王 欽，汪佩涵，劉彤宇，呂 晶，朱 敬，王云甫

0 引 言

重癥肌無(wú)力(myasthenia gravis，MG)是一種累及神經(jīng)肌肉接頭處的由抗乙酰膽堿受體抗體介導(dǎo)、CD4+T細(xì)胞依賴性的自身免疫性疾病[1]，表現(xiàn)為肌肉病態(tài)疲勞和無(wú)力，目前其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是一種具有免疫調(diào)節(jié)功能的CD4+T細(xì)胞亞群，在維持免疫穩(wěn)態(tài)和免疫耐受中發(fā)揮重要作用。已有研究表明MG患者存在Treg細(xì)胞功能受損及數(shù)量減少[2-3]，MG患者免疫耐受障礙被認(rèn)為與Treg細(xì)胞功能和數(shù)量受損有關(guān)，但目前Treg細(xì)胞功能和數(shù)量受損的機(jī)制仍不清楚。

線粒體是一種具有多種生物學(xué)功能的亞細(xì)胞器，目前越來(lái)越多的研究表明線粒體對(duì)Treg細(xì)胞的生存、穩(wěn)定和抑制功能至關(guān)重要。Weinberg等[4]消融Foxp3+Tregs中線粒體電子傳遞鏈復(fù)合體III導(dǎo)致了與皮屑小鼠表型相似的致命自身免疫；線粒體ND6基因缺失會(huì)損傷電子傳遞鏈的復(fù)合體I，該基因缺陷的小鼠Treg細(xì)胞在體外失去了抑制能力[5]；線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(mitochondrial transcription factor A，Tfam)對(duì)線粒體呼吸、線粒體DNA(mitochondrial DNA， mtDNA)的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和包裝非常重要，敲除Treg細(xì)胞的Tfam后，Treg細(xì)胞穩(wěn)定性變差[6]。EAMG大鼠模型是一種與MG在癥狀、病理、免疫方面相似的動(dòng)物模型[7-9]。因此本研究擬通過(guò)構(gòu)建EAMG大鼠模型，探討EAMG中Treg細(xì)胞線粒體功能的變化,以解析MG中Treg細(xì)胞功能和數(shù)量受損的原因。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)健康純系雌性Lewis大鼠30只，6～8周齡，體重145～165 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：TY20191304。Lewis大鼠飼養(yǎng)于湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)環(huán)境，20～26 ℃，晝夜12 h循環(huán)交替，給予充足的飼料和潔凈飲水。

1.1.2主要試劑免疫動(dòng)物所需的AChR由本實(shí)驗(yàn)室前期從丁氏雙鰭電鰩電器官提取，完全弗氏佐劑(Complete Freund′s adjuvant，CFA)購(gòu)自sigma公司，大鼠CD4+T細(xì)胞分選試劑盒、Falcon?圓底聚苯乙烯管購(gòu)自Stemcell公司,CELLectionTM生物素結(jié)合劑試劑盒、Biotin偶聯(lián)的CD25抗體、異硫氰酸熒光素(FITC)偶聯(lián)的抗Biotin抗體購(gòu)自賽默飛世爾科技公司，F(xiàn)ITC偶聯(lián)的CD4抗體購(gòu)自BD Biosciences，RPMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清、青霉素及鏈霉素、紅細(xì)胞裂解液購(gòu)自Gibco公司，JC-10探針購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，活性氧檢測(cè)試劑盒、增強(qiáng)型ATP檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天公司，F(xiàn)ITC偶聯(lián)的抗細(xì)胞色素c抗體購(gòu)自Biolegend公司，Digitonin、Sapogenins Glycosides購(gòu)自上海陶術(shù)生物科技有限公司，200目細(xì)胞篩購(gòu)自晶安生物有限公司。

