劉慧娟,謝 姣
(貴州醫(yī)科大學(xué) 環(huán)境污染與疾病監(jiān)控教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 公共衛(wèi)生與健康學(xué)院 貴陽 550025)
血橙(Citrus sinensis L. Osbeck) 屬于甜橙類,塔羅科血橙為其常見的血橙品種之一,其果肉呈紅色血絲或血斑狀,具有特有的玫瑰香氣[1-3]。近年來,血橙因富含花青素、類胡蘿卜素、抗壞血酸、多酚等天然活性物質(zhì),且肉質(zhì)細(xì)軟、化渣性好而備受消費(fèi)者青睞[4-6]。脂溶性類胡蘿卜素和水溶性花青素是柑橘類水果中2 種主要的紅色色素[3,7-8]。其中,類胡蘿卜素屬于萜類化合物[9],鑲嵌于葉綠體和有色體內(nèi),其種類繁多,且每年會(huì)有新的類胡蘿卜素被發(fā)現(xiàn)[10-11]。類胡蘿卜素的合成受復(fù)雜因素的影響,如溫、濕度等外界條件[12-13]。類胡蘿卜素的穩(wěn)定性差,在光、熱、酸等外界條件作用下可發(fā)生氧化、異構(gòu)等[14],如臍橙果皮和果肉中的類胡蘿卜素含量受貯藏溫度的影響,且存在明顯的組織特異性[15]。目前人體無法合成類胡蘿卜素,只能依靠飲食攝入,其具有抗氧化、降血脂、抗腫瘤、抗慢病、增強(qiáng)免疫力等多方面潛在功效[16-17]。近年來,類胡蘿卜素的多樣性組成引起人們的廣泛關(guān)注。
血橙果肉的著色屬于低溫依賴型[18-20],目前鮮有關(guān)于長時(shí)低溫貯藏對血橙不同部位果肉中類胡蘿卜素酯變化的研究。鑒于此,本研究以不同低溫貯藏期血橙不同部位的果肉為研究對象,采用常用代謝物檢測方法UPLC-API-Q TRAP-MS/MS(超高效液相色譜-大氣壓化學(xué)離子源-三重四極桿-線性離子阱質(zhì)譜,簡稱超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法),系統(tǒng)分析血橙中類胡蘿卜素酯的種類和含量變化,為解析低溫貯藏血橙果肉中類胡蘿卜素酯的多樣性組成及其變化提供試驗(yàn)參考。
塔羅科血橙 (Citrus sinensis L.Osbeck),重慶江津錦橙實(shí)業(yè)有限公司。選擇45 個(gè)無病蟲害的健康果實(shí)作為樣品(生物學(xué)重復(fù)3 次),分別貯藏0,30,60,90 d(貯藏溫度9 ℃,相對濕度85%),去皮處理后分別沿著果實(shí)橫切面赤道左右8 mm 切分,即得到果蒂、赤道和果頂處果肉,立即于-80℃保存,備用。
甲醇、乙腈、乙醇、甲基叔丁基醚均為色譜純級,德國Merck 公司;化合物標(biāo)準(zhǔn)品(色譜純級),美國Sigma-Aldrich 和捷克共和國Olchemim 公司。
FD-1A-80 冷凍干燥機(jī),江蘇恒敏儀器制造有限公司;MM400 Retsch 研磨儀,德國萊馳公司;ExionLCTMAD 超高校液相色譜儀(UPLC)和Applied Biosystems 6500 Quadrupole Trap 串聯(lián)質(zhì)譜儀(MS/MS),美國ABSCIEX 公司。
1.3.1 UPLC-API-MS/MS 樣品前處理 參考Geyer 等[21-23]的方法并加以修改。將血橙凍干樣品用研磨儀在30 Hz 條件下研磨1 min 至粉末。取50 mg 粉末樣品,分別加入800 μL 正己烷∶丙酮∶乙醇混合提取液(體積比1∶2∶2)和200 μL 蒸餾水,取混合溶液500 μL (含0.01%二叔丁基對甲酚,g/mL)渦旋提取20 min 后12 000 r/min 條件下離心5 min,取上清液。重復(fù)提取4 次后合并上清液,濃縮至干。濃縮后的樣品用100 μL 甲醇∶甲基叔丁基醚混合復(fù)溶溶液 (體積比1∶1) 進(jìn)行復(fù)溶后,再加入同體積復(fù)溶液的蒸餾水,振蕩混勻后于4 ℃,12 000 r/min 條件下離心5 min。將上清液樣品過0.22 μm 濾膜后,保存于棕色進(jìn)樣瓶中,以待LC-MS/MS 分析。
