古展鑫 盧夢月 劉銳 劉付昌盛 劉華盛

(廣西中醫(yī)藥大學(xué) 1研究生院，廣西 南寧 530000；2附屬瑞康醫(yī)院老年病科)

中國心血管病患病率仍在逐年上升，并未見放緩趨勢〔1〕。動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是一種緩慢進(jìn)展性疾病，它是心血管疾病的主要病理改變之一。AS發(fā)病的病理生理過程復(fù)雜，與炎癥浸潤、內(nèi)皮損傷、氧化應(yīng)激反應(yīng)及免疫等各種因素密切相關(guān)〔2～4〕，其中，由動(dòng)脈管壁上各種脂質(zhì)成分累積而產(chǎn)生斑塊是AS形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因此，如何抑制巨噬細(xì)胞吞噬氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)、改善泡沫細(xì)胞的脂質(zhì)代謝，抑制巨噬細(xì)胞泡沫化成為防治AS的關(guān)鍵。

中醫(yī)無AS病名，但依據(jù)其血脂異常的發(fā)病病因，可歸屬中醫(yī)的“痰濁”“膏脂”等范疇。其基本病機(jī)以脾腎不足為本，痰瘀互結(jié)為標(biāo)的本虛標(biāo)實(shí)之證。痰瘀互結(jié)浸潤血脈是其主要病理特征。益脈降脂湯是針對AS脾虛痰濁、肝腎虧虛、痰瘀互結(jié)浸潤血脈等病機(jī)特征，以健脾化痰、滋補(bǔ)肝腎、活血化瘀為主要治療原則，辨證與辨病結(jié)合，標(biāo)本兼顧。全方有健脾泄?jié)?，滋補(bǔ)肝腎，活血通絡(luò)之功效。方中黃芪、白術(shù)、茯苓、澤瀉健脾化痰泄?jié)?；黃精、何首烏、杞子滋補(bǔ)肝腎，丹參活血祛瘀，通利血脈，血行則痰自去；焦山楂消食和胃；菊花、草決明清肝瀉火；絞股藍(lán)有明顯降血脂作用，為辨病用藥。前期臨床研究表明，益脈降脂湯能顯著降低總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)，升高高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)〔5〕，還能降低C反應(yīng)蛋白，改善血液流變學(xué)指標(biāo)水平〔6〕，從而改善AS。為進(jìn)一步闡明益脈降脂湯改善脂質(zhì)代謝的作用，本研究建立泡沫細(xì)胞模型，探討益脈降脂湯含藥血清對泡沫細(xì)胞增殖活性和膽固醇含量的影響。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物與細(xì)胞 30只SPF級SD雌性大鼠，體重(180±20)g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格號：SCXK(湘)2018-0002，飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心；人急性白血病單核細(xì)胞系THP-1，源于ATCC，購自卓一生化(廣西)技術(shù)有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物 益脈降脂湯由黃精20 g、山楂20 g，白術(shù)10 g，茯苓10 g，丹參10 g，澤瀉10 g，絞股藍(lán)10 g，何首烏10 g，黃芪10 g，杞子10 g，菊花10 g，草決明10 g組成，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院藥劑科制備提供，分別制成含生藥1.42、2.84、5.68 g/ml〔大鼠按10 ml/(kg·d)容積灌胃時(shí)，相當(dāng)于成人等效劑量、2倍劑量、4倍劑量〕備用。阿托伐他汀鈣片(立普妥)購自桂中大藥房，生產(chǎn)批號：H20051408，使用前研磨粉碎，配制成含阿托伐他汀鈣0.2 mg/ml〔大鼠按10 ml/(kg·d)容積灌胃時(shí)，相當(dāng)于成人等效劑量〕備用。

1.3主要試劑與儀器 主要試劑：Gibco RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco公司，C11875500BT)；澳洲進(jìn)口胎牛血清(Gibco公司，10099141C)；ox-LDL(北京Solarbio公司，H7950-2 mg)；佛波酯(PMA，北京Solarbio公司，SP9830-1 mg)；TC測定試劑盒(北京普利萊生物公司，SJ-E1015)；噻唑藍(lán)(MTT,北京Solarbio公司，M8180-250 mg)；飽和油紅O染色液(北京Solarbio公司，G1260-500 ml)。主要儀器：生物安全柜〔青島海爾(特種)，HR1200-ⅡB2〕；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(日本Sanyo公司，MCO-18AIC)；倒置顯微鏡(德國Leica公司，DMI3000B)；高速離心機(jī)(美國Thermo公司，ST-16R)；全波長酶標(biāo)儀(美國 Biotek，Epoch Biotek)。