1.2方法

1.2.1 EAMG模型大鼠的構(gòu)建將30只6～8周齡的雌性Lewis大鼠編號(hào)后隨機(jī)分為2組，對(duì)照組、EAMG組，每組15只。對(duì)照組大鼠不予處理，EAMG組按每只EAMG大鼠注射免疫原的劑量：60 μg AChR溶于100 μL PBS中，與100μL CFA懸液混合并完全乳化，共200 μL，選取雙后肢足墊、腹部、頸背部作為免疫原注射位點(diǎn)，每個(gè)位點(diǎn)皮下注射上述乳劑50 μL。免疫后30 d，按每只模型組大鼠注射免疫原的劑量：60 μg AChR溶于100 μLPBS中，與100 μL CFA懸液混合并完全乳化，進(jìn)行加強(qiáng)免疫，于雙后肢足墊、腹部、頸背部皮下注射。

1.2.2脾細(xì)胞懸液及CD4+CD25+T細(xì)胞的分離①脾細(xì)胞懸液的制備：取構(gòu)建成功的EAMG大鼠和對(duì)照組正常大鼠，麻醉后，無(wú)菌條件下分離大鼠脾，置于200目細(xì)胞篩中，加入適量PBS(含有2%FBS)，用5mL注射器柱芯輕輕充分研磨，獲取脾細(xì)胞懸液，離心后棄上清，加入適量紅細(xì)胞裂解液，冰上裂解50 s后加入PBS至10 mL，離心后棄上清，再用PBS洗兩次，即得到脾單個(gè)核細(xì)胞懸液。②陰性分選CD4+T細(xì)胞：將獲得的脾細(xì)胞計(jì)數(shù)，300×g離心6 min后棄上清，按5×107個(gè)/mL的比例將脾細(xì)胞重懸，并將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至Falcon? 圓底聚苯乙烯管中，加入適量“雞尾酒抗體”，常溫下混合孵育10 min。然后向細(xì)胞懸液中加入適量EasySep磁珠，不需孵育。輕輕地上下?lián)u晃2～3次混勻，將乙烯管放入磁鐵中常溫下孵育3 min。將磁鐵和乙烯管倒置，將含有未被磁珠標(biāo)記的細(xì)胞懸液倒入一新的離心管中，即可得到CD4+T細(xì)胞，加入適量PBS洗滌一次并計(jì)數(shù)。③陽(yáng)性分選CD4+CD25+T細(xì)胞：取分選后的CD4+T細(xì)胞懸液，加入適量Biotin偶聯(lián)的CD25抗體，4 ℃孵育10 min，350×g離心8 min，去掉上清液，重懸后加入適量Dynabeads?磁珠，4 ℃輕輕旋轉(zhuǎn)孵育20 min，孵育后放入磁鐵中2 min，棄去上清液。從磁鐵中取下后重懸，再放入磁鐵中2 min，棄去上清液，重復(fù)該步驟2次清洗細(xì)胞以提高細(xì)胞純度。再次重懸細(xì)胞，加入適量CELLectionTM生物素結(jié)合劑試劑盒中的Release Buffer(可將磁珠與細(xì)胞分離)，在室溫下，輕輕旋轉(zhuǎn)孵化15 min，放入磁鐵中2 min，將磁鐵和乙烯管倒置，將含有與磁珠分離的細(xì)胞懸浮液倒入一新的離心管中，清洗2次，即可得到不含磁珠的CD4+CD25+Treg細(xì)胞。將獲得的細(xì)胞用FITC-CD4,PE偶聯(lián)的抗生物素單克隆抗體標(biāo)記，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)純度。用0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色，觀察細(xì)胞存活率。

1.2.3Treg細(xì)胞線粒體膜電位檢測(cè)分別將對(duì)照組和EAMG組獲得Treg細(xì)胞收集后以300×g離心5 min，去上清，用配好的染色工作液重懸，37 ℃避光孵育20 min后離心，去上清，用 JC-10 染色緩沖液(1×)清洗2次。再用300 μL JC-10 染色緩沖液(1×)重懸后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。JC-10主要以聚合體形式聚集在線粒體基質(zhì)中為主，膜電位下降時(shí)以單體形式存在，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)時(shí)，分別顯示為紅色熒光(聚合體)、綠色熒光(單體)。故本實(shí)驗(yàn)中以紅色熒光、綠色熒光比值來(lái)評(píng)價(jià)膜電位變化情況，即線粒體膜電位與紅色熒光/綠色熒光呈正相關(guān)。