1.3.2 UPLC-API-MS/MS 條件
1.3.2.1 UPLC 條件 參考Geyer 等[21-23]的方法并加以修改。YMC C30 色譜柱 (2 mm×100 mm×3 μm);流速0.8 mL/min;柱溫28 ℃;進(jìn)樣量2 μL。以甲醇∶乙腈(體積比3∶1)且加入0.01%BHT 和0.1%甲酸的混合液為流動(dòng)相A,以甲基叔丁基醚(含0.01%BHT)為流動(dòng)相B,以甲醇為洗針液。利用梯度洗脫進(jìn)行UPLC 分析,程序見表1。
表1 液相色譜梯度洗脫條件Table 1 Liquid chromatography gradient elution conditions
1.3.2.2 API-MS/MS 條件 參考Geyer 等[21-23]的方法并加以修改。API6500 Q TRAP LC/MS/MS 系統(tǒng)配置一個(gè)渦輪離子噴霧接口,在正離子模式下運(yùn)行,并由Analyst 1.6.3 軟件(AB Sciex)控制。APCI 源操作參數(shù)如下:離子源APCI+;源溫度350℃;簾氣(CUR)25.0 psi;碰撞氣(CAD)中等。優(yōu)化射入電壓(DP)和碰撞電壓(CE),確定各多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)離子對的DP 和CE 參數(shù)。根據(jù)在此期間洗脫的類胡蘿卜素酯,對每個(gè)時(shí)期特定的一組MRM 離子對進(jìn)行檢測。
1.3.3 血橙果肉類胡蘿卜素酯的定性和定量分析 基于類胡蘿卜素酯標(biāo)準(zhǔn)品對血橙果肉類胡蘿卜素酯進(jìn)行定性分析。借助三重四極桿質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)分析血橙果肉中類胡蘿卜素酯,在該模式下,目標(biāo)物質(zhì)前體離子即母離子的篩選由四極桿完成,以排除其它分子質(zhì)量物質(zhì)對應(yīng)的離子,初步排除干擾。經(jīng)碰撞室誘導(dǎo)電離后,前體離子斷裂,碎片離子形成。特征碎片離子由三重四極桿過濾選出,以排除非目標(biāo)離子,進(jìn)一步排除干擾,保證定量的精確性和重復(fù)性。不同樣品類胡蘿卜素質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)獲取后,對所有的類胡蘿卜素色譜峰峰面積積分,并對其中同一物質(zhì)在不同樣本中的色譜峰進(jìn)行積分校正;利用軟件Analyst1.6.3 處理質(zhì)譜數(shù)據(jù),采用標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算各化學(xué)成分的含量(以μg/g 鮮重計(jì))。
應(yīng)用IBM SPSS Statistics 22.0 軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,采用鄧肯多重比較進(jìn)行差異分析,其中,P<0.05 表示差異顯著。利用R 語言(含vegan包2.5.4,stats 包3.5.0 和ggplot2 包3.2.0) 進(jìn)行多變量主成分分析;運(yùn)用Graphpad Prism 7.0、Photoshop 軟件繪圖。
