朱文卿，朱姍姍，何秋霞，鄭振佳*

（1 山東農業(yè)大學食品科學與工程學院 山東省高校食品加工技術與質量控制重點實驗室 山東 泰安 271018 2 齊魯工業(yè)大學（山東省科學院）生物研究所 濟南 250103）

多糖作為天然高分子物質，常被用于結合活性物質以改善食品的質地、可加工性和穩(wěn)定性等，也被用作穩(wěn)定劑、藥物載體和某些疾病的輔助治療劑[3]。將多糖與活性物質結合制備復合物，不僅能夠實現(xiàn)目標組分的靶向遞送，而且有助于活性成分發(fā)揮協(xié)同作用。常見的菊糖、葡聚糖、果膠、變性淀粉等多糖可與黃酮、單寧等多酚類構建復合物，發(fā)揮協(xié)同降血糖、抗菌和改善腸道環(huán)境的作用[4-5]。然而，目前多糖與多酚協(xié)同發(fā)揮抗氧化作用的研究報道較少。研究多糖與多酚的協(xié)同抗氧化作用，有針對性地探究科學配比，是獲取新型抗氧化劑的重要方法。

牛蒡中含有豐富的多糖和多酚。牛蒡多糖中含量較高的是菊糖，約占牛蒡干重的34%[6-7]。菊糖為線性直鏈結構，主要由12 個呋喃型的果糖以β-2，1-糖苷鍵相連[8]。研究表明牛蒡多糖具有抗氧化，降血糖，免疫調節(jié)等多種生理功能，且易于制備，安全性和穩(wěn)定性良好，在食品及醫(yī)藥領域有廣泛的應用前景[9-11]。牛蒡中多酚類物質主要為咖啡?？鼘幩犷?，包括咖啡酸、綠原酸和異綠原酸等[12]，其中綠原酸含量較高[13]，該成分具有良好的抗氧化，抗菌、消炎、抗病毒、降血糖、降血壓等多種生物活性，在食品和醫(yī)藥方面應用廣泛[14]。

基于牛蒡多糖與綠原酸均具有良好的體內抗氧化作用，本研究推測兩者復合后可能有體內協(xié)同抗氧化的作用，并進行驗證。研究通過構建斑馬魚氧化損傷模型，篩選體內協(xié)同抗氧化作用最強的牛蒡多糖-綠原酸復合物比例，并對該復合物進行結構表征與體內、外抗氧化活性評價。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：牛蒡，江蘇沛縣軼偉食品有限公司；綠原酸，成都曼斯特生物科技有限公司；轉基因皮膚熒光斑馬魚CY17（krt4-NTR：GFP），山東省科學院生物研究所。

試劑：氯仿、正丁醇、無水乙醇，天津凱通化學試劑有限公司；甲硝唑，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；1，1-二苯基-2-苦基肼自由基（DPPH），梯希愛 （上海） 化成工業(yè)發(fā)展有限公司；2，2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸二胺鹽（ABTS）、水楊酸，源葉生物科技有限公司；過硫酸鉀、硫酸亞鐵，國藥集團化學試劑有限公司；Tris-HCl 緩沖液，鼎國昌盛生物技術有限責任公司；鄰苯三酚，索萊寶科技有限公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒，碧云天生物技術有限公司；SOD 測試盒、CAT 測試盒、MDA 測試盒，南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

Olympus IX53 顯微鏡，日本Olympus 公司；Centrifuge 5804R 冷凍離心機，Eppendorf 德國專業(yè)生命科學公司；HPG-280BX 恒溫培養(yǎng)箱，哈爾濱市東聯(lián)電子技術開發(fā)有限公司；SPECTRO star Nano 全波長酶標儀，廣州伯齊生物科技有限公司；UV2450 分光光度計，日本島津公司；Nicolet iS 10 傅里葉變換紅外光譜，美國賽默飛世爾科技公司；Zetasizer-Nano-ZS 激光納米粒度儀，英國馬爾文公司；SUPRATM55 掃描電子顯微鏡，德國蔡司公司；EMPYREAN 銳影X 射線衍射儀，荷蘭帕納科公司。