1.2.4Treg細(xì)胞內(nèi)ROS水平檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS采用DCFH-DA探針檢測(cè)，DCFH-DA探針用無(wú)血清培養(yǎng)液按照1∶1000稀釋為10 μmol/L。收集EAMG組和對(duì)照組所獲得Treg細(xì)胞，300×g離心5 min，去上清。用稀釋好的DCFH-DA重懸，37 ℃孵育20 min。每隔3分鐘混勻一次。用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞三次后用300 μLPBS重懸，用流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)。

1.2.5Treg細(xì)胞ATP水平檢測(cè)分別將EAMG組和對(duì)照組所獲得Treg細(xì)胞收集后以300×g離心5 min，去上清，加入ATP檢測(cè)裂解液裂解細(xì)胞。裂解后4 ℃，12 000×g離心5 min，取上清。把ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液用ATP檢測(cè)裂解液稀釋，得到不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。按說(shuō)明書(shū)配制ATP檢測(cè)工作液，在96孔板中選定標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔并且每個(gè)檢測(cè)孔之間設(shè)置間隔孔，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品孔中加入100微升ATP檢測(cè)工作液，室溫放置5 min，本底性的ATP全部被消耗掉后加入標(biāo)準(zhǔn)品和樣品，迅速用微量移液器混勻，間隔2 s后，用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)RLU值。取少量上清通過(guò)BCA法檢測(cè)樣品蛋白濃度，最終ATP值轉(zhuǎn)換為nmol/mg蛋白的形式。

1.2.6Treg細(xì)胞Cyt c含量檢測(cè)參考Christensen等[10-11]的方法，分別將EAMG組和對(duì)照組所獲得Treg細(xì)胞收集后以300×g離心5 min，去上清，用適量的digitonin溶液(PBS含有50 μg/mL digitonin，100 mmol/L KCl)重懸細(xì)胞，冰上處理5 min。然后將細(xì)胞用PBS配制的4%多聚甲醛溶液固定20min。PBS洗滌三次，用封閉液(PBS含有3%BSA,0.05%Sapogenins Glycosides)處理1 h，然后細(xì)胞與FITC偶聯(lián)的抗細(xì)胞色素C單克隆抗體以1∶200倍稀釋度孵育，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.7透射電鏡觀察兩組Treg細(xì)胞線粒體情況分別將EAMG組和對(duì)照組所獲得的Treg細(xì)胞收集后用2.5%(體積分?jǐn)?shù))的戊二醛4 ℃固定，以備透射電鏡觀察。

2 結(jié) 果

2.1 Treg細(xì)胞的鑒定磁珠分選得到的Treg細(xì)胞經(jīng)FITC-CD4、PE偶聯(lián)的抗Biotin抗體標(biāo)記后鑒定，CD4+CD25+Treg細(xì)胞純度為：(92.16±1.87)%。見(jiàn)圖1。

a：散射光雙參數(shù)點(diǎn)圖，P1為設(shè)門目的細(xì)胞群；b：雙參數(shù)二維散點(diǎn)圖，Q1-UR象限內(nèi)為P1門中CD4+ CD25+ Treg細(xì)胞所占比例

2.2兩組Treg細(xì)胞線粒體膜電位比較EAMG組紅綠色熒光強(qiáng)度比值[(59.97±12.91)%]高于對(duì)照組[(33.73±5.30)%]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。即EAMG組Treg細(xì)胞線粒體膜電位較對(duì)照組升高。見(jiàn)圖2。

圖 2 兩組Treg細(xì)胞線粒體膜電位比較

2.3兩組Treg細(xì)胞ROS、ATP及Cyt c水平比較與對(duì)照組Treg細(xì)胞 ROS水平(100% )比較，EAMG組 [(259±37.80)%]明顯升高(P<0.05)。見(jiàn)圖3。與對(duì)照組Treg細(xì)胞ATP水平(5.56±0.29)、Cyt c表達(dá)(100%)比較，EAMG組[(4.39±0.40)、(70.67±13.32)%]下降(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

a：ROS；b: Cyt c

2.4透射電鏡觀察兩組Treg細(xì)胞線粒體情況電子顯微鏡下可見(jiàn)EAMG組Treg細(xì)胞有受損線粒體積累，線粒體形態(tài)異常，線粒體嵴受損，而對(duì)照組多見(jiàn)正常線粒體。見(jiàn)圖4。