血橙不同部位果肉中類胡蘿卜素酯成分由UPLC-API-Q TRAP-MS/MS 分析完成,根據(jù)類胡蘿卜素酯保留時(shí)間與離子對的信息,對每種類胡蘿卜素在不同樣本中檢測到的質(zhì)譜峰進(jìn)行校正,以確保定性、定量的準(zhǔn)確。質(zhì)譜數(shù)據(jù)則由Analyst 1.6.3 軟件處理。圖1為血橙果肉中類胡蘿卜素酯各組分總離子流圖(Total ions current,TIC)。
圖1 血橙果肉中類胡蘿卜素酯各組分總離子流圖Fig.1 Total ion current chromatograms of components for carotene esters of blood orange pulp
對血橙果肉中類胡蘿卜素酯的定性分析結(jié)果見表2,共發(fā)現(xiàn)34 種類胡蘿卜素酯,包括7 種葉黃素酯,1 種新色素棕櫚酸酯,1 種玉紅黃質(zhì)棕櫚酸酯,12 種紫黃質(zhì)酯,9 種玉米黃質(zhì)酯以及4 種β-隱黃質(zhì)酯。
表2 UPLC-ESI-MS/MS 定性分析血橙果肉類胡蘿卜素酯Table 2 Identification of the carotene esters of blood orange by UPLC-ESI-MS/MS
(續(xù)表2)
配制不同濃度的類胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品溶液,獲取各濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液的質(zhì)譜峰強(qiáng)度數(shù)據(jù),計(jì)算不同類胡蘿卜素酯的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及相關(guān)系數(shù),見表3。
表3 類胡蘿卜素酯標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 3 Calibration equations of authentic standard for the carotene esters
(續(xù)表3)
基于積分峰面積和標(biāo)準(zhǔn)曲線方程對34 種血橙果肉類胡蘿卜素酯進(jìn)行定量分析,如表4分析結(jié)果所示,玉紅黃質(zhì)棕櫚酸酯和β-隱黃質(zhì)棕櫚酸酯在果蒂、赤道和果頂中含量均最高,其次是β-隱黃質(zhì)油酸酯、β-隱黃質(zhì)肉豆蔻酸酯和β-隱黃質(zhì)月桂酸。此外,新鮮采摘的血橙赤道中玉紅黃質(zhì)棕櫚酸酯、β-隱黃質(zhì)棕櫚酸酯、β-隱黃質(zhì)油酸酯、β-隱黃質(zhì)肉豆蔻酸酯和β-隱黃質(zhì)月桂酸的含量均高于果蒂和果頂。果蒂中葉黃素肉豆蔻酸酯、葉黃素棕櫚酸酯、葉黃素二月桂酸酯、葉黃素二肉豆蔻酸酯、葉黃素二棕櫚酸酯、葉黃素二油酸酯、葉黃素油酸酯、新色素棕櫚酸酯、玉紅黃質(zhì)棕櫚酸酯、紫黃質(zhì)月桂酸酯、紫黃質(zhì)肉豆蔻酸酯、紫黃質(zhì)棕櫚油酸酯、紫黃質(zhì)二月桂酸酯、紫黃質(zhì)-肉豆蔻酸酯-發(fā)酸酯、紫黃質(zhì)-肉豆蔻酸酯-月桂酸酯、紫黃質(zhì)二肉豆蔻酸酯、β-隱黃質(zhì)月桂酸、β-隱黃質(zhì)肉豆蔻酸酯、β-隱黃質(zhì)棕櫚酸酯及β-隱黃質(zhì)油酸酯的含量隨低溫貯藏時(shí)間的延長而呈上升趨勢,且0 d 和90 d 組間存在顯著性差異。低溫貯藏期間,赤道和果頂中類胡蘿卜素酯含量變化不明顯,且2 個(gè)部位果肉中類胡蘿卜素酯含量在不同貯藏時(shí)間組間無顯著性差異。