1.3 方法

1.3.1 牛蒡多糖-綠原酸復合物體內協(xié)同抗氧化的最佳比例篩選 通過構建甲硝唑誘導的斑馬魚CY17氧化損傷模型，篩選復合物協(xié)同抗氧化作用最強的組合比例。

首先，目前高校和包括社區(qū)在內的行政部門在推進創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)過程中更多在扮演“獨角戲”的角色，教師和學生卻因為激勵機制不足而參與度不高。其次，在調度各方創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)積極性上存在制度性壁壘，創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)生態(tài)鏈條上針對各方的協(xié)同機制不健全。最后，目前多以政策驅動等外在因素為主導，各方內生動力不足，沒有形成適合創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)的整體生態(tài)文化。

樣品處理：牛蒡多糖的制備參考并改進Li等[15]的方法。以甲硝唑溶液（5 mmol/L）為溶劑，按照牛蒡多糖∶綠原酸（g∶g）為1∶0，3∶1，1∶1，1∶3，0∶1 的比例配制不同質量濃度（1，10，50，100 μg/mL）的樣液。

斑馬魚氧化損傷模型的構建：斑馬魚的養(yǎng)殖參考并改進Westerfield 等[16]的方法，選擇成熟的斑馬魚CY17，按照雄魚∶雌魚為3∶2 或者2∶2 的比例放入繁殖缸內，次日清晨收集受精卵，于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。24 h 后，將受精卵脫去外層卵膜，按照15 個胚胎/孔加入24 孔板中，分別在2 mL 甲硝唑溶液（5 mmol/L）、養(yǎng)殖水以及不同質量濃度的樣液（1，10，50，100 μg/mL）中孵育。維生素C（200 μmol/L）為陽性對照。孵育24 h，用質量分數(shù)0.1%的三卡因溶液將斑馬魚胚胎麻醉，然后利用顯微鏡觀察并拍照。利用Image Pro-Plus 軟件對斑馬魚的熒光細胞數(shù)進行計數(shù)，并用GraphPad Prism 8 軟件繪圖。根據熒光細胞數(shù)最多的樣品，確定復合物的最佳比例。

1.3.2 牛蒡多糖-綠原酸復合物的制備 首先將300 mg 多糖溶解于50 mL 去離子水中，溶解完全后，于10 000 r/min 下離心10 min，取多糖上清液。根據最佳比例，加入綠原酸水溶液?；旌暇鶆蚝螅?0 000 r/min 下離心10 min，上清液即為牛蒡多糖-綠原酸復合物分散液，冷凍干燥后得復合物粉末。

1.3.3 結構表征

1.3.3.1 紫外光譜 使用全波長紫外-可見光分光光度計對樣品進行全波長掃描，波長范圍為200～900 nm。

1.3.3.2 傅里葉變換紅外光譜 通過傅里葉變換紅外光譜分析樣品，在4 000～500 cm-1波長范圍內進行掃描分析，掃描次數(shù)64 次，分辨率4 cm-1。

1.3.3.3 粒徑 采用激光納米粒度分析儀測量樣品的粒徑大小，設定散射角為90°，折光指數(shù)1.330，測定溫度25 ℃，保溫2.0 min[17]。

1.3.3.4 Zeta 電位 Zeta 電位樣品質量濃度為1 mg/mL，測量溫度25 ℃，折射率設置為1.330[18]。

1.3.3.5 形貌觀察 采用掃描電子顯微鏡觀察樣品的微觀形態(tài)。將測試樣品粘在掃描電鏡觀察臺上，用濺射儀在真空條件下對樣品噴金。掃描電鏡圖像是在加速度電壓5 kV，放大倍數(shù)500 的條件下得到的[19]。

