（微量法）、POD 活性檢測試劑盒（微量法）測定。

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2016 軟件對數(shù)據(jù)進行處理，采用SPSS 23.0 軟件進行差異顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 楸樹莖腐病的癥狀

楸樹莖腐病在田間呈點片發(fā)生。感病初期，植株下部葉片失綠卷縮，稍下垂；感病中期，植株葉片大面積萎蔫失綠，葉片相繼下垂，但不脫落；發(fā)病后期，植株頂芽枯死，莖基部外表皮出現(xiàn)深褐色病變，內(nèi)皮組織也出現(xiàn)褐色軟化腐爛（圖1）。地下根部發(fā)褐腐爛，推斷致病菌從楸樹根部和莖基部進行侵染，破壞根部和莖基部的輸導(dǎo)組織，阻斷植株地上地下組織水分和養(yǎng)分的交換，從而導(dǎo)致植株死亡。

圖1 楸樹莖腐病田間發(fā)病癥狀Fig.1 Symptoms of Catalpa bungei stalk rot in field

2.2 病原菌致病性驗證

經(jīng)分離純化，共得到33 株菌株。在室內(nèi)，將分離純化的33 株菌株分別制成孢子懸浮液對楸樹進行浸染，發(fā)現(xiàn)菌株NG0201、NG0212、GO100307侵染后，楸樹植株長勢明顯減弱，葉片均出現(xiàn)萎蔫現(xiàn)象，與清水對照有明顯差異。其中，菌株GO100307 致病速度快，致使植株出現(xiàn)莖腐現(xiàn)象，且導(dǎo)致植株死亡。因此，在后續(xù)試驗中，以GO100307 作為供試菌株。楸樹在接種菌株GO100307第6天時，葉邊緣出現(xiàn)卷曲、萎蔫現(xiàn)象，葉柄微垂；第10 天，植株葉片邊緣枯黃，失去水分，葉柄完全下垂，出現(xiàn)的癥狀與田間一致。將植株從盆中挖出，清洗根部后發(fā)現(xiàn)根部變褐，有明顯的腐爛跡象；莖基部橫切后發(fā)現(xiàn)，輸導(dǎo)組織和薄壁組織明顯發(fā)褐（圖2）。同時，切取發(fā)病植株莖基病健交界處組織進行病原菌分離培養(yǎng)，得到菌株與接種病菌一致。根據(jù)柯赫氏法則，證明GO100307菌株為楸樹莖腐病的主要致病菌。

圖2 病原菌GO100307分離純化后回接發(fā)病癥狀Fig.2 Symptoms after inoculation with the isolated and purified strain GO100307

2.3 病原菌形態(tài)和分子鑒定

2.3.1 病原菌形態(tài)鑒定 由圖3 可見，PDA 培養(yǎng)基上，GO100307 菌株菌絲呈白色絨毛狀，菌絲中間濃密，邊緣稀薄，氣生菌絲不發(fā)達(dá)，背面淡黃色。28 ℃培養(yǎng)6 d 左右能在菌落中間觀察到明顯的孢子堆，孢子堆呈黑色或墨綠色油漆狀。在顯微鏡下觀察，分生孢子梗緊密排列，光滑無色，至少2 次分支，末端分支輪生2～7 個產(chǎn)孢細(xì)胞，產(chǎn)孢細(xì)胞無色，細(xì)長，筒裝或棍棒狀，分生孢子為單孢，無色，形狀為長卵形或橢圓形，兩端鈍圓。依據(jù)形態(tài)學(xué)特征，將該菌株初步鑒定為漆斑菌屬（Myrothecium）。

圖3 病原菌形態(tài)觀察Fig.3 Observation of fungus morphology

2.3.2 分子鑒定 提取GO100307 菌株DNA 后，利用ITS1 和ITS4 引物進行PCR 擴增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測獲得大小約600 bp 的基因片段（圖4a）。將測序結(jié)果在GenBank 上與已發(fā)表的基因進行同源性比對，利用MEGA 7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4b）。圖4b 顯 示，菌 株GO100307 的ITS 序 列 與HQ115647.1Myrothecium roridum和HQ433334.1Myrothecium roridum聚于同一分支。結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定，最終將GO100307 菌株確定為露濕漆斑菌（Myrothecium roridum）。

圖4 PCR產(chǎn)物凝膠成像（a）與GO100307菌株系統(tǒng)發(fā)育樹（b）Fig.4 PCR product gel imaging（a）and GO100307 phylogenetic tree（b）