90 d 0.12±cde 0.00 0.20±d 0.10 0.05±bc 0.01 0.04±de 0.01 0.85±cd 0.20 0.13±abcd 0.07 0.02±abc 0.03 0.75±bc 0.11 0.41±abc 0.08 0.38±bcde 0.05 0.90±abc 0.09 0.05±d 0.04 1.03±bcde 0.09 13.60±d 1.71 13.60±cd 2.51 48.30±e 6.52 18.23±ef 3.57頂果60 d 30 d 0.09±0.13±abcd 0.03 de 0.04 0.18±0.18±bc 0.03 bc 0.00 0.03±0.07±ab 0.01 c 0.02 0.03±0.04±bcd 0.01 e 0.01 0.52±0.79±ab 0.13 bc 0.15 0.09±0.11±abc 0.05 abcd 0.02 0.00±0.01±ab 0.00 abc 0.01 0.55±0.75±ab 0.07 bc 0.16 0.39±0.46±abc 0.05 bcd 0.06 0.29±0.41±ab 0.06 bcde 0.04 0.88±0.99±abc 0.06 d 0.17 0.01±0.04±ab 0.01 bc 0.02 0.86±1.11±abcd 0.09 de 0.15 8.37±13.10±c 1.02 d 2.48 7.04±11.47±ab 0.93 c 1.27 36.17±46.50±c 3.43 de 4.54 13.67±18.57±cd 1.46 ef 1.76 0 d 90 d 0.08±0.09±abc 0.03 abcd 0.03 0.13±0.11±ab 0.03 ab 0.07 0.03±0.04±a 0.01 ab 0.01 0.03±0.02±bcd 0.00 ab 0.00 0.42±0.47±a 0.19 ab 0.13 0.00±0.25±a 0.00 de 0.09 0.00±0.04±a 0.00 bc 0.05 0.36±1.17±a 0.08 de 0.17 0.23±0.59±a 0.07 cd 0.09 0.21±0.45±a 0.06 cde 0.05 0.61±0.80±a 0.05 abc 0.25 0.00±0.02±a 0.00 ab 0.01 0.78±0.68±ab 0.21 a 0.07 4.08±18.07±a 0.38 e 2.98 4.33±14.73±a 0.20 d 1.82 24.13±34.00±ab 3.35 c 2.10 9.39±14.47±abc 1.74 de 2.78道赤60 d 30 d 0.06±0.09±a 0.01 abcd 0.00 0.11±0.11±ab 0.03 ab 0.03 0.04±0.04±ab 0.01 ab 0.00 0.01±0.02±a 0.00 ab 0.01 0.53±0.55±ab 0.13 abc 0.18 0.24±0.25±cde 0.12 cde 0.05 0.04±0.04±bc 0.02 abc 0.03 1.43±1.39±e 0.27 e 0.36 0.52±0.60±bcd 0.05 cd 0.19 0.51±0.42±e 0.11 bcde 0.10 0.88±0.75±abc 0.20 abc 0.18 0.02±0.01±ab 0.02 a 0.01 0.96±0.69±abcde 0.24 a 0.02 14.80±13.90±d 2.07 d 2.49 13.10±11.50±cd 2.52 c 1.78 36.40±30.63±c 8.86 abc 3.73 13.57±11.63±cd 2.72 abcd 1.89 0 d 0.11±bcde 0.01 0.11±ab 0.01 0.03±ab 0.00 0.02±bc 0.01 0.68±abc 0.20 0.13±abcd 0.06 0.00±ab 0.00 0.80±bc 0.20 0.63±d 0.19 0.47±de 0.07 0.83±abc 0.18 0.00±a 0.00 1.07±cde 0.11 7.04±abc 0.66 7.68±b 1.26 33.40±bc 4.07 12.77±bcd 1.93蒂果90 d 60 d 30 d 0.15±0.11±0.07±e 0.03 