辛寧 李小明

(1福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院，福建 福州 350001；2福建省立醫(yī)院老年科;3福建省老年病研究所)

糖尿病(DM)周圍神經(jīng)病變(DPN)可影響30%～50%的DM患者，尤其是老年患者〔1〕。DPN的臨床癥狀通常是疼痛、瘙癢和皮膚感覺喪失，這會導(dǎo)致感染甚至截肢，從而影響生活質(zhì)量和損害身體功能〔2〕。目前，隨著高通量測序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，生物信息學(xué)分析對于深入了解DPN發(fā)病機制具有重要意義。Salmena等〔3〕在2011年提出，微小(mi)RNA、長非編碼(lnc)RNA在各種生物學(xué)過程中起到重要作用。miRNA通過與目標(biāo)mRNA結(jié)合，抑制目標(biāo)mRNA的翻譯。lncRNA可與miRNA結(jié)合，起到吸附miRNA的作用，從而調(diào)節(jié)mRNA的表達(dá)水平，起到競爭性內(nèi)源(ce)RNA的作用〔3〕。一些學(xué)者對DPN的發(fā)病機制進(jìn)行了相關(guān)的生物學(xué)信息學(xué)分析，但僅對差異的mRNA進(jìn)行了研究，沒有對lncRNA的調(diào)控機制進(jìn)行研究〔4〕。本研究通過構(gòu)建ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以探討DPN發(fā)病的分子機制。

1 資料與方法

1.1數(shù)據(jù)下載 選取GEO數(shù)據(jù)庫作為研究對象，下載了芯片GSE95849(平臺GPL22448)。GSE95849中納入12份樣品，其中6份為2型(T2)DM且已排除DPN為DM組，6份為2型DPN為DPN組。樣本來自外周血。下載芯片中的矩陣文件和平臺文件。

1.2矩陣注釋 運用Perl軟件(v5.30.1)將矩陣文件和平臺文件對比，將GSE95849的矩陣文件中的探針I(yè)D轉(zhuǎn)換為基因名稱。本文從https://genome.ucsc.edu/index.html下載Human.gtf人類基因注釋文件，并使用Perl軟件將基因?qū)傩蕴砑拥交蛎幸詤^(qū)分lncRNA和 mRNA。

1.3差異分析 運用R軟件(版本3.6.2)的limma包分析，并對數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化和Log2 轉(zhuǎn)化，見圖1，對芯片中的基因表達(dá)量以log2差異倍數(shù)(logFC)>0.5或者<-0.5，并且P<0.05為篩選參數(shù)，得到差異的lncRNA與mRNA，用R軟件繪制差異表達(dá)的lncRNA和mRNA的分層聚類熱圖。logFC大于0代表此差異的RNA在DPN組上調(diào)。

1.4預(yù)測lncRNA結(jié)合的miRNA 從miRcode數(shù)據(jù)庫下載高度保守的microRNA家族文件，用Perl軟件將差異基因?qū)?yīng)到這些文件中的miRNA，分別預(yù)測得到上調(diào)的lncRNA-miRNA關(guān)聯(lián)和下調(diào)的lncRNA-miRNA關(guān)聯(lián)。

1.5預(yù)測miRNA調(diào)控的mRNA及構(gòu)建ceRNA網(wǎng)絡(luò) 使用3個miRNA數(shù)據(jù)庫〔TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_72/)、miRTarBase(http://amp.pharm.mssm.edu/Harmonizome/resource/MiRTarBase)、miRDB(http://mirdb.org/)〕，預(yù)測與miRNA相關(guān)的靶基因mRNA。將預(yù)測中上調(diào)的mRNA和實際上調(diào)的差異mRNA取交集，將預(yù)測中下調(diào)的mRNA和實際下調(diào)的差異mRNA取交集。利用Cytoscape軟件(3.7.2版)，用lncRNA、miRNA與mRNA之間的相互作用構(gòu)建ceRNA網(wǎng)絡(luò)。

圖1 GSE95849數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化

1.6基因功能注釋和信號通路分析 將獲得的差異表達(dá)基因輸入DAVID6.8(https://david.ncifcrf.gov/)在線工具進(jìn)行基因本體論(GO)功能分析,主要分析生物過程。再利用京都基因和基因組百科全書(KEGG)工具對這些基因進(jìn)行信號通路分析,以P<0.05同時伴通路基因數(shù)>3個為有意義，按P值從小到大篩選前10條項目。使用R語言將結(jié)果可視化。

