楊傳慧,何曉雯,徐林通,趙清漣,侯進(jìn)慧,李 勇
(徐州工程學(xué)院食品與生物工程學(xué)院,江蘇徐州 221018)
大蒜(Allium sativum) 是一種淺根性多年生草本植物,在我國栽培面積廣、產(chǎn)量高,是主要的出口農(nóng)產(chǎn)品之一。明朝醫(yī)藥學(xué)家李時(shí)珍在《本草綱目》中詳細(xì)記述到,“大蒜其氣熏烈,能通五臟;達(dá)竅、祛濕、消痛食此其功也”[1]。大蒜營養(yǎng)成分多樣,有多種酶類、氨基酸、酯類和多肽,其中主要有效成分是大蒜素,這種硫化物具有抗氧化、抗腫瘤和抗感染等功效[2-4]。大蒜可以改善人體免疫機(jī)能,促進(jìn)新陳代謝,消除疲勞。長期食用大蒜還有預(yù)防心腦血管疾病、糖尿病和高血壓等老年性疾病的作用,大蒜是一種不可多得的綠色保健食品,有許多保健功效[5-6]。云南大理、山東金鄉(xiāng)和江蘇邳州等地是我國大蒜的主要產(chǎn)區(qū),農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)應(yīng)用于大蒜產(chǎn)業(yè),可以帶動(dòng)大蒜產(chǎn)地經(jīng)濟(jì)發(fā)展,促進(jìn)精準(zhǔn)扶貧和鄉(xiāng)村振興[7]。
納豆是在煮熟的大豆中加入納豆菌,經(jīng)發(fā)酵而成的一種日本傳統(tǒng)食品,是日本發(fā)酵食品的代表之一,對(duì)于人體健康非常有益。有研究顯示,日本人長壽原因和他們經(jīng)常食用納豆等發(fā)酵食品有一定的關(guān)系[8]。納豆激酶是納豆中特有的活性物質(zhì),是一種堿性絲氨酸蛋白酶,具有顯著的溶栓活性,目前關(guān)于發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶及其生理特性研究較多[9-11]。納豆菌是發(fā)酵納豆食品必需的菌種。納豆菌是一類好氧、有芽孢的革蘭氏陽性桿狀細(xì)菌,沒有致病性,分類上屬于芽孢桿菌屬,枯草芽孢桿菌納豆菌亞種[12]。其芽孢呈現(xiàn)橢圓形或柱狀,中生或偏中生,耐熱性強(qiáng)。納豆菌極強(qiáng)的抗逆性使其在胃中失活極少,消化道中的胃酸不會(huì)對(duì)它造成影響,因此納豆菌可以安全到達(dá)小腸,并定植在小腸內(nèi),一方面可以抑制腸道內(nèi)的有害菌生長;另一方面,納豆菌分解腸道中未被完全消化的食物,可以產(chǎn)生納豆激酶(natto kinase) 等營養(yǎng)物。納豆菌產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)很好地平衡了腸道內(nèi)的生理環(huán)境,在一定程度上還能治療腸炎和便秘等問題[13]。由此可見,納豆菌對(duì)人體腸道的益生作用顯著。
大蒜醬作為一種大蒜加工產(chǎn)品,增加納豆作為原料,保留了大蒜和納豆中各自特色的營養(yǎng)成分,有利于人體更好地吸收。利用大蒜和納豆制作納豆大蒜醬,開發(fā)蒜醬制作工藝,對(duì)蒜醬進(jìn)行了檢測,希望為新型大蒜醬產(chǎn)品開發(fā)提供基礎(chǔ)資料。
大蒜,江蘇邳州出產(chǎn)的多頭大蒜;納豆,本實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。
尿激酶、凝血酶、沒食子酸等,上海源葉生物科技有限公司提供;纖維蛋白原,北京博奧拓達(dá)科技有限公司提供;其他分析化學(xué)試劑,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。
(1) 大豆預(yù)處理。選取成熟飽滿、無病蟲害的大豆,反復(fù)沖洗,去除雜質(zhì)。
(2) 泡豆。用干凈自來水浸泡,水面沒過大豆,浸泡18 h 左右(夏季),冬季可適當(dāng)延長至24 h。
(3) 蒸煮。泡發(fā)好的大豆盛至干凈玻璃器皿中,放蒸鍋隔水蒸煮2 h。
(4) 冷卻。蒸煮好的大豆取至室溫冷卻,自然冷卻至40 ℃左右,即手摸器皿有溫?zé)岣小?/p>
(5) 配菌液。將納豆菌粉溶于無菌水,配置成納豆菌水溶液,以大豆和納豆菌粉質(zhì)量比為50∶1適量配置。
(6) 大豆接種。配置好的納豆菌溶液均勻噴灑在冷卻完畢的大豆中,適當(dāng)攪拌,使大豆和納豆菌水溶液充分混勻。
(7) 發(fā)酵。按以上操作步驟完成后,將接種后的大豆放至納豆機(jī)中進(jìn)行發(fā)酵,設(shè)置納豆機(jī)發(fā)酵時(shí)間為18 h。
(8) 納豆。發(fā)酵完成即可得到納豆產(chǎn)品。
1.3.1 主要原料配方