abcde 0.03 ab 0.01 0.17±0.15±0.07±bc 0.03 bc 0.01 a 0.00 0.07±0.03±0.04±c 0.01 a 0.01 ab 0.01 0.03±0.02±0.01±cde 0.01 ab 0.00 a 0.00 1.11±0.75±0.49±d 0.26 bc 0.21 ab 0.05 0.34±0.13±0.17±e 0.18 abcd 0.06 bcd 0.06 0.06±0.02±0.03±c 0.01 abc 0.02 abc 0.03 1.76±0.99±0.72±f 0.27 cd 0.16 bc 0.10 0.91±0.53±0.55±e 0.06 bcd 0.15 bcd 0.09 0.66±0.42±0.35±f 0.13 bcde 0.03 bcd 0.05 1.01±0.92±0.70±d 0.12 bc 0.12 ab 0.12 0.00±0.00±0.00±a 0.00 a 0.00 a 0.00 1.22±1.09±0.73±e 0.23 cde 0.21 a 0.06 20.33±9.21±7.64±e 2.94 c 1.73 bc 0.99 14.60±8.25±6.33±d 2.26 b 1.92 ab 0.14 46.40±37.87±23.17±de 7.77 cd 7.20 a 3.31 20.23±12.31±8.52±f 4.67 abcd 2.81 ab 0.86)。(P<0.05義意學(xué)計(jì)統(tǒng)有異差示表母0 d 0.08±abc 0.00 0.12±ab 0.03 0.03±ab 0.01 0.02±ab 0.00 0.66±abc 0.09 0.07±ab 0.02 0.00±a 0.00 0.49±ab 0.05 0.36±ab 0.07 0.31±abc 0.07 0.75±abc 0.12 0.00±a 0.00 0.81±abc 0.12 4.71±ab 0.53 4.38±a 0.44 22.43±a 2.91 7.94±a 1.07字標(biāo)肩同不)4表(續(xù)物合化號編-酯酸蔻豆肉-質(zhì)黃紫18酯酸櫚棕酯酸櫚棕二質(zhì)黃紫19-酯酸蔻豆肉-質(zhì)黃紫20酯酸油酯酸油二質(zhì)黃紫21酯酸櫚棕質(zhì)黃米玉22酯酸桂月二質(zhì)黃米玉23-酯酸桂月-質(zhì)黃米玉24酯酸蔻豆肉酸蔻豆肉二質(zhì)黃米玉25酯-酯酸桂月-質(zhì)黃米玉26酯酸櫚棕酸蔻豆肉-質(zhì)黃米玉27酯酸櫚-棕酯酯酸櫚棕二質(zhì)黃米玉28-酯酸櫚棕-質(zhì)黃米玉29酯酸脂硬-棕酯酸-油質(zhì)黃米玉30酯酸櫚酸桂月質(zhì)黃隱β-31酯酸蔻豆肉質(zhì)黃β-隱32酯酸櫚棕質(zhì)黃隱β-33酯酸油質(zhì)黃β-隱34行一”;同差準(zhǔn)標(biāo)±值均“平為值數(shù)中:表注
主成分分析方法(PCA)用于分析低溫貯藏期血橙不同部位果肉中類胡蘿卜素酯的變化特征,分析結(jié)果顯示4 個(gè)主成分貢獻(xiàn)總方差的91.88%,如圖2a 所示,PC1 和PC2 分別貢獻(xiàn)總方差的58.66%和18.26%。由圖可知,低溫貯藏0 d 和30 d 果蒂樣品(即Ste1 和Ste2)、低溫貯藏0 d 和60 d果頂樣品(Sty1 和Sty3)位于右上部分,低溫冷藏0 d 赤道樣品(即Eq1) 位于右下部分,表明Ste1、Ste2、Sty1、Sty3 和Eq1 與PC1 呈正相關(guān),果蒂低溫貯藏60 d 和90 d(即Ste3 和Ste4)以及果頂?shù)蜏刭A藏30 d 和90 d 樣品(即Sty2 和Sty4)位于左上部分,赤道低溫貯藏30,60 d 和90 d 樣品(即分別為Eq2、Eq3、Eq4)位于左下部分,表明Ste3、Ste4、Eq2、Eq3、Eq4、Sty2 和Sty4 與PC1 呈負(fù)相關(guān)。