1.7蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與模塊分析 使用STRING數(shù)據(jù)庫v11.0(https://string-db.org/)分析ceRNA網(wǎng)絡(luò)中mRNA編碼蛋白的相互作用。設(shè)定置信度得分>0.9為篩選參數(shù)，分析蛋白互作關(guān)系。再使用STRING得到的蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)輸入 Cytoscape 軟件v3.7.2進(jìn)行可視化分析，使用 MCODE 插件分析出 PPI 網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵子網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié) 果

2.1DM與DPN差異表達(dá)的mRNA和lncRNA DPN組與DM組比較共獲得58個差異表達(dá)的lncRNA，其中19個為上調(diào)，39個為下調(diào)。共獲得4 647個差異表達(dá)mRNA，2 360個上調(diào)，2 287個下調(diào)。差異表達(dá)的lncRNA的聚類熱圖及前100個P值最小的差異mRNA的聚類熱圖，見圖2。

2.2DM與DPN差異表達(dá)lncRNA的ceRNA網(wǎng)絡(luò)

2.2.1上調(diào)lncRNA的ceRNA網(wǎng)絡(luò) 在上調(diào)的差異表達(dá)的lncRNA中，預(yù)測得到37個miRNA，238個mRNA，見圖3。該網(wǎng)絡(luò)一共有285個節(jié)點(10個lncRNA、37個miRNA、238個mRNA),478條相互作用聯(lián)系(112條lncRNA-miRNA，366條miRNA-mRNA)。

2.2.2下調(diào)lncRNA的ceRNA網(wǎng)絡(luò) 在下調(diào)的差異表達(dá)的lncRNA中，預(yù)測得到35個miRNA，145個mRNA，見圖4。該網(wǎng)絡(luò)一共有203個節(jié)點(23個lncRNA、35個miRNA、145個mRNA),403條相互作用聯(lián)系(182條lncRNA-miRNA，221條miRNA-mRNA)。

2.3GO分析 GO富集分析結(jié)果中，本文主要研究了生物過程。上調(diào)的差異lncRNA調(diào)控的mRNA主要參與的生物過程為：RNA聚合酶Ⅱ啟動子對轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、共價染色質(zhì)修飾、凋亡過程、組蛋白H3乙?；?，見圖5。下調(diào)的差異lncRNA調(diào)控的mRNA主要參與的生物過程為：細(xì)胞凋亡信號通路中線粒體膜蛋白插入的正向調(diào)節(jié)、巨噬細(xì)胞自噬的正向調(diào)控、細(xì)胞對DNA損傷刺激的反應(yīng)、細(xì)胞對缺氧的反應(yīng)等，見圖6。

2.4KEGG分析 上調(diào)的差異lncRNA調(diào)控的mRNA主要參與的KEGG信號通路有絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β信號傳導(dǎo)途徑、腫瘤壞死因子(TNF)信號通路等，見圖7。下調(diào)的差異lncRNA調(diào)控的mRNA主要參與的KEGG信號通路有胰腺癌、癌癥信號通路、Wnt信號通路等，見圖8。

2.5PPI網(wǎng)絡(luò)及模塊分析 共有個383個mRNA輸入STRING數(shù)據(jù)庫，以置信度得分>0.9為篩選參數(shù)，除外孤立的蛋白，共得到330對PPI關(guān)系，159個蛋白，見圖9。運用MCODE插件篩選得到1個關(guān)鍵蛋白互作模塊，見圖10。其中，本文發(fā)現(xiàn)殘疾基因同源物(DAB)2及熱休克蛋白(HSP)A8與DPN的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。蛋白的lncRNA-miRNA-mRNA關(guān)系，見表1。度值越高代表與網(wǎng)絡(luò)中其他蛋白關(guān)系越密切。

紅色代表高表達(dá)，綠色代表低表達(dá)，黑色代表相對表達(dá)差異不 顯著圖2 差異表達(dá)的 lncRNA及 mRNA 分層聚類樹形圖和熱圖

紅色代表上調(diào)的lncRNA，綠色代表 miRNA，藍(lán)色代表mRNA，連線代表二者之間有調(diào)控關(guān)系圖3 上調(diào)lncRNA的ceRNA網(wǎng)絡(luò)