1.4含藥血清制備 將SD大鼠30只，隨機(jī)分成益脈降脂湯(中藥)高、中、低劑量組及阿托伐他汀鈣(西藥)組、生理鹽水(空白對照)組各6只；適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w。灌胃時(shí)各組每日給藥1次，連續(xù)7 d。次日晨再灌胃1次，末次給藥1 h后，無菌條件下自腹腔動(dòng)脈采血。將各組全血標(biāo)本靜置3 h后，以3 000 r/min 4℃離心15 min，取同組血清混勻置于56℃水浴中30 min滅活，過濾除菌后EP管分裝。-20℃低溫冰箱冷藏備用。

1.5THP-1細(xì)胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化 生長狀態(tài)良好的THP-1細(xì)胞使用含10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培養(yǎng)基在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)細(xì)胞；使用終濃度為320 mmol/L的PMA混勻共同孵育細(xì)胞，誘導(dǎo)其分化為巨噬細(xì)胞，24 h后顯微鏡下拍照觀察。

1.6泡沫細(xì)胞建立及鑒定 將THP-1細(xì)胞刺激誘導(dǎo)分化為具有吞噬能力的巨噬細(xì)胞后，繼以終濃度為80 mg/L的ox-LDL完全培養(yǎng)液，于37℃，5%CO2的條件下的恒溫恒濕培養(yǎng)箱共同孵育48 h，最終建立泡沫細(xì)胞模型。

1.7油紅O染色方法 將飽和油紅O染色液與PBS按3∶2比例配制，用濾紙除雜質(zhì)；用純水配制60%異丙醇，備用；將培養(yǎng)好的各組細(xì)胞取出，各孔棄上清，PBS緩慢沖洗2遍，加入4%多聚甲醛固定20 min。棄液后，每孔使用1 ml 60%異丙醇沖泡1 min，后棄去；使用配制好的油紅O染色液著色20 min。棄染色液，加入1 ml異丙醇分化10～15 s，PBS洗滌2次；蘇木素復(fù)染2 min，后棄液，PBS洗滌2次，將細(xì)胞爬玻片取出，濾紙吸干水液。取載玻片，滴注甘油明膠，蓋上細(xì)胞爬玻片，輕輕按壓使之貼合不留氣泡，倒置顯微鏡下觀察染色情況。

1.8MTT比色法檢測各組細(xì)胞增殖活性 取對數(shù)生長期狀態(tài)良好的THP-1細(xì)胞，用10%FBS完全培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為7×104～8×104/ml，加入PMA使細(xì)胞懸液終濃度含320 mmol/L的PMA，種于96孔板，每孔100 μl，每組10個(gè)復(fù)孔。放至37℃、5%CO2條件的誘導(dǎo)分化24 h后貼壁。24 h后除巨噬細(xì)胞組加入10%FBS完全培養(yǎng)基外，其余各組分別加入含80 mg/L的ox-LDL 10%FBS完全培養(yǎng)基，使其余各組變成泡沫細(xì)胞，建模成功后將巨噬細(xì)胞組和模型組加入空白對照組血清，西藥組及中藥高、中、低劑量組加入相應(yīng)劑量的10%含藥血清，設(shè)含藥血清干預(yù)時(shí)間梯度為12、24、48 h。在各時(shí)間段干預(yù)結(jié)束后，每孔加入10 μl MTT溶液，避光繼續(xù)孵育4 h。后每孔加入150 μl的二甲基亞砜(DMSO)，震蕩5～10 min后放至全波長酶標(biāo)儀，吸收波長為490 nm，測定各孔OD值，分析益脈降脂湯含藥血清對巨噬細(xì)胞泡沫化增殖活性的影響。

1.9細(xì)胞內(nèi)TC含量測定 取對數(shù)生長狀態(tài)良好的THP-1細(xì)胞重懸細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml，每孔2 ml，種于6孔板，經(jīng)由PMA誘導(dǎo)24 h后貼壁。除巨噬細(xì)胞組外，其余各組細(xì)胞再由80 mg/L的ox-LDL刺激48 h后，轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽?xì)胞。將巨噬細(xì)胞組和模型組加入空白對照組血清，西藥組及中藥高、中、低劑量組加入相應(yīng)劑量的含藥血清，使含藥血清終濃度為10%，設(shè)定含藥血清干預(yù)時(shí)間為12、24、48 h 3個(gè)干預(yù)時(shí)間點(diǎn)。各干預(yù)時(shí)間結(jié)束后嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟檢測細(xì)胞內(nèi)TC含量。