箭頭示線粒體

3 討 論

線粒體是一種由雙層膜圍成的半自主性細(xì)胞器，一直以來(lái)被認(rèn)為是細(xì)胞的能量來(lái)源。免疫細(xì)胞在激活、增殖、死亡過(guò)程中都需要ATP，ATP主要來(lái)自于線粒體氧化磷酸化，由跨線粒體膜的電化學(xué)梯度驅(qū)動(dòng)，該梯度需要線粒體電子傳遞鏈和膜電位維持[12]。線粒體在免疫細(xì)胞中還具有多種活動(dòng)，如ROS的產(chǎn)生、Cyt c和mtDNA的釋放以及代謝調(diào)節(jié)都可以啟動(dòng)影響基因表達(dá)和細(xì)胞激活、增殖和分化的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)[13-15]，對(duì)免疫細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)和功能至關(guān)重要。有越來(lái)越多的證據(jù)表明線粒體會(huì)影響 Treg 的命運(yùn)[5,16-17]，并提出線粒體功能缺陷可能是自身免疫過(guò)程中 Treg 缺陷的驅(qū)動(dòng)力。

線粒體是對(duì)各種損傷最為敏感的細(xì)胞器之一，在不同致病因素刺激下極易發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能的損傷，線粒體功能異常會(huì)使細(xì)胞內(nèi)ROS和應(yīng)激增加，介導(dǎo)細(xì)胞損傷和死亡，最終可能導(dǎo)致動(dòng)態(tài)平衡紊亂和病理反應(yīng)[14-15]。

本研究通過(guò)構(gòu)建EAMG大鼠模型，磁珠分選Treg細(xì)胞，檢測(cè)它的線粒體功能和線粒體超微結(jié)構(gòu)的變化。生化指標(biāo)顯示EAMG大鼠Treg細(xì)胞有顯著線粒體功能障礙，電鏡下線粒體超微結(jié)構(gòu)的變化也與線粒體功能障礙一致。我們發(fā)現(xiàn)在EAMG大鼠Treg細(xì)胞中ROS大量增加，而線粒體膜電位的超極化狀態(tài)可能會(huì)促進(jìn)這種變化[18]。線粒體功能受損和ROS的大量增加提示Treg細(xì)胞可能存在氧化應(yīng)激，氧化應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA的氧化損傷，最終可導(dǎo)致細(xì)胞死亡。我們前期研究發(fā)現(xiàn)在MG中Treg細(xì)胞凋亡增加[19]，或與此有關(guān)，我們將在后續(xù)進(jìn)一步探索。目前，在系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化、Ⅰ型糖尿病等自身免疫性疾病中Treg細(xì)胞顯示有線粒體功能異常[20-22]，本研究結(jié)果與這些發(fā)現(xiàn)相似，線粒體功能的變化可能是Treg細(xì)胞在自身免疫性疾病中的一個(gè)特征，但線粒體功能變化的原因還有待進(jìn)一步探索。線粒體也可能是一個(gè)極具潛力的治療靶點(diǎn)，抗氧化劑化合物如MitoQ(可清除線粒體活性氧)在一些臨床前研究中獲得了很好的治療效果[23-24]，現(xiàn)它正被用于治療多發(fā)性硬化癥的臨床試驗(yàn)中(NCT03166800)。

綜上，本研究對(duì)EAMG大鼠Treg細(xì)胞線粒體功能做了初步的鑒定，結(jié)果顯示Treg細(xì)胞存在線粒體功能受損，目前以線粒體為靶標(biāo)的藥物分子設(shè)計(jì)及其機(jī)制研究已成為熱門研究領(lǐng)域之一, 因此，充分認(rèn)識(shí)線粒體功能障礙在MG發(fā)生發(fā)展中的作用及其相關(guān)分子機(jī)制，以及以線粒體為靶點(diǎn)展開(kāi)靶向治療可能對(duì)MG發(fā)病機(jī)制及探索其預(yù)防、治療措施具有重要意義。