齊云峰，李銘新，董成成，王雨琦，黃 樂

(吉林師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，吉林 四平 136000)

0 引言

癌癥目前是全球人類面臨的最大公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)之一，根據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)數(shù)據(jù)顯示，2020年新發(fā)癌癥病例已達(dá)到了1929萬例，死亡病例達(dá)到了996萬例[1].目前癌癥已成為全球十大重大疾病之一，且罹患癌癥病人通常預(yù)后不良，生存率低.癌癥的誘因通常十分的復(fù)雜，一方面癌癥的高發(fā)體現(xiàn)了經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，人們普遍生活壓力較大，飲食習(xí)慣不健康，另一方面也體現(xiàn)了全球人口的老齡化[2-3].所以癌癥的診斷與預(yù)防已經(jīng)成為科研工作者亟待解決的問題.已發(fā)現(xiàn)信號(hào)通路表達(dá)失調(diào)是最常見的癌癥驅(qū)動(dòng)因素.Wnt信號(hào)通路是一種進(jìn)化程度十分保守的信號(hào)分子，廣泛的參與胚胎發(fā)育、細(xì)胞增值、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡，是一種重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[4-7].已有研究表明，Wnt信號(hào)通路其途徑成分突變與表達(dá)失調(diào)可誘發(fā)疾病，尤其是癌癥[8-10].分泌型卷曲相關(guān)蛋白(Secreted Frizzled-related Proteins，SFRPs)是Wnt信號(hào)通路中最大的基因家族[11-14].作為Wnt信號(hào)拮抗因子，SFRPs可通過與Wnt配體結(jié)合形成無功能復(fù)合物，從而阻斷Wnt信號(hào)通路表達(dá).已有學(xué)者通過實(shí)驗(yàn)表明，SFRP基因家族發(fā)生DNA甲基化，表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致Wnt信號(hào)通路表達(dá)異常從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生.已有研究表明，SFRP基因家族中的基因在許多癌癥類型中都存在著異常表達(dá)的情況[15-18].例如，F(xiàn).Atschekzei等[19]使用亞硫酸氫鹽處理過的DNA的焦磷酸測序用于病例對(duì)照研究，研究包括120例正常腎組織和從腫瘤鄰近區(qū)域獲得的72例癌旁組織，發(fā)現(xiàn)SFRP1的甲基化會(huì)導(dǎo)致腎細(xì)胞癌的風(fēng)險(xiǎn)增加.X.Y.Liu等[20]研究發(fā)現(xiàn)大腸癌患者SFRP2基因甲基化水平明顯高于相鄰的非腫瘤組織(P<0.001)，表明SFRP2基因可作為大腸癌獨(dú)立生物標(biāo)識(shí)物.C.Kirana等[21]通過評(píng)估大腸癌患者與非大腸癌患者SFRP5基因表達(dá)得出結(jié)論，SFRP5可以作為生理性腫瘤抑制基因，并且證明其在預(yù)后中可作為生物標(biāo)識(shí)物.

基于以上研究，本文使用TCGA數(shù)據(jù)庫中該基因家族在18種癌癥中的表達(dá)數(shù)據(jù)，研究了SFRP基因家族與癌癥患者生存率的關(guān)聯(lián).并且研究了該基因家族與腫瘤微環(huán)境、藥理活性的相關(guān)性.研究結(jié)果顯示，SFRP2普遍在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，SFRP1、SFRP4、SFRP5則主要下調(diào).基因表達(dá)量與患者生存率的關(guān)聯(lián)方向則取決于所測試的癌癥類型.SFRP基因家族與免疫亞型、腫瘤微環(huán)境顯著相關(guān)，但關(guān)聯(lián)的程度卻因不同的基因與不同的癌癥而異.綜上所述，本研究區(qū)分了SFRP基因家族中的成員在每種腫瘤類型中作用的不同，研究結(jié)果表明需要將SFRP基因家族中的每個(gè)成員當(dāng)作單獨(dú)實(shí)體進(jìn)行研究.