大蒜1 kg,食用油600 g,納豆300 g,辣椒粉40 g,花椒粉20 g,食鹽40 g,白砂糖40 g,雞精20 g,耗油15 g。
1.3.2 工藝流程
大蒜剝皮洗凈→蒜瓣破碎→原輔料預(yù)備→加熱炒制→密封保存。
1.3.3 操作要點(diǎn)
(1) 原料選擇及預(yù)處理。選用無病害新鮮大蒜,剝皮洗凈,碎蒜機(jī)攪碎至蒜末顆粒直徑不超過0.5 cm,取上述蒜末1 kg 備用。發(fā)酵的納豆300 g,備用。
(2) 輔料與配比。稱取食鹽40 g,白砂糖40 g,辣椒粉40 g,花椒粉20 g,雞精20 g,蠔油15 g 等輔料,備用。
(3) 炒制。鍋中倒入600 g 食用油,160 ℃加熱30 s,取辣椒粉40 g 和花椒粉20 g 放入鍋中,爆香10 s;取半份蒜末(500 g) 放鍋中不斷翻炒,160 ℃翻炒2 min,隨后加入剩下半份蒜末(500 g),混合翻炒30 s 后,依次加入預(yù)先備好的食鹽、雞精、白砂糖160 ℃翻炒90 s,最后加入蠔油15 g 完成炒制;加入納豆300 g 混合炒制好的大蒜醬攪拌均勻即可得納豆大蒜醬。
(4) 保存。納豆大蒜醬炒制完成,無菌條件下自然冷卻,待納豆大蒜醬溫度降至50 ℃左右,用食品級(jí)玻璃瓶密封保存。
1.4.1 水分的檢測
參考GB/T 5009.3—2003 進(jìn)行大蒜醬中水分的測定[14]。用分析天平精確稱取納豆大蒜醬樣品5~10 g放入已知質(zhì)量的平板中,稱質(zhì)量記錄后,放入到70 ℃的烘箱中烘干。每隔4 h 取出稱質(zhì)量記錄質(zhì)量數(shù)據(jù),如此反復(fù)操作,直至前后2 次稱量誤差不超過±0.005 0 g 時(shí)即為恒質(zhì)量。做3 組平行試驗(yàn),取其平均值。
計(jì)算式如下:
式中:X——樣品水分含量,%;
M——干燥前樣品質(zhì)量,g;
m——干燥后樣品質(zhì)量,g。
1.4.2 食鹽的檢測
參考GB 5009.42—2016 對(duì)大蒜醬的食鹽含量進(jìn)行測定[15]。準(zhǔn)確稱取納豆大蒜醬樣品10 g 左右,精確至0.001 g,于研缽中磨碎,轉(zhuǎn)移至250 mL 錐形瓶中并加入80 mL 蒸餾水,在水浴鍋中90 ℃加熱20 min 取出冷卻至室溫。用脫脂棉過濾后,收集濾液在100 mL 容量瓶定容至刻度,制成大蒜醬待測液。移取100 mL 大蒜醬待測液于250 mL 錐形瓶中,加入0.2 mL 鉻酸鉀指示劑,用濃度為0.1 mol/L 的AgNO3標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定,在溶液出現(xiàn)磚紅色時(shí)停止滴定,記錄此時(shí)消耗的AgNO3標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積V。試驗(yàn)平行做3 次,取其平均值。相同條件下做一空白對(duì)照組,記錄消耗的AgNO3標(biāo)準(zhǔn)溶液體積V0。
計(jì)算式如下:
式中:X——樣品中NaCl 百分含量,%;
V——樣品耗用AgNO3的體積,mL;
V0——空白對(duì)照組耗用AgNO3的體積,mL;
C——使用的AgNO3標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度,mol/L;
58.5——與1.00 mol AgNO3相當(dāng)?shù)腘aCl 的質(zhì)量,g;
L——稀釋倍數(shù);
m——試驗(yàn)用樣品質(zhì)量,g;
1 000——單位換算系數(shù)。
1.4.3 總酸的檢測
參考GB/T 12456—2008 進(jìn)行大蒜醬總酸含量的測定[16]。準(zhǔn)確稱取納豆大蒜醬樣品10 g 左右,精確至0.001 g,于研缽中研磨碎,轉(zhuǎn)移至250 mL 錐形瓶中加入80 mL 蒸餾水,在水浴鍋中90 ℃加熱20 min取出冷卻至室溫。脫脂棉過濾后,收集濾液在100 mL容量瓶定容至刻度,制成大蒜醬待測液。移取100 mL大蒜醬待測液于250 mL 錐形瓶中,加入0.5 mL 1%酚酞指示劑,用0.100 0 mol/L NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液(如樣品酸度較低,可用0.01 mol/L 或0.05 mol/L 氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液) 進(jìn)行滴定,緩慢滴定至微紅色30 s不褪色。記錄消耗的NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液體積(V)。試驗(yàn)平行做3 次,取其平均值。相同條件下做一空白對(duì)照組,記錄消耗的NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液體積(V0)。