1.10油紅O染色觀察含藥血清對泡沫細(xì)胞脂質(zhì)蓄積的影響 取對數(shù)生長期狀態(tài)良好的THP-1細(xì)胞，用10%FBS完全培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml，種于6孔板，每孔2 ml，每組種板前在孔內(nèi)放置1片爬玻片，以便后續(xù)染色后觀察細(xì)胞。誘導(dǎo)分化24 h后取出六孔板，棄上清，除巨噬細(xì)胞組加入10%FBS完全培養(yǎng)基外，其余各組分別加入含80 mg/L的ox-LDL 10%FBS完全培養(yǎng)基，使其余各組變成泡沫細(xì)胞，將巨噬細(xì)胞組和模型組加入空白對照組血清，西藥組及中藥高、中、低劑量組加入相應(yīng)劑量的10%含藥血清；各組血清干預(yù)48 h后，取各組細(xì)胞爬玻片，進(jìn)行油紅O 染色，甘油明膠封片后，倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞脂質(zhì)蓄積情況，染色區(qū)域面積用油紅O染色面積比重〔Area(%)〕表示，其數(shù)值越大，表示染色區(qū)域越大，即細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積越明顯。

1.11統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、LSD法、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1THP-1細(xì)胞刺激誘導(dǎo)形成的巨噬細(xì)胞形態(tài) 經(jīng)濃度320 mmol/L的PMA刺激誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞24 h后，可分化成不規(guī)則形態(tài)或類圓形或梭形狀態(tài)的貼壁細(xì)胞，一般有偽足延伸。見圖1。

2.2泡沫細(xì)胞模型建立及鑒定 巨噬細(xì)胞由于吞噬了大量ox-LDL，會(huì)在胞內(nèi)形成大量脂滴，細(xì)胞形態(tài)會(huì)相應(yīng)增大，胞內(nèi)脂滴會(huì)被著染形成紅色或橘紅色脂質(zhì)累積點(diǎn)，即紅色顆粒斑點(diǎn)狀代表為脂滴；對照組在無ox-LDL加入共同孵育的情況下，胞內(nèi)少見或未見明顯紅色脂滴累積；而在經(jīng)過ox-LDL共同孵育48 h后的實(shí)驗(yàn)組結(jié)果顯示，可見大量的紅色脂滴在細(xì)胞內(nèi)蓄積。見圖2。

圖1 PMA刺激誘導(dǎo)24 h后不同倍鏡下巨噬細(xì)胞形態(tài)(油紅O染色)

圖2 無ox-LDL組和ox-LDL組分別在不同倍鏡下脂質(zhì)蓄積情況(油紅O染色)

2.3MTT法檢測各組含藥血清對泡沫細(xì)胞增殖影響 隨著干預(yù)時(shí)間延長，各組吸光度(OD)值逐漸降低，48 h測得各組細(xì)胞OD值最低；益脈降脂湯含藥血清干預(yù)12 h、24 h和48 h后，與巨噬細(xì)胞組相比，同時(shí)間點(diǎn)模型組OD值顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，同時(shí)間點(diǎn)西藥組與中藥各劑量組的OD值均顯著升高(P<0.05)，見表1。

表1 各組含藥血清干預(yù)不同時(shí)間對巨噬細(xì)胞泡沫化 增殖活性的影響

2.4各組干預(yù)不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞內(nèi)TC含量比較 與巨噬細(xì)胞組相比，相同時(shí)間點(diǎn)模型組細(xì)胞內(nèi)TC含量顯著增高(P<0.05)；與模型組相比，相同時(shí)間點(diǎn)西藥組與中藥各劑量組細(xì)胞內(nèi)TC含量明顯降低(P<0.05)，見表2。

2.5油紅O染色觀察各組含藥血清對泡沫細(xì)胞脂質(zhì)蓄積的影響 與模型組對比，巨噬細(xì)胞組胞內(nèi)少見或未見明顯紅色脂滴累積；而在各組含藥血清干預(yù)后的泡沫細(xì)胞，在顯微鏡下仍均可見紅色脂滴在細(xì)胞內(nèi)蓄積，但與模型組對比，西藥組和中藥各劑量組脂質(zhì)蓄積明顯減少，見圖3。

表2 各組干預(yù)下同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞中TC水平 比較

圖3 各組細(xì)胞脂質(zhì)蓄積(油紅O染色，×20)

2.6Image J Area(%)的半定量分析 與巨噬細(xì)胞組(3.095%)比較，模型組Area(%)(9.944%)明顯升高，與模型組比較，西藥組和中藥高、中、低各劑量組Area(%)(6.033%、6.819%、6.215%、7.494%)明顯降低(P<0.05)。

