朱丹實，張越怡，付 浩，于 懿，曹雪慧，勵建榮

（渤海大學食品科學與工程學院 生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯(lián)合工程研究中心遼寧省食品安全重點實驗室 遼寧 錦州 121013）

蘋果濁汁營養(yǎng)豐富，深受消費者喜愛，然而其在加工和貯藏過程中不穩(wěn)定，易產(chǎn)生沉淀[1]。蘋果濁汁在貯藏期內(nèi)沉淀的重要原因之一是云狀顆粒中酚類化合物與富含脯氨酸的蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用[2]。蘋果汁中的酚類化合物主要包括酸性酚（綠原酸、咖啡酸等）和中性酚（表兒茶素、蘆丁、根皮素等）[3-4]。多酚具有較強的親水能力，可與蘋果濁汁中的活性蛋白通過疏水相互作用與氫鍵締合[5]。不同品種蘋果濁汁中酚類化合物的種類和含量有一定差別，然而，與果汁穩(wěn)定性相關的酚類化合物的種類尚不明確。

蘋果濁汁沉積物中的蛋白質(zhì)含量約為11.5%～29%，其中脯氨酸含量約為5%～16%[6]。對蘋果汁中蛋白質(zhì)進行電泳分析，與渾濁度相關的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量分別為28，15，12 ku[7]。麥醇溶蛋白的分子質(zhì)量為25～100 ku，與蘋果濁汁中的活性蛋白的分子質(zhì)量接近，且麥醇溶蛋白為小分子單肽鏈蛋白，其脯氨酸容易與酚類相互作用導致渾濁[8]，因此麥醇溶蛋白可作為蘋果濁汁中與酚類化合物互作的模式蛋白。蘋果汁在加工過程中發(fā)生的重要溫度變化主要為室溫（298 K）、酶解溫度（318 K）和巴氏殺菌溫度（358 K），這些溫度條件是影響蘋果汁穩(wěn)定性的重要環(huán)境條件。

本文采用高效液相色譜（HPLC）分析6 個典型品種蘋果濁汁中的酚類物質(zhì)，探究蘋果濁汁的特征酚類化合物，并與麥醇溶蛋白建立模擬體系，研究蘋果濁汁加工過程中溫度對多酚-蛋白互作的影響，為工業(yè)化生產(chǎn)過程中提高其穩(wěn)定性提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料：試驗所選取的“國光”、“喬納金”、“蛇果”、“金冠”、“王林”和“寒富”蘋果，產(chǎn)自遼寧錦州，于2020年10月收獲，挑選成熟度相同，大小一致，無病蟲害、無腐敗的新鮮果實作為試驗材料。

試劑：綠原酸、表兒茶素、沒食子酸、單寧酸、根皮素、蘆丁、甲醇、乙腈、乙酸乙酯、甲酸均為色譜純級（≥98%），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、無水乙醇、磷酸均為國產(chǎn)分析純級試劑。

1.2 儀器與設備

SRQ-7315 多功能料理機，佛山市艾尼詩登電器有限公司；Agilent-1260 液相色譜儀、Zorbax Eclipse Plus C18 色譜柱，美國安捷倫科技公司；RE-2000B 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，成都康寧儀器有限公司；TS-200DC 恒溫振蕩箱，上海天呈實驗儀器制造有限公司；F-7000 熒光分光光度計，日本日立；FDA10N-50 冷凍干燥器，上海皓莊儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 蘋果濁汁酚類物質(zhì)的提取 蘋果經(jīng)清洗、去核、切分、打漿后用300 目濾布過濾后得到蘋果濁汁。取50 mL 不同品種的蘋果濁汁分別加入25 mL 的乙酸乙酯。樣品在室溫下振蕩10 min 后用分離漏斗分離。重復上述操作，共萃取3 次后混合。-18 ℃冷凍2 h 后用脫脂棉過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)5～10 min 后用甲醇溶解蒸發(fā)物并定容到10 mL 容量瓶中。樣品和多酚標準品經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾至樣品瓶中，保存于4 ℃冰箱中，備用[9]。