2.4 3個楸樹材料無性系的抗病性評價

2.4.1 葉片離體穿刺試驗結(jié)果 將露濕漆斑菌菌塊分別接種在CJS、CL1、CZ2 楸樹離體葉片上，接種5 d后，3個楸樹無性系葉片均出現(xiàn)發(fā)病現(xiàn)象（圖5）。從表1 可以看出，病情指數(shù)為39.17～50.50。其中CZ2 病情指數(shù)最高，并與CL1 有顯著差異（P＜0.05），與CJS 差異不顯著（P＞0.05）。3個楸樹材料的發(fā)病率無顯著差異（P＞0.05），但CZ2 發(fā)病率最高（表1）。綜合對比，在離體葉片穿刺試驗中，CL1 抗性最好，CZ2 最差。觀察發(fā)現(xiàn)，CL1 葉片表面革質(zhì)化程度高于其他2 個楸樹材料，這可能是其葉片離體穿刺試驗發(fā)病率低于其他2個楸樹材料的原因之一。

圖5 3個楸樹材料葉片穿刺試驗差異Fig.5 Differences in leaf puncture experiments of three Catalpa species

表1 露濕漆斑菌對不同楸樹葉片離體穿刺情況對比Tab.1 Comparison of in vitro puncture of different Catalpa tree leaves by Myrothecium roridum

2.4.2 楸樹浸根法試驗結(jié)果 通過浸根法對3個楸樹材料進行接種，在第15 天統(tǒng)計最終發(fā)病情況（圖6）。表2 可見，3 個楸樹材料均出現(xiàn)感病現(xiàn)象，病情指數(shù)為26.67～37.33。CJS 病情指數(shù)最低，顯著低于其他2 個楸樹材料（P＜0.05），CZ2 與CL1 病情指數(shù)相差1.33，差異不顯著（P＞0.05）；CJS 發(fā)病率最低，但3 個楸樹材料的發(fā)病率并無顯著差異（P＞0.05）。綜合對比，三者對莖腐病的抗性為CJS＞CL1＞CZ2。

表2 露濕漆斑菌孢子懸浮液對不同楸樹材料的浸染情況對比Tab.2 Comparison of Myrothecium roridum infestation of different Catalpa species

圖6 3個楸樹材料無性系浸根試驗差異Fig.6 Differences in root immersion tests of three Catalpa species

2.5 浸根接種致病菌對3個楸樹材料葉片酶活性的影響

2.5.1 β-1，3-葡聚糖酶活性 從圖7 可以看出，CJS 接種后β-1，3-葡聚糖酶活性在第3 天達(dá)到峰值，之后逐漸下降；CZ2 在接種后β-1，3-葡聚糖酶活性先下降，于第6 天達(dá)到最低值，然后逐漸回升，呈“V”字形；CL1 在接種后第6 天β-1，3-葡聚糖酶活性達(dá)到峰值，然后趨于平穩(wěn)。3 種楸樹酶活性峰值表現(xiàn)為CJS 比CZ2 和CL1 分別高出7.12% 和14.89%，且峰值時間最早。說明抗性較好的楸樹材料在接種病原菌后能較快地產(chǎn)生抗性反應(yīng)，其自身的β-1，3-葡聚糖酶活性會迅速升高，以此來應(yīng)對病原真菌的侵染。

圖7 3個楸樹材料處理后葉片β-1，3-葡聚糖酶活性變化Fig.7 Changes of β-1，3-glucanase activity in treated leaves of three Catalpa species

2.5.2 SOD 活性 從圖8 可以看出，CJS 在接種后SOD 活性先上升再下降，第9 天達(dá)到峰值；CZ2 在接種后SOD 活性先是持續(xù)下降，第6天時達(dá)到最低值，隨后急劇上升然后又稍有下降；CL1 接種后SOD 活性增加迅速并在第6天達(dá)到峰值，隨后逐漸下降。3個楸樹材料中，CL1 SOD 活性峰值最高，比CJS 和CZ2 SOD活性峰值分別高6.67%和35.07%。

圖8 3個楸樹材料處理后葉片SOD活性變化Fig.8 Changes of SOD activity in treated leaves of three Catalpa species

2.5.3 POD 活性 從圖9 可以看出，CJS 在接種后POD 活性迅速上升，在第6 天達(dá)到峰值后下降；CZ2在接種后POD 活性呈“M”形的雙峰現(xiàn)象；CL1 接種后POD 活性在第3 天達(dá)到峰值后呈下降趨勢。3 個楸樹材料在接種后POD 活性普遍上升，且以CJS POD 活性較高，其活性峰值比CZ2 和CL1 峰值分別高25.00%和11.11%。