紅色代表下調(diào)的lncRNA，綠色代表 miRNA，藍(lán)色代表mRNA，連線代表二者之間有調(diào)控關(guān)系圖4 下調(diào)lncRNA的ceRNA網(wǎng)絡(luò)

圖5 上調(diào)的差異lncRNA調(diào)控的mRNA 主要參與的生物過程氣泡圖

圖6 下調(diào)的差異lncRNA調(diào)控的mRNA 主要參與的生物過程氣泡圖

HTLV-Ⅰ： 人嗜T-淋巴病毒1型；PI3K-Akt：磷脂酰激酶-3-激酶/蛋白激酶B；Fox叉頭盒O亞組；AMPK：腺苷酸活化蛋白激酶圖7 上調(diào)的差異lncRNA調(diào)控的mRNA 主要參與的KEGG通路

圖8 下調(diào)的差異lncRNA調(diào)控的mRNA 主要參與的KEGG通路

圓圈越大，顏色越紅代表該節(jié)點的度值越高圖9 PPI網(wǎng)絡(luò)

三角形代表上調(diào)的mRNA，V形代表下調(diào)的mRNA圖10 關(guān)鍵蛋白模塊

表1 關(guān)鍵蛋白的lncRNA-miRNA-mRNA關(guān)系

3 討 論

通過生物信息學(xué)分析，本文找到了DPN組與DM不伴DPN組之間的差異lncRNA。這些lncRNA通過調(diào)節(jié)miRNA而間接調(diào)節(jié)目標(biāo)mRNA的翻譯。lncRNA上調(diào)后，可以結(jié)合更多的miRNA，從而降低了 miRNA 對 mRNA翻譯的抑制，促進(jìn)mRNA表達(dá)，反之則抑制mRNA表達(dá)。DPN組中上調(diào)的差異lncRNA調(diào)控的mRNA富集的功能為：(1)在生物過程方面，TNF-α通過促進(jìn)依賴于RNA聚合酶Ⅱ的RNA聚合酶Ⅱ的代謝型谷氨酸受體(mGluR)5蛋白磷酸化，從而參與神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生〔5〕。DPN的病理改變以施旺細(xì)胞凋亡引起的脫髓鞘為主要特征。改善細(xì)胞凋亡在DPN的修復(fù)和改善中發(fā)揮著重要作用〔6〕。組蛋白H3乙?；才cDPN有關(guān)，神經(jīng)損傷引起的疼痛可以增加背根節(jié)中嘌呤能X3受體(P2X3-R)的水平。P2X3-R位點正是通過招募介導(dǎo)組蛋白乙酰化的表觀遺傳調(diào)節(jié)子來控制P2X3-R基因的轉(zhuǎn)錄〔7〕。最后，持續(xù)性高血糖會激活NF-κB信號通路，從而觸發(fā)各種細(xì)胞因子、趨化因子和細(xì)胞黏附分子的表達(dá)〔8〕。(2)KEGG通路方面，MAPK信號途徑參與轉(zhuǎn)錄因子磷酸化。這些轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)的基因產(chǎn)物參與了神經(jīng)的生長發(fā)育，包括樹突修剪、軸突生長、突觸的可塑性等〔9〕。TGF-β是多效性細(xì)胞因子，參與炎癥反應(yīng)。在神經(jīng)系統(tǒng)損傷后，TGF-β調(diào)節(jié)神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的行為，從而介導(dǎo)再生過程〔10〕。因此，TGF-β信號傳導(dǎo)上調(diào)則可能是神經(jīng)損傷后的病理反應(yīng)。硫辛酸是常見的治療DPN的抗氧化劑，而TGF-β可增加脂質(zhì)過氧化作用，硫辛酸可降低TGF-β表達(dá)〔11〕。TNF可導(dǎo)致中樞水平的β腎上腺素能受體表達(dá)改變，導(dǎo)致神經(jīng)的痛閾降低，還能間接調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞合成的疼痛介質(zhì)〔12〕。