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

RNA-Seq，臨床數(shù)據(jù)，基于mRNA的干性打分(RNAss)和DNA甲基化(DNAss)數(shù)據(jù)以及免疫亞型數(shù)據(jù)均來自于Xena(https：//xenabrowser.net/datapages/).腫瘤數(shù)據(jù)來源于癌癥基因組譜圖數(shù)據(jù)庫(The cancer Genome Atlas，TCGA).涉及的腫瘤共31種類型，分別是腎上腺皮質(zhì)癌(ACC)、膀胱尿路上皮癌(BLCA)、乳腺浸潤癌(BRCA)、宮頸鱗狀細(xì)胞癌和宮頸內(nèi)腺癌(CESC)、膽管癌(CHOL)、結(jié)腸腺癌(COAD)、淋巴樣腫瘤彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBC)、食道癌(ESCA)、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(HNSC)、嫌色性腎細(xì)胞癌(KICH)、腎透明細(xì)胞癌(KIRC)、腎乳頭狀細(xì)胞癌(KIRP)、急性骨髓性白血病(LAML)、腦低級(jí)別膠質(zhì)瘤(LGG)、肝細(xì)胞肝癌(LIHC)、肺腺癌(LUAD)、肺鱗癌(LUSC)、間皮瘤(MESO)、卵巢漿液性囊腺癌(OV)、胰腺癌(PAAD)、嗜鉻細(xì)胞瘤和副神經(jīng)節(jié)瘤(PCPG)、前列腺癌(PRAD)、直腸腺癌(READ)、肉瘤(SARC)、皮膚黑色素瘤(SKCM)、胃癌(STAD)、睪丸癌(TGCT)、甲狀腺癌(THCA)、胸腺癌(THYM)、子宮內(nèi)膜癌(UCEC)、子宮肉瘤(UCS)、葡萄膜黑色素瘤(UVM).共從TCGA數(shù)據(jù)庫下載11057個(gè)樣品，樣品預(yù)處理均使用R語言(4.0.0版本)，并剔除臨床信息不全樣品.

1.2 腫瘤微環(huán)境分析

使用ESTIMATE程序分析不同腫瘤中免疫細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞浸潤水平，分析數(shù)據(jù)來源于TCGA數(shù)據(jù)庫.SFRP基因家族表達(dá)與免疫細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞相關(guān)性使用斯皮爾曼(Spearman)相關(guān)性分析，并測試了六種免疫亞型與SFRPs表達(dá)之間的相關(guān)性.

1.3 藥物敏感性分析

使用CellMiner網(wǎng)站(https：//discover.nci.nih.gov/cellminer/)進(jìn)行藥物敏感性分析，該網(wǎng)站可訪問NCI-60數(shù)據(jù)庫.將SFRP基因家族mRNA表達(dá)水平與細(xì)胞敏感性數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)，使用斯皮爾曼相關(guān)性分析進(jìn)行相關(guān)性打分，涉及262種FDA批準(zhǔn)的藥物或處于臨床實(shí)驗(yàn)中的藥物.

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用線性回歸模型(GLMM)比較正常樣品與腫瘤樣品之間基因表達(dá)差異，箱線圖用來展示SFRP基因家族不同基因在不同癌癥之間表達(dá)差異情況.基因表達(dá)與患者生存率之間的關(guān)系使用單因素Cox分析、多因素Cox分析與Log-rank檢驗(yàn)方法.腫瘤微環(huán)境相關(guān)性、腫瘤干細(xì)胞相關(guān)性分析、藥物敏感性使用Spearman或Pearson相關(guān)性分析.本文所有的分析使用R語言(4.0.0版本)完成，并且使用ggplot2、ggpubr、survminer、pheatmap、corrplot、survival包繪制文章圖片.