3 討 論

本研究根據(jù)前期研究和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，通過應(yīng)用中藥血清藥理學(xué)〔7～9〕藥方法，進(jìn)一步探究益脈降脂湯含藥血清對泡沫細(xì)胞的脂質(zhì)代謝的影響作用。美國心臟協(xié)會(huì)指出，易損性斑塊所包括的薄纖維帽狀A(yù)S，其特征是病變由一個(gè)小于65 μm厚的纖維帽覆蓋，其中就包含許多富含脂質(zhì)的巨噬細(xì)胞泡沫細(xì)胞，巨噬細(xì)胞能合成和釋放多種生長因子和炎癥因子，還分泌多種基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)，削弱纖維帽并使其容易破裂。而當(dāng)泡沫細(xì)胞凋亡壞死，會(huì)將細(xì)胞內(nèi)大量的脂質(zhì)釋放出來，積累形成脂核，導(dǎo)致不穩(wěn)定易損斑塊的形成。因此，脂質(zhì)浸潤特別是巨噬細(xì)胞泡沫化是AS斑塊具有不穩(wěn)定易損斑塊的特征之一〔10〕，所以如何穩(wěn)定斑塊也是眾多學(xué)者共同努力的方向。本研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞在大量吞噬ox-LDL后，從形態(tài)上，細(xì)胞體形會(huì)相應(yīng)增大，說明脂質(zhì)蓄積在胞內(nèi)蓄積，而當(dāng)這種情況發(fā)生在易損斑塊，這無疑是會(huì)造成脂核的增大。因此本文希望通過在中藥含藥血清的干預(yù)下，在已經(jīng)發(fā)生巨噬細(xì)胞泡沫化之后，能夠穩(wěn)定泡沫細(xì)胞，使其減少細(xì)胞破裂而趨于相對穩(wěn)定。通常根據(jù)測得OD值，來判斷活細(xì)胞數(shù)量，OD值越大，細(xì)胞活性越強(qiáng)〔11〕。由于巨噬細(xì)胞屬于高級分化的終末細(xì)胞，是一種非特異性免疫細(xì)胞，一般不具備增殖能力〔12〕，因此也更能反映泡沫細(xì)胞的活性情況。在加入含藥血清12、24、48 h后，細(xì)胞總體增殖活性即細(xì)胞存活率隨培養(yǎng)時(shí)間增長而OD值逐漸下降，這可能也與高濃度的ox-LDL刺激有關(guān)，加速了細(xì)胞凋亡〔13〕。這并非代表含藥血清對細(xì)胞的破壞作用，而是相對時(shí)間延長，細(xì)胞凋亡增加。本研究說明了ox-LDL誘導(dǎo)下的泡沫細(xì)胞并非在含藥血清的干預(yù)下實(shí)現(xiàn)細(xì)胞增殖，而是細(xì)胞存活能力相對提高，因此含藥血清各組細(xì)胞相對模型組細(xì)胞的死亡減少。提示西藥組和中藥各劑量組的含藥血清均能對泡沫細(xì)胞存活率具有促進(jìn)作用，具有穩(wěn)定泡沫細(xì)胞使其免于凋亡破裂而加重AS。

細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量是泡沫細(xì)胞脂質(zhì)累積最直觀的評價(jià)指標(biāo)〔14〕，檢測細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量水平也可從另外一個(gè)角度闡明益脈降脂湯含藥血清對巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞脂質(zhì)代謝影響的干預(yù)作用。事實(shí)上，許多中藥的有效成分如決明子總蒽醌、絞股藍(lán)皂苷、黃芪多糖丹參多酚等已被證實(shí)具有抗巨噬細(xì)胞泡沫化的作用〔15〕，而益脈降脂湯中諸如絞股藍(lán)、山楂、澤瀉等中藥更是具有明確的降脂效果。在AS發(fā)生過程中，動(dòng)脈內(nèi)膜可見脂質(zhì)條紋和纖維樣斑塊，主要是由單核巨噬細(xì)胞吞噬膽固醇后的泡沫細(xì)胞構(gòu)成。泡沫細(xì)胞的形成是以巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯的含量占TC含量的將近一半〔16〕。本研究結(jié)果提示泡沫細(xì)胞是終末細(xì)胞，細(xì)胞會(huì)隨時(shí)間延長而凋亡，因而細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量會(huì)隨時(shí)間增加而降低。同時(shí)說明了模型組內(nèi)與模型組在吞噬大量ox-LDL之后，泡沫細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)含量明顯增高；中藥各劑量組含藥血清均對泡沫細(xì)胞的脂質(zhì)累積有明顯改善作用。

此外，本文也從形態(tài)學(xué)的角度直觀地觀察了不同組別含藥血清干預(yù)各組泡沫細(xì)胞48 h后油紅O染色情況，表明從細(xì)胞形態(tài)學(xué)上，經(jīng)過各組含藥血清干預(yù)處理后，泡沫細(xì)胞的脂質(zhì)蓄積情況明顯改善，與上述結(jié)果基本一致，從而進(jìn)一步表明益脈降脂湯含藥血清可明顯改善泡沫細(xì)胞的脂質(zhì)代謝。

綜上，益脈降脂湯含藥血清可能提高泡沫細(xì)胞生存活性，具有減少泡沫細(xì)胞凋亡、改善泡沫細(xì)胞膽固醇蓄積的作用，而益脈降脂湯的所發(fā)揮的抗AS作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。