1.3.3.6 X-射線衍射分析 X-射線衍射儀配備Cu 靶陶瓷X 光管，加速電壓40 kV，電流40 mA，在2θ=5°～80°范圍內，測定樣品的X 射線衍射強度[20]。

1.3.4 體內抗氧化活性評價 為比較多糖、復合物、綠原酸在斑馬魚體內的抗氧化酶水平，測定了三者的總超氧化物歧化酶（T-SOD）、過氧化氫酶（CAT）和丙二醛（MDA）活力。斑馬魚的養(yǎng)殖和孵育同1.3.1 節(jié)方法，孵育24 h，清洗幼魚3 次，吸干水分，收集并稱重。根據斑馬魚∶生理鹽水（g∶mL）=1∶9 的比例加入生理鹽水，破碎。之后，勻漿在3 000 r/min，4 ℃下離心20 min，取上清。分別按照T-SOD、CAT、MDA 試劑盒說明書方法測定上清中T-SOD、CAT 與MDA 活力。

1.3.5 體外抗氧化活性評價 研究了多糖、復合物和綠原酸的體外抗氧化能力，測定了三者的DPPH、ABTS+、OH-、O2-自由基清除率。DPPH 自由基清除率的測定參考Tan 等[21]的方法，ABTS+自由基清除率按Huang 等[22]方法測定，OH-自由基清除率的測定參考并改進Sun 等[23]的方法，O2-自由基清除率的測定參考并改進Wu 等[24]的方法。

1.4 數(shù)據分析

所有數(shù)據均為至少3 次測量的“平均值±標準差”。使用Origin 2018 和GraphPad Prism 8 軟件繪圖，并進行差異性分析（*P＜0.05，**P＜0.01）。

2 結果與分析

2.1 復合物最佳組合比例的篩選

斑馬魚CY17是將熒光蛋白標記在角質細胞上，熒光顯微鏡下可觀察到斑馬魚的皮膚上顯示許多綠色的熒光亮斑點，其最外層魚皮對外部刺激非常敏感，添加甲硝唑后引起皮膚表層細胞凋亡，使熒光斑點消失。當添加抗氧化物質后，表皮細胞的損傷程度有所降低，熒光斑點數(shù)目會恢復，即熒光細胞數(shù)量增加[25]。圖1顯示了不同樣品處理后斑馬魚CY17的熒光細胞數(shù)。從圖中可以看出，空白組熒光細胞數(shù)約270 個，模型組顯著降低至約50 個，表明甲硝唑成功誘導斑馬魚表皮細胞減少，熒光細胞數(shù)量降低。與預期的一樣，樣品組的斑馬魚熒光細胞數(shù)較模型組均有不同程度的恢復，各樣品均表現(xiàn)出良好的抗氧化能力。在低質量濃度時（1，10 μg/mL）3 種不同比例的復合物熒光細胞數(shù)雖高于綠原酸，但稍低于多糖，表明低質量濃度限制了復合物體內協(xié)同抗氧化作用的發(fā)揮。在高質量濃度下（50，100 μg/mL），當牛蒡多糖與綠原酸的比例為1∶1 和1∶3 時，復合物熒光細胞數(shù)明顯多于2 種單體，表明2 種比例的復合物在高濃度條件下產生了增強的抗氧化效果。尤其當復合物比例為1∶3 時，協(xié)同抗氧化效果更強，因此確定復合物的最佳比例為牛蒡多糖∶綠原酸（g∶g）=1∶3，后續(xù)用于結構表征與抗氧化活性評價。

圖1 不同樣品處理后斑馬魚的皮膚熒光細胞數(shù)（n=15）Fig.1 The fluorescent cell count in zebrafish treated with different samples （n=15）

2.2 結構表征分析

2.2.1 紫外光譜結果 牛蒡多糖、復合物與綠原酸的紫外光譜如圖2所示，可以觀察到牛蒡多糖在260～280 nm 波長范圍內沒有吸收峰，證明牛蒡多糖中幾乎不含核酸和蛋白質。綠原酸屬于酚類物質，含有苯環(huán)、雙鍵、羰基等不飽和結構，在219 nm 和323 nm 波長處有紫外吸收峰[26]。復合物在波長219 nm 和323 nm 處出現(xiàn)了與綠原酸一致的吸收峰，表明復合過程中多糖與綠原酸沒有形成新的雙鍵。