圖9 3個楸樹材料處理后葉片POD活性變化Fig.9 Changes of POD activity in treated leaves of three Catalpa species

3 結(jié)論與討論

楸樹莖腐病的發(fā)生在國內(nèi)尚未見相關(guān)報道。本試驗首次對楸樹莖腐病感病植株進行了病原菌分離純化，通過柯赫氏法則對致病性進行驗證，確認(rèn)GO100307 菌株致病癥狀與田間感病植株癥狀一致，將其確定為楸樹莖腐病的病原菌。經(jīng)形態(tài)學(xué)結(jié)合分子生物學(xué)鑒定后，確認(rèn)該菌株為露濕漆斑菌（Mymthecium roridum）。根據(jù)文獻報道，露濕漆斑菌對西紅柿[10]、山藥[11]、西葫蘆[12]、鐵皮石斛[13]及苜蓿[14]等植物都能產(chǎn)生致病性，可造成植株葉斑、果斑、根腐和莖腐等現(xiàn)象。在禾谷類和木本植物研究中發(fā)現(xiàn)，禾谷鐮刀菌（F.graminearum）、禾生腐霉菌（P.graminicola）、層出鐮刀菌（F.proliferatum）、擬輪枝鐮孢菌（F.verticillioides）、木賊鐮刀菌（F.equiseti）、終極腐霉菌（P.ultimum）等[15-17]均能引起莖腐病。但本研究首次發(fā)現(xiàn)露濕漆斑菌可以引起楸樹發(fā)生莖腐病。

通過離體葉片穿刺接種與浸根法將分離篩選得到的致病菌GO100307 回接到3 個不同楸樹材料上，結(jié)果表明，該菌對3 個楸樹材料都有致病性，但對不同楸樹材料的致病性差異明顯。在離體葉片穿刺試驗中，CL1 的抗性優(yōu)于CJS 和CZ2，通過觀察發(fā)現(xiàn)，CL1葉片的革質(zhì)化程度高，能更好地保護葉片免受侵害，體現(xiàn)了很好的葉部抗性；但在浸根試驗中CJS 的抗性優(yōu)于CL1 和CZ2，且沒有感病植株死亡的現(xiàn)象，體現(xiàn)了更好的根部抗性。

浸根法接種病原菌后，不同楸樹材料葉片的酶活性變化有明顯差異。β-1，3-葡聚糖酶是植物抗病反應(yīng)中的關(guān)鍵病程相關(guān)蛋白，在植物抗病防御反應(yīng)中起著重要作用[18-19]。較高抗性的CJS 在接種病菌后β-1，3-葡聚糖酶活性達(dá)到峰值較早，對病原菌的反應(yīng)較為迅速。

植物在受到病原菌侵染時，會引起其體內(nèi)活性氧代謝失調(diào)，導(dǎo)致氧化脅迫。這時體內(nèi)的保護酶系統(tǒng)會發(fā)揮作用，減輕脅迫給植物帶來的傷害，SOD、POD 是植物體內(nèi)主要的活性氧清除酶[20-21]。在接種病原菌后，CJS 和CL1 葉片SOD 活性均表現(xiàn)為先升高后降低，CZ2 葉片SOD 活性則是先降低后升高，上升幅度也較小，說明在遇到侵染時，高抗材料的SOD 活性響應(yīng)速度及幅度均優(yōu)于低抗材料。在接種病菌后，3個楸樹材料葉片POD活性均有提高，雖然CL1 的POD 活性較早達(dá)到峰值，但CJS 的POD 活性峰值高于其他2個楸樹材料且上升幅度更大。結(jié)果表明，CJS 具有較高抗性的原因可能是其自身保護酶系統(tǒng)和病程相關(guān)蛋白對病原菌的感知能力較強，當(dāng)遇到病原物刺激時，能及時做出防御反應(yīng)，抵抗病原菌的侵染。

本研究對楸樹莖腐病植株進行病原菌分離鑒定，并對獲得的致病菌株進行形態(tài)與分子鑒定，確認(rèn)引起楸樹莖腐病的病原菌為露濕漆斑菌（Myrothecium roridum）。3 個楸樹材料對莖腐病致病菌的抗性表現(xiàn)為金絲楸最強，葉片β-1，3-葡聚糖酶、POD活性峰值高于其他2個楸樹材料。