1.3.2 酚類物質(zhì)的定性和定量分析 采用高效液相色譜法對蘋果濁汁中的酚類物質(zhì)進行定性和定量分析，分析方法參考Rajauria[10]與Robu 等[11]研究，并優(yōu)化同時分析多種酚類化合物的色譜條件。流動相分別為超純水（A）、乙腈（B）、甲醇（C）和2%甲酸水溶液 （D）。梯度洗脫條件如下：0～30 min：5%B 和95%D，30～45 min：25%B 和75%D，45～50 min：40%B 和60%D，50～51 min：40%B 和60%D，51～60 min：5%B 和95%D，60～65 min：5%B和95%D。設置儀器柱溫：25 ℃，流速：0.6 mL/min，檢測波長：280 nm。

1.3.3 特征酚類化合物與麥醇溶蛋白互作的研究 麥醇溶蛋白與特征酚類化合物（表兒茶素、綠原酸和沒食子酸）在pH 值為3.8（蘋果汁pH=3.8）的磷酸鹽緩沖液中完全溶解。在室溫下，取蛋白溶液（10 μmol/L）與0，2.5，5，10，20，40，60，80 μmol/L 的酚類化合物按體積比1∶1 混合。將蛋白質(zhì)-多酚復合物在不同溫度下 （室溫298 K，酶解溫度318 K，巴氏殺菌溫度358 K）進行相互作用，以研究不同工藝溫度對蛋白質(zhì)與酚類化合物相互作用的影響。

1.3.4 熒光光譜分析 熒光光譜分析參考Kosinska 等[12]的研究方法。利用日立F-7000 熒光光譜儀進行測定，測定條件如下：激發(fā)波長λex=280 nm，發(fā)射光譜波長λem 范圍290～450 nm，激發(fā)狹縫為5.0 nm，發(fā)射狹縫為2.5 nm。

1.3.5 熒光猝滅類型分析 采用Stern-Volme 方程[13]探討特征酚類對麥醇溶蛋白的熒光猝滅類型。

式中，F(xiàn)0和F 分別為——添加淬滅劑前、后的熒光強度；Kq——雙分子猝滅常數(shù)，動態(tài)擴散的Kq最大值為2.0×1010L·mol-1·s-1[14]；[P]——淬滅劑（酚類物質(zhì)） 的濃度，mol/L；τ0——無熒光猝滅劑狀態(tài)下熒光壽命，平均熒光壽命一般為10-8s[15]；KSV——Stern-Volme 方程猝滅常數(shù)，L/mol，通過F0/F 對[P]的曲線斜率計算獲得。

1.3.6 結合常數(shù)和結合位點數(shù)分析 酚類化合物與蛋白的結合常數(shù)（K）和結合位點數(shù)（n）計算公式如下[16]：

式中，F(xiàn)0和F——淬滅劑加入前、后的熒光強度；[P]——淬滅劑 （酚類物質(zhì)） 的濃度，mol/L；n——可用結合位點的數(shù)量；Ka（表觀結合常數(shù)）——通過lg[（F0-F）/F]得到的截距，L/mol。

1.3.7 熱力學分析 在不同反應溫度下，酚類化合物與蛋白的分子間作用力通過Van't Hoff 方程推測，計算公式如下：

式中，R——理想氣體常數(shù)，R=8.314 J·mol-1·K-1；T——反應溫度，K[17]；Ka——特定溫度下的結合常數(shù)；ΔG——吉布斯自由能，kJ/mol；以lnKa對1/T 作圖由直線的斜率和截距分別得到ΔH 和ΔS；ΔH——焓變，kJ/mol；ΔS——熵變，J·mol-1·K-1。

1.3.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 液相色譜圖由液相色譜儀Agilent 1260 離線軟件進行分析。利用SPSS 22.0進行方差分析和顯著性檢驗（P＜0.05），采用Origin 2017 軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 蘋果濁汁中特征酚類化合物的分析

利用高效液相色譜法對6 種成熟蘋果 （“國光”、“喬納金”、“蛇果”、“金冠”、“王林”和“寒富”）濁汁中酚類化合物進行分析。綠原酸等標準品出峰時間如圖1a 所示，制備標準曲線對酚類物質(zhì)進行定量分析。以“寒富”果汁作為典型，其濁汁中酚類化合物色譜圖如圖1b 所示。液相分析結果表明，所有6 種蘋果汁中3 種酚類化合物（綠原酸、表兒茶素、沒食子酸）相對較高，可作為蘋果濁汁中的特征酚類物質(zhì)進行后續(xù)研究。綠原酸標準曲線為：Y=4471.5X-1419.9，R2=0.9934；表兒茶素標準曲線為：Y=1130.5X-34.539，R2=0.9995；沒食子酸標準曲線為：Y=38.403X+1.7487，R2=0.9716。對不同混濁蘋果汁中3 種酚類化合物的定量分析表明（圖1c），“國光”蘋果濁汁中綠原酸含量為1.74 mg/L，“國光”蘋果濁汁中表兒茶素含量最高，其次是“蛇果”蘋果濁汁。沒食子酸在“金冠”蘋果濁汁中含量最高，達到0.99 mg/L，“寒富”蘋果濁汁中沒食子酸含量最少，僅有0.14 mg/L。