計(jì)算公式如下:
式中:X——樣品中總酸的百分含量(以乳酸計(jì)),%;
V——樣品消耗NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液體積,mL;
V0——空白組消耗NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液體積,mL;
C——滴定用NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度,mol/L;
90——與1 mol NaOH 相當(dāng)?shù)娜樗岬馁|(zhì)量,g;
L——稀釋倍數(shù);
m——試驗(yàn)用樣品質(zhì)量,g;
1 000——單位換算系數(shù)。
1.4.4 總糖的檢測
(1) 制備樣品待測液。準(zhǔn)確稱取納豆大蒜醬樣品10 g 左右,精確至0.001 g,于研缽中磨碎,轉(zhuǎn)移至250 mL 錐形瓶中加入80 mL 蒸餾水,在水浴鍋中90 ℃加熱20 min 取出冷卻至室溫。脫脂棉或?yàn)V紙過濾后,收集濾液在100 mL 容量瓶定容至刻度,制成大蒜醬待測液。
(2) 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。取6 支干凈的10 mL刻度試管,按表1 的反應(yīng)體系進(jìn)行操作,滴加試劑結(jié)束后用蒸餾水定容至刻度。用1 號(hào)試管作為參比進(jìn)行調(diào)零,分別測定2~6 號(hào)管490 nm 的吸光度。繪制的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的橫坐標(biāo)是測試樣試管中葡萄糖樣品液質(zhì)量濃度(μg/mL),吸光度為縱坐標(biāo)。
總糖檢測反應(yīng)體系見表1。
表1 總糖檢測反應(yīng)體系
(3) 樣品總糖含量測定。10 mL 刻度試管中加入樣品待測液0.5 mL,加入1 mL 80%苯酚溶液和5 mL硫酸,加水定容至刻度。按照葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液制作的條件測定吸光度。
計(jì)算式如下:
式中:X——樣品中總糖百分含量,%;
V——測樣液體積,10 mL;
L——稀釋倍數(shù),200;
0.9——扣除水解時(shí)消耗的水量;
k——標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率;
m——所取樣品質(zhì)量,g;
1 000 000——單位換算系數(shù)。
1.4.5 多酚的檢測
參考GB/T 8313—2008 對(duì)大蒜醬多酚含量進(jìn)行測定[17]。
(1) 樣品處理。準(zhǔn)確稱取3.0 g(精確到0.001 g)納豆大蒜醬樣品于研缽中研磨均勻轉(zhuǎn)移至250 mL 燒杯中,加入70 mL 水浴鍋中預(yù)熱的70%甲醇溶液,用玻璃棒充分?jǐn)嚢?,并立即移?0 ℃水浴中浸提10 min。浸提結(jié)束冷卻至室溫,將其轉(zhuǎn)移至50 mL 離心管中,以轉(zhuǎn)速3 500 r/min 離心10 min。取上清液轉(zhuǎn)移至100 mL 容量瓶,70%甲醇溶液定容至100 mL 制備成待測液。
(2) 制作沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。取10 mL 刻度試管,按表2 加入試劑后用蒸餾水定容至刻度,充分振蕩混勻。25 ℃下靜置60 min。
多酚檢測反應(yīng)體系見表2。
表2 多酚檢測反應(yīng)體系
用分光光度計(jì)測定7 支試管樣液于波長760 nm條件下的吸光度。通過繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線來推算樣品中總酚的含量。
計(jì)算公式如下:
式中:X——樣品中總酚的含量,%;
A——樣品測試液吸光度;
V——樣品提取液體積,100 mL;
L——稀釋倍數(shù);
k——沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率;
m——樣品質(zhì)量,g;
m1——樣品干物質(zhì)含量,g。
1 000 000——單位換算系數(shù)。
1.4.6 納豆激酶活性的檢測