2 結(jié)果分析

2.1 SFRP基因家族在泛癌中的表達(dá)

圖1(A)展示了SFRP基因家族在不同癌癥中的平均表達(dá)量情況，可以得出結(jié)論，在SFRP基因家族中，SFRP2基因在不同癌癥中平均表達(dá)量最高，SFRP5則最低.數(shù)據(jù)結(jié)果表示SFRP基因家族的表達(dá)存在內(nèi)部差異.將SFRP基因家族中的不同基因當(dāng)作獨(dú)立的實(shí)體研究是具有研究價(jià)值與意義的.在腫瘤發(fā)生過程中起作用的一個(gè)基因的定義特征是它們?cè)诎┌Y腫瘤中的表達(dá)失調(diào).并且越來越多的證據(jù)表明，SFRP基因家族在多種癌癥類型中發(fā)生了改變.在接下來的研究中，我們調(diào)查了18種癌癥類型的原發(fā)性癌癥患者所有4個(gè)基因的表達(dá)水平.根據(jù)圖1(B)所示，所有SFRP基因在不同的癌癥中均表現(xiàn)出顯著的差異，但是每種基因和每種癌癥類型的表達(dá)改變方向都不同.在被研究的腫瘤類型中，SFRP1基因主要下調(diào)，SFRP2、SFRP4、SFRP5基因則主要上調(diào)，但也有一些例外的情況.另外，我們進(jìn)行了Spearman相關(guān)性測試，各種癌癥類型中各個(gè)SFRP基因家族成員的表達(dá)水平呈現(xiàn)正相關(guān)，但從圖1(C)中可以明顯觀察到SFRP2和SFRP4呈現(xiàn)較高的相關(guān)性(r=0.26).這可能是由于它們具有某些共同的功能或特征.

圖2展示了SFRP1、SFRP2、SFRP4、SFRP5基因在癌癥與相鄰癌旁組織中表達(dá)差異情況.結(jié)果表明，這四種基因在不同癌癥類型中表達(dá)的方向存在差異.例如，SFRP1在BLCA腫瘤組織中低表達(dá)，而在CHDL、LUSC、ESCA這三種癌癥中正常組織與癌癥組織的表達(dá)沒有顯著差異.SFRP2在COAD、THCA、READ中低表達(dá)，在CHOL、LUAD中呈現(xiàn)高表達(dá).這些差異說明SFRP基因家族在腫瘤組織中的表達(dá)會(huì)發(fā)生失調(diào).

圖2 SFRP1(A)、SFRP2(B)、SFRP4(C)、SFRP5(D)在癌癥與相鄰癌旁組織基因表達(dá)差異

從圖3中能夠確定SFRP基因家族的表達(dá)與腫瘤患者生存率存在著關(guān)聯(lián).且SFRP基因家族的成員在31種腫瘤中所起到的作用方向各不相同，并且SFRP1基因的表達(dá)通常導(dǎo)致ACC、BLCA、KIRP、OV患者預(yù)后較差.

圖3 SFRP基因表達(dá)與不同癌癥類型患者總體生存率關(guān)系

眾所周知，在人類腫瘤中已經(jīng)鑒定出六種免疫亞型，分別為C1(組織愈合型)、C2(IFN-γ主導(dǎo)型)、C3(炎癥性)、C4(淋巴細(xì)胞耗竭型)、C5(免疫靜默型)、C6(TGF-β主導(dǎo)型).我們將SFRP基因家族的基因表達(dá)水平與TCGA數(shù)據(jù)庫中的免疫浸潤情況相關(guān)聯(lián)，結(jié)果呈現(xiàn)在圖4(A)中.由圖可知該基因家族的四種基因在六種免疫亞型中的表達(dá)有顯著差別(P<0.001).并且SFRP2基因的高表達(dá)與C1，C2，C6相關(guān)，并且通常與C1，C2，C6免疫亞型相關(guān)的患者生存率較低，由此可推斷出SFRP2基因可能充當(dāng)著腫瘤啟動(dòng)子的角色.由于癌癥在發(fā)生發(fā)展與轉(zhuǎn)移的過程中，腫瘤細(xì)胞與其所處的內(nèi)外環(huán)境有著密切的關(guān)系.腫瘤細(xì)胞還可以通過調(diào)節(jié)自分泌與旁分泌，改善自身的生存與發(fā)展條件，促進(jìn)自身的生長與發(fā)展.所以我們研究了SFRP基因家族表達(dá)水平與基質(zhì)細(xì)胞之間的相關(guān)性，從結(jié)果可以看出SFRP基因家族與基質(zhì)細(xì)胞相關(guān)性非常強(qiáng).更具體來說，SFRP2與BLCA、BRCA、CESC、PAAD、PRAD之前存在著顯著的正相關(guān)關(guān)系(p<0.001)以及SFRP4與BLCA、BRCA、LGG、PAAD之間存在正相關(guān)關(guān)系.但也存在一些負(fù)相關(guān)的關(guān)系，例如SFRP1與ACC、LGG、UVM，SFRP2與LGG.為了驗(yàn)證結(jié)果的準(zhǔn)確性，我們同時(shí)測試了SFRPS與免疫的相關(guān)性，并且評(píng)估了SFRPS免疫細(xì)胞浸潤水平與腫瘤細(xì)胞干性的分?jǐn)?shù)，其結(jié)果與基質(zhì)測試結(jié)果相似.