圖1 利用高效液相色譜法分析6 種蘋果濁汁中的酚類化合物Fig.1 Analysis of the phenolic compounds in six kinds of cloudy apple juice using HPLC

2.2 溫度對酚類化合物與麥醇溶蛋白熒光猝滅作用的影響

蛋白質(zhì)分子中含有發(fā)熒光的色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe）等生色氨基酸殘基[18]。酚類化合物加入到麥醇溶蛋白溶液形成復合物后，蛋白內(nèi)源性熒光強度降低的現(xiàn)象稱作熒光猝滅[19]。將不同溫度、不同濃度的3 種酚類化合物與麥醇溶蛋白形成的復合物進行熒光光譜分析，結果如圖2所示。麥醇溶蛋白具有內(nèi)源性熒光，在λex=280 nm 條件下，麥醇溶蛋白在波長320～360 nm 范圍內(nèi)熒光強度最強，其中Trp 殘基貢獻最大。不同溫度下，隨著酚類化合物濃度的增加，熒光強度逐漸降低，發(fā)生熒光猝滅現(xiàn)象，對應于該峰的波長顯著藍移或紅移，且溫度越高對蛋白質(zhì)散發(fā)熒光的影響越大。綠原酸-麥醇溶蛋白復合物在波長340 nm 處的熒光強度隨多酚濃度的增加而降低，并伴隨著紅移現(xiàn)象，說明綠原酸-麥醇溶蛋白復合物的結構較為松散，色氨酸殘基暴露在水中，復合物的疏水性增強。表兒茶素-麥醇溶蛋白復合物與沒食子酸-麥醇溶蛋白復合物分別在波長320 nm 和340 nm 處有最大熒光強度，且都伴隨著多酚濃度的升高而降低，并發(fā)生藍移現(xiàn)象，此時，麥醇溶蛋白分子聚集，疏水性減弱。

圖2 不同溫度下酚類化合物與麥醇溶蛋白互作的熒光光譜圖Fig.2 Fluorescence spectra of interactions of phenolic compounds with gliadin at different temperatures

2.3 酚類化合物對麥醇溶蛋白的熒光猝滅類型

熒光猝滅機制主要包括靜態(tài)猝滅、動態(tài)猝滅以及靜態(tài)猝滅和動態(tài)猝滅兩者共存[20]。圖3為3種酚類化合物與蛋白在298，318，358 K 3 個溫度下反應的Stern-Volmer 曲線。結果表明，表兒茶素-麥醇溶蛋白、綠原酸-麥醇溶蛋白、沒食子酸-麥醇溶蛋白復合物的擬合曲線都呈現(xiàn)出良好的線性關系。根據(jù)各條曲線的斜率計算求得相應溫度下的Ksv、Kq值（見表1）。隨著溫度的升高，多酚-蛋白復合物的穩(wěn)定性下降，表兒茶素、綠原酸、沒食子酸對蛋白Kq值降低，且Kq值遠大于擴散碰撞淬滅常數(shù)，表明熒光猝滅機制為靜態(tài)猝滅類型。在相同溫度下，Ksv數(shù)值分析表明，酚類化合物與麥醇溶蛋白結合能力強弱的順序為：表兒茶素-麥醇溶蛋白＞綠原酸-麥醇溶蛋白＞沒食子酸-麥醇溶蛋白。

圖3 不同溫度下酚類化合物與麥醇溶蛋白互作的Stern-Volmer 曲線Fig.3 Stern-Volmer curves on the interaction of phenolic compounds with gliadin at different temperatures

表1 不同溫度下酚類化合物與麥醇溶蛋白互作的猝滅參數(shù)Table 1 Quenching parameters of the reaction between three polyphenols with gliadin at three temperatures