(1) 試驗(yàn)試劑及配制方法。①0.01 mol/L 磷酸緩沖液(PBS)。取十二水合磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O) 3.58 g,加水溶解并定容至1 000 mL 為A液;取二水合磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O) 0.78 g,加水溶解并定容至500 mL 為B 液;將A、B 兩液混合,調(diào)節(jié)溶液pH 值為7.8。②0.9%生理鹽水。稱取9 g NaCl 加蒸餾水定容至1 000 mL。③工作液。磷酸緩沖液與生理鹽水體積比1∶17 混合。④2%的瓊脂糖溶液。天平稱取瓊脂糖2.0 g,加工作溶液100 mL攪拌均勻使瓊脂糖充分混勻,置微波爐加熱1 min 呈透明溶液。⑤纖維蛋白原溶液。分析天平精確稱取纖維蛋白原,加入工作液配成質(zhì)量濃度1.5 mg/mL 的纖維蛋白溶液。配制溶液時(shí)稱取完時(shí)要快速加工作液攪拌溶解,否則會(huì)產(chǎn)生白色絮狀物沉淀。⑥凝血酶溶液。稱取凝血酶,加0.9%氯化鈉溶液制成2 000 U/mL 的凝血酶溶液。
(2) 瓊脂糖-纖維蛋白平板的制作。取配置好的纖維蛋白原溶液39 mL 置于燒杯55 ℃水浴鍋中,邊攪拌邊加入55 ℃瓊脂糖溶液39 mL、凝血酶溶液3.0 mL,三者于55 ℃條件下混合均勻,再倒入直徑10 cm 干凈的平板中,室溫條件下靜置45~60 min。平板現(xiàn)用現(xiàn)配,為防止污染[18]。待平板凝固,對(duì)平板打孔,以每個(gè)平板3 個(gè)孔為宜,打孔直徑約2 mm。
(3) 尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。取5 萬U/g 的尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品,用0.01 mol/L 的PBS(pH 值7.8) 將尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品配制為20,40,60,80,100 U/mL 5 個(gè)濃度梯度,移液槍分別取10 μL 注入平板孔內(nèi),37 ℃孵育18 h,用游標(biāo)卡尺測量透明圈的垂直直徑,計(jì)算乘積,根據(jù)Asrtup Tage 等人[18]的報(bào)道,透明圈2 個(gè)直徑乘積(A) 與尿激酶濃度(C) 存在LgA=a+bLgC的關(guān)系。以尿激酶濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo),透明圈垂直直徑乘積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
(4) 樣品納豆激酶活性測定。取適量納豆大蒜醬樣品于研缽中磨碎,并按質(zhì)量體積比1∶10 混于0.9%生理鹽水中,搖晃均勻,置于冰箱中于4 ℃下靜置4 h 使納豆激酶被充分浸提至生理鹽水中。待測樣品以轉(zhuǎn)速5 000 r/min 離心10 min 后取上清液,得納豆激酶提取供試液。移液槍取10 uL 樣品供試液注入平板孔內(nèi),37 ℃下孵育18 h,用游標(biāo)卡尺測量樣品透明圈的垂直直徑,計(jì)算乘積。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出納豆激酶提取液相當(dāng)于尿激酶標(biāo)準(zhǔn)液濃度,并代入公式測得納豆大蒜醬中納豆激酶酶活。
計(jì)算公式如下:
式中:C——納豆激酶提取液相當(dāng)于尿激酶標(biāo)準(zhǔn)液濃度;
V——納豆激酶提取液體積,mL;
m——稱取的樣品質(zhì)量,g。
參考GB 4789.3—2016 利用結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA) 平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基進(jìn)行大腸菌群數(shù)的測定;參考GB 4789.15—2016 利用孟加拉紅瓊脂平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基進(jìn)行霉菌和酵母菌落的測定。
大蒜醬水分含量測定做3 組平行試驗(yàn)。
水分測定見表3。
由表3 可知,納豆大蒜醬水分含量為37.64%。
大蒜醬食鹽含量測定做3 組平行試驗(yàn)。
食鹽測定見表4。
表4 食鹽測定
由表4 可知,納豆大蒜醬食鹽含量為5.97%。
大蒜醬總酸含量測定做3 組平行試驗(yàn).