圖4 SFRP基因表達(dá)與免疫浸潤亞型關(guān)聯(lián)(A)和基于ESTIMATE算法的SFRP基因表達(dá)與16種不同癌癥類型的基質(zhì)評(píng)分之間的相關(guān)性(B)

據(jù)報(bào)道，細(xì)胞分化能力的逐漸喪失和干細(xì)胞樣特征的獲得是驅(qū)動(dòng)腫瘤進(jìn)展的主要原因.SFRP基因與腫瘤干細(xì)胞相關(guān)性可通過基于mRNA表達(dá)(RNAss)與DNA甲基化模式(DNAss)來評(píng)估.圖5(A)和(B)展示了SFRP基因在33種癌癥中與DNAss和RNAss相關(guān)性.從結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SFRP1、SFRP2、SFRP4、SFRP5與DNAss和RNAss多呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性.但SFRP基因在部分腫瘤中也與DNAss呈現(xiàn)正相關(guān)性.

圖5 SFRP基因表達(dá)與腫瘤干細(xì)胞相關(guān)性(DNAss、RNSss)

為了研究SFRP基因表達(dá)水平與藥物敏感性的關(guān)系，本文研究了SFRP基因家族在60種人類癌癥細(xì)胞系中的表達(dá)與藥物敏感性相關(guān)性.藥物敏感性得分越高，表明細(xì)胞對(duì)該藥物治療越敏感.可以從結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SFRP對(duì)許多化療藥物的耐藥性顯著相關(guān)(見圖6).

圖6 使用NCI-60細(xì)胞系數(shù)據(jù)分析SFRP基因與藥物敏感性相關(guān)性

例如，SFRP5與Denileukin Diftitox Ontak的細(xì)胞耐藥性相關(guān)(Cor=0.577，P<0.001)，該藥物可參與治療T細(xì)胞淋巴瘤.SFRP2與Idelalisib細(xì)胞耐藥性相關(guān)(Cor=0.447，P<0.001)，該藥物可有效治療復(fù)發(fā)/難治性慢性淋巴白細(xì)胞白血病、小淋巴細(xì)胞淋巴瘤、濾泡性B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤.SFRP4與Ibrutinib細(xì)胞耐藥性相關(guān)(Cor=0.447，P=0.001)，該藥可用于套細(xì)胞淋巴瘤治療.同時(shí)，在結(jié)果中也可以觀察到SERP2和SFRP1均與Belinostat細(xì)胞耐藥性相關(guān).

3 結(jié)論

本文對(duì)SFRP基因家族的基本情況進(jìn)行了系統(tǒng)的表征.并對(duì)SFRP基因家族在不同類型的癌癥與免疫亞型中起到的作用進(jìn)行了研究.研究發(fā)現(xiàn)，SFRP2基因可能在腫瘤中充當(dāng)著啟動(dòng)子角色，并且與腫瘤的不良預(yù)后相關(guān).SFRP1、SFRP4、SFRP5基因則可能更多的發(fā)揮著抑癌基因的作用.但是對(duì)于特定的腫瘤類型而言，SFRP基因家族的基因所表現(xiàn)出的行為也不相同.綜上所述，SFRP基因家族對(duì)不同腫瘤的預(yù)后具有異質(zhì)性，由此可推斷該基因家族基因之間的差異性可導(dǎo)致生物功能異質(zhì)性.此項(xiàng)工作對(duì)SFRP基因家族在腫瘤微環(huán)境、藥物敏感性方面以及在腫瘤中的作用進(jìn)行了闡釋，為后續(xù)開發(fā)個(gè)性化的癌癥藥物提供了工作基礎(chǔ).