此外,Ste1、Ste3、Ste4、Sty1、Sty2、Sty3、Sty4 以 及Eq1與PC2 呈正相關(guān),而Eq2、Eq3、Eq4 以及Ste2 與PC2 呈負(fù)相關(guān)。以上結(jié)果表明,不同低溫貯藏期果蒂、果頂和赤道通過PCA 分析已完成分離并表現(xiàn)出差異顯著性。從PC2 變量圖(圖2b)可知,新色素棕櫚酸酯、玉紅黃質(zhì)棕櫚酸酯、紫黃質(zhì)酯(即紫黃質(zhì)月桂酸酯、紫黃質(zhì)肉豆蔻酸酯、紫黃質(zhì)棕櫚油酸酯、紫黃質(zhì)二肉豆蔻酸酯、紫黃質(zhì)-肉豆蔻酸酯-棕櫚酸酯、紫黃質(zhì)二棕櫚酸酯、紫黃質(zhì)-肉豆蔻酸酯-油酸酯、紫黃質(zhì)二油酸酯)、玉米黃質(zhì)酯(即玉米黃質(zhì)棕櫚酸酯、玉米黃質(zhì)二棕櫚酸酯、玉米黃質(zhì)-棕櫚酸酯-硬脂酸酯、玉米黃質(zhì)-油酸酯-棕櫚酸酯)、β-隱黃質(zhì)酯 (即β-隱黃質(zhì)棕櫚酸酯、β-隱黃質(zhì)油酸酯) 與PC2 呈正相關(guān),且紫黃質(zhì)月桂酸酯、紫黃質(zhì)肉豆蔻酸酯、紫黃質(zhì)棕櫚油酸酯、紫黃質(zhì)二肉豆蔻酸酯與Ste4 較為接近;新色素棕櫚酸酯、玉紅黃質(zhì)棕櫚酸酯、紫黃質(zhì)-肉豆蔻酸酯-棕櫚酸酯、紫黃質(zhì)-肉豆蔻酸酯-油酸酯、玉米黃質(zhì)棕櫚酸酯、玉米黃質(zhì)二棕櫚酸酯、玉米黃質(zhì)-油酸酯-棕櫚酸酯、β-隱黃質(zhì)棕櫚酸酯、β-隱黃質(zhì)油酸酯與Sty2 較為接近;紫黃質(zhì)二棕櫚酸酯、紫黃質(zhì)二油酸酯與Sty4 較為接近;玉米黃質(zhì)-棕櫚酸酯-硬脂酸酯與Ste3 較為接近。紫黃質(zhì)二丁酸酯與PC1 呈正相關(guān),且與Ste1、Eq1、Sty1、Sty3 較為接近。以上結(jié)果表明,除葉黃素酯外,不同貯藏期血橙不同部位果肉中的絕大多數(shù)酯類(如新色素棕櫚酸酯、玉紅黃質(zhì)棕櫚酸酯、紫黃質(zhì)酯、玉米黃質(zhì)酯、β-隱黃質(zhì)酯)發(fā)生了主要變化。
圖2 血橙不同部位果肉類胡蘿卜素酯主成分分析Fig.2 PCA of components for carotene esters at different parts of blood orange pulp
本研究利用UPLC-API-Q TRAP-MS/MS 對低溫貯藏期血橙不同部位果肉類胡蘿卜素酯變化進(jìn)行分析,分析結(jié)果顯示在血橙果肉中共鑒定出34 種類胡蘿卜素酯?;谕鈽?biāo)法(標(biāo)準(zhǔn)曲線方程)對各類胡蘿卜素酯含量進(jìn)行定量分析,分析結(jié)果顯示在血橙果蒂、赤道和果頂中含量最高的類胡蘿卜素酯均為β-隱黃質(zhì)棕櫚酸酯和玉紅黃質(zhì)棕櫚酸酯,其次是β-隱黃質(zhì)油酸酯。此外,研究結(jié)果顯示在低溫貯藏過程中,血橙不同部位果肉類胡蘿卜素酯含量發(fā)生改變,并且在果蒂中多種類胡蘿卜素酯含量隨冷藏時(shí)間的延長而呈現(xiàn)上升趨勢。另外,主成分分析結(jié)果顯示不同低溫貯藏期果蒂、果頂和赤道的果肉中類胡蘿卜素酯表現(xiàn)出顯著性差異,且不同貯藏期血橙不同部位果肉中的絕大多數(shù)酯類(如新色素棕櫚酸酯、玉紅黃質(zhì)棕櫚酸酯、紫黃質(zhì)酯、玉米黃質(zhì)酯、β-隱黃質(zhì)酯)發(fā)生了變化。已有研究顯示,冷藏可能導(dǎo)致柑橘類水果非揮發(fā)性成分的變化[18-19,24],而果蒂中類胡蘿卜素酯在冷藏過程中的顯著增加可能與代謝相關(guān)酶的冷依賴性激活有關(guān)。本研究系統(tǒng)分析了不同低溫貯藏時(shí)間對血橙不同部位果肉類胡蘿卜素酯組成及含量的影響,為血橙營養(yǎng)價(jià)值研究提供參考。