由下調(diào)的差異lncRNA調(diào)控的mRNA參與功能為：(1)在生物學(xué)過程方面，細(xì)胞凋亡信號通路與DPN關(guān)系在前文已述及。通常自噬可通過清除受損細(xì)胞器以維持細(xì)胞的正常生理代謝。DPN患者神經(jīng)組織長期處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，導(dǎo)致自噬現(xiàn)象出現(xiàn)異?！?3〕。目前許多實驗支持DM會抑制神經(jīng)細(xì)胞的自噬。有學(xué)者觀察到DM小鼠坐骨神經(jīng)自噬標(biāo)志物(LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ，p62)較正常小鼠減少，并伴有有髓神經(jīng)纖維丟失和髓鞘異?！?4〕。自噬可以通過減少受損的細(xì)胞器與蛋白在神經(jīng)元胞體內(nèi)的堆積發(fā)揮神經(jīng)保護作用〔15,16〕。(2)KEGG通路分析主要涉及腫瘤及p53信號通路、Wnt信號通路等。DM與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)〔17,18〕，這可能是因為腫瘤和DM具有一些共同的危險因素：長期的糖、脂肪代謝紊亂、胰島素抵抗等。Wnt信號通路與DPN的關(guān)系是近年研究的熱點。DM神經(jīng)病變大鼠坐骨神經(jīng)Wnt通路蛋白c-myc和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2表達(dá)增加〔19〕。動物實驗表明，抑制Wnt信號可抑制炎癥反應(yīng)，顯著改善行為痛閾和神經(jīng)功能參數(shù)〔20〕。

通過對關(guān)鍵基因的篩選，通過查閱文獻(xiàn)，本研究認(rèn)為HSPA8、DAB2可能是DPN發(fā)生的關(guān)鍵基因。如HSPA8可與自噬相關(guān)的蛋白結(jié)合，在自噬中發(fā)揮重要作用。在自噬過程中，HSPA8與HSPB8結(jié)合形成復(fù)合物，若這些HSP家族成員相互作用受到影響，則會阻斷自噬途徑〔21〕。DAB2可抑制神經(jīng)生長因子誘導(dǎo)的神經(jīng)突起生長，同時下調(diào)神經(jīng)元特異性細(xì)胞骨架蛋白β-TubulinⅢ的表達(dá)。DAB2在神經(jīng)生長因子介導(dǎo)的神經(jīng)突起生長中是一個負(fù)調(diào)控因子〔22〕。本研究發(fā)現(xiàn)C20orf197、ITPK1-AS1 2種lncRNA能同時調(diào)控HSPA8及DAB2蛋白，因此可推測，這2種lncRNA可能在DPN發(fā)生中起到關(guān)鍵作用。本文檢索了Pubmed數(shù)據(jù)庫，以DPN及C20orf197、DPN及ITPK1-AS1為摘要或者標(biāo)題搜索詞，未檢索到任何結(jié)果。因此，C20orf197、ITPK1-AS1在DPN的發(fā)生中可能扮演了一種尚未被認(rèn)識到的角色，有待進(jìn)一步驗證。本研究的優(yōu)勢是利用ceRNA網(wǎng)絡(luò)研究了lncRNA在DPN中扮演的角色。相比于mRNA，對非編碼RNA的研究能更深入地了解DPN的發(fā)病機制，從而尋找治療的靶點。

綜上，本研究揭示了DM和DPN的差異 lncRNA。差異lncRNA 與 mRNA 競爭 miRNA，從而調(diào)控蛋白合成，最終影響MAPK信號通路、TNF信號通路、TGF-β信號傳導(dǎo)途徑、腫瘤信號通路、p53信號通路、Wnt信號通路等，發(fā)現(xiàn)了5種途徑可能是DPN的發(fā)病機制：通過上調(diào)ITPK1-AS1以下調(diào)hsa-miR-17-5最終上調(diào)HSPA8；通過上調(diào)C20orf197以下調(diào)hsa-miR-20b-5p最終上調(diào)HSPA8；通過上調(diào)C20orf197以下調(diào)hsa-miR-129-5p，最終上調(diào)DAB2；通過上調(diào)MIR600HG以下調(diào)hsa-miR-129-5p，最終上調(diào)DAB2；通過上調(diào)ITPK1-AS1以下調(diào)hsa-miR-129-5p，最終上調(diào)DAB2。而C20orf197、ITPK1-AS1 2種lncRNA在DPN發(fā)生中同時調(diào)控HSPA8及DAB2蛋白，起到關(guān)鍵作用。