2.4 酚類化合物與麥醇溶蛋白結合常數(shù)和結合位點數(shù)分析

熒光猝滅是確定酚類與蛋白質(zhì)相互作用的結合位點和結合常數(shù)的一種合適而簡單的方法[21]。3種酚類化合物-蛋白質(zhì)復合物在不同溫度下的結合常數(shù)約等于1（表2），說明在多酚濃度在0～80 μmol/L 范圍內(nèi)，表兒茶素、綠原酸和沒食子酸至少與麥醇溶蛋白有1 個結合位點。隨著溫度的升高，多酚與蛋白質(zhì)的結合常數(shù)發(fā)生了不同程度的降低，表明猝滅機制為靜態(tài)猝滅，且結合常數(shù)都較大，特征酚類化合物與蛋白質(zhì)之間的結合能力較強。Ka的大小在一定程度上反應了復合物穩(wěn)定性的大小，因此隨溫度升高3 種酚類化合物與麥醇溶蛋白的結合穩(wěn)定性均呈下降趨勢。同一溫度條件下，3 種特征酚類化合物與麥醇溶蛋白結合穩(wěn)定性大小為：綠原酸-麥醇溶蛋白＞沒食子酸-麥醇溶蛋白＞表兒茶素-麥醇溶蛋白。

表2 不同溫度下3 種酚類化合物與麥醇溶蛋白反映的結合位點數(shù)（n）與結合常數(shù)（Ka）Table 2 Number of binding sites （n） and binding constants （Ka） reflected by three polyphenols with gliadin at three temperatures

2.5 酚類化合物與麥醇溶蛋白相互作用的熱力學分析

在多酚與麥醇溶蛋白結合的相互作用過程中，通常存在氫鍵、疏水相互作用、范德華力和離子鍵等非共價結合作用[22]。這會引起焓變（ΔH）、熵變（ΔS）、吉布斯自由能（ΔG）的改變，當ΔG＜0時，則反應能夠自發(fā)進行，也可以通過ΔH 和ΔS來判斷反應是否可以自發(fā)進行。表3為不同溫度下的ΔH、ΔS、ΔG 值，可以推測特征酚類化合物與麥醇溶蛋白的相互類型。由表3可知，ΔH 和ΔG都小于0，說明反應是能夠自發(fā)進行的放熱反應。表4為基于熱力學分析的ΔH、ΔS 與分子間相互作用力的關系，表兒茶素、綠原酸和沒食子酸-麥醇溶蛋白復合物中ΔH＜0，ΔS＞0，說明蘋果濁汁中的3 種特征酚類化合物與麥醇溶蛋白之間由氫鍵相連接，并發(fā)生了疏水相互作用。酚類化合物分子結構不同，導致ΔG 的數(shù)值不同，其絕對值越小，說明反應越容易進行，形成的復合物越穩(wěn)定。ΔG 的結果也表明，隨著反應溫度升高，結合物的穩(wěn)定性逐漸減弱。

表3 不同酚類化合物與麥醇溶蛋白結合熱力學參數(shù)Table 3 Thermodynamic parameters of the combination of three polyphenols and gliadin

表4 基于熱力學分析的分子間相互作用力[23]Table 4 Relationship between ΔH and ΔS and intermolecular interaction forces[23]

3 結論

通過高效液相色譜對6 種蘋果濁汁中酚類化合物進行分析，得到蘋果濁汁中特征酚類化合物為綠原酸、表兒茶素和沒食子酸。3 種酚類化合物對麥醇溶蛋白有較強的熒光猝滅作用，猝滅方式為靜態(tài)猝滅。猝滅常數(shù)結果表明，特征酚類化合物與麥醇溶蛋白結合能力強弱的順序為：表兒茶素-麥醇溶蛋白＞綠原酸-麥醇溶蛋白＞沒食子酸-麥醇溶蛋白。特征酚類化合物與麥醇溶蛋白結合穩(wěn)定性大小為：綠原酸-麥醇溶蛋白＞沒食子酸-麥醇溶蛋白＞表兒茶素-麥醇溶蛋白。蘋果濁汁中的3 種特征酚類化合物與麥醇溶蛋白之間由氫鍵相連接，并發(fā)生了疏水相互作用。隨著溫度升高，蘋果濁汁中特征酚類化合物與麥醇溶蛋白的結合穩(wěn)定性呈下降趨勢。