總酸測定見表5。
表5 總酸測定
由表5 可知,納豆大蒜醬總酸含量為1.64%。
以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),以波長470 nm 下吸光度為縱坐標(biāo),繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線[19]。同時(shí),利用分光光度計(jì)測定同一參比溶液下的樣品液吸光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線代入公式求得樣品總糖含量。
葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。
圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線
由圖6 得,標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程:Y=0.030 2X-0.006 8,R2=0.998。
稱取大蒜醬樣品2.99 g,配制多糖提取液100 mL,吸取提取液0.5 mL 測定吸光度,測定樣品液吸光度A=2.062,根據(jù)計(jì)算公式計(jì)算出總糖含量為4.11%。
以沒食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),以波長760 nm下吸光度值為縱坐標(biāo),繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時(shí),利用分光光度計(jì)測定同一參比溶液下的樣品液吸光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線代入公式求得樣品多酚含量。
沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。
圖2 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線
由圖2 可得,標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=0.058X+0.011 8,R2=0.996 2。
試驗(yàn)中,稱取大蒜醬樣品2.99 g,配制多酚提取液100 mL,吸取樣品0.8 mL 待測,測定樣品液吸光度A=0.502,根據(jù)計(jì)算公式計(jì)算出多酚含量為0.58%。
納豆大蒜醬的納豆激酶提取液在瓊脂糖-纖維蛋白平板上產(chǎn)生的透明圈。結(jié)果顯示,納豆激酶活性明顯。
納豆激酶提取液產(chǎn)生的透明圈見圖3。
圖3 納豆激酶提取液產(chǎn)生的透明圈
以尿激酶標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo),水解圈垂直直徑乘積的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo),繪制尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=0.327X+1.822 5,R2=0.992 4。
尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖4。
圖4 尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線
樣品提取液溶圈直徑乘積對(duì)數(shù)代入回歸方程去對(duì)數(shù)后得相當(dāng)于尿激酶濃度為54.83 U/mL。納豆大蒜醬樣品3.120 6 g,制得30mL 納豆激酶提取液。代入公式求得,納豆大蒜醬中納豆激酶酶活為527.11 U/g(相當(dāng)于尿激酶活力單位)。
VRBA 培養(yǎng)基計(jì)數(shù)平板(10-5) 見圖5,孟加拉紅培養(yǎng)基計(jì)數(shù)平板(10-5) 見圖6。
圖5 VRBA 培養(yǎng)基計(jì)數(shù)平板(10-5)
圖6 孟加拉紅培養(yǎng)基計(jì)數(shù)平板(10-5)
VRBA 培養(yǎng)基計(jì)數(shù)平板顯示(圖5),平板中沒有大腸桿菌菌落出現(xiàn),大蒜醬中不含大腸桿菌。孟加拉紅培養(yǎng)基計(jì)數(shù)平板顯示(圖6),平板中沒有霉菌或酵母菌菌落出現(xiàn),大蒜醬中不含霉菌及酵母。試驗(yàn)結(jié)果顯示,大腸桿菌、霉菌等有害菌在培養(yǎng)基上沒有菌落存在,說明經(jīng)過炒制的納豆大蒜醬將絕大部分的致病菌殺死,并且高油脂和鹽分造就的高滲透壓環(huán)境也在一定程度上抑制菌的生長,通過嚴(yán)格的密封保存杜絕了再次染菌的可能。
納豆大蒜醬樣品及產(chǎn)品包裝見圖7,納豆大蒜醬感官指標(biāo)見表6。
圖7 納豆大蒜醬
表6 納豆大蒜醬感官標(biāo)準(zhǔn)
大蒜和納豆都有著各自不同的生理活性物質(zhì),將2 個(gè)進(jìn)行融合開發(fā)新型大蒜醬,可以發(fā)揮出兩者的各自優(yōu)勢。研究對(duì)納豆大蒜醬進(jìn)行了分析,根據(jù)感官鑒評(píng)試驗(yàn),以100 g 大蒜為基準(zhǔn),食鹽用量4 g,白砂糖用量4 g,辣椒用量4 g,食用油用量60 g 炒制大蒜醬。優(yōu)化的加工工藝為炒制溫度160 ℃,炒制時(shí)間5 min。對(duì)納豆大蒜醬進(jìn)行理化性質(zhì)的測定,水分含量為37.64%,多糖含量為4.11%,總酸含量(乳酸計(jì)) 為1.64%,食鹽含量為5.97%,多酚含量為0.58%,測得納豆大蒜醬中納豆激酶活性為527.11 U/g。微生物測定結(jié)果符合國標(biāo)安全標(biāo)準(zhǔn)。