圖2 多糖、復合物和綠原酸的紫外光譜圖Fig.2 Ultraviolet spectra of polysaccharide，complex and chlorogenic acid

2.2.2 粒徑與Zeta 電位結果 多糖、復合物與綠原酸的粒徑大小如圖3a 所示。多糖的平均粒徑約為160～170 nm，而復合物與綠原酸的平均粒徑約為50～60 nm。顯然，復合物的粒徑顯著減小，說明多糖和綠原酸成功復合在一起使得粒徑減小。Zeta 電位可以度量顆粒在水系中相互吸引或相互排斥的強度，Zeta 電位的絕對值越高，體系越穩(wěn)定，粒子越不容易聚集[27]。如圖3b 所示，多糖、復合物和綠原酸的Zeta 電位分別為 （-15.23±0.47）mV，（-6.36±0.80）mV 和（-4.44±0.05）mV?？梢钥闯雠］蚨嗵桥c綠原酸均帶負電荷，可能由于它們含有豐富的羥基[28]，這有助于兩者之間形成氫鍵，且復合物的Zeta 電位絕對值高于綠原酸，表明復合物的形成可以提高綠原酸的穩(wěn)定性[29]。

圖3 多糖、復合物和綠原酸的粒徑圖（a）與Zeta 電位圖（b）Fig.3 Particle size（a），Zeta potentials（b） of polysaccharide，complex and chlorogenic acid

2.2.3 傅里葉變換紅外光譜結果 圖4表征了多糖、復合物與綠原酸在4 000～500 cm-1頻率范圍內的紅外光譜。多糖在3 310 cm-1處出現(xiàn)羥基的伸縮振動峰，說明存在分子間氫鍵[30]。在2 930 cm-1和2 880 cm-1處出現(xiàn)-CH、-CH2和-CH3基團的C-H伸縮振動峰[31]，1 030 cm-1處對應吡喃糖環(huán)C-O-C的伸縮和變角振動峰[32]。綠原酸具有酚羥基（3 469，3 324 cm-1）、亞甲基（2 960 cm-1）、羰基（1 683 cm-1）、苯環(huán)（1 596，1 515 cm-1）的典型吸收峰[26]。復合物形成后，羥基峰發(fā)生明顯移動，移至3 674，3 391 cm-1處，這兩處分別對應游離羥基峰與羥基形成氫鍵的締合峰，這表明多糖與綠原酸之間形成了氫鍵[33]。C-H 伸縮振動峰由2 930，2 880 cm-1分別移至2 984，2 898 cm-1，且吸收強度明顯增強，也表明多糖與綠原酸之間發(fā)生了強烈的氫鍵反應[34]。在2 000～500 cm-1區(qū)域內，復合物雖保留了多糖與綠原酸的某些特征吸收峰，但峰強度和位置有所改變，表明多糖與綠原酸產生了相互作用，而復合物在掃描范圍內沒有出現(xiàn)新的吸收峰，說明復合物的形成并沒有生成新的雙鍵[35]，這也符合紫外光譜的測定結果。因此推斷復合物的形成主要是氫鍵作用的結果。

圖4 多糖、復合物和綠原酸的紅外光譜圖Fig.4 Infrared spectra of polysaccharide，complex and chlorogenic acid

2.2.4 X 射線衍射分析 如圖5所示，X-射線衍射圖譜顯示了復合物的結晶狀態(tài)。一般來講，晶體表現(xiàn)為尖而窄的特征峰，而非晶態(tài)物質表現(xiàn)為寬而彌散的衍射峰[36]。多糖與綠原酸復合后在2θ 為6.27°和18.54°處出現(xiàn)了較寬的衍射峰，表明復合物具有一定的結晶特性，然而結晶度較低，以一種無定形狀態(tài)存在[37]。Liu 等[38]也觀察到了類似的結果，即將多酚接枝到多糖上導致了非晶態(tài)結構的增加。

圖5 復合物的X-射線衍射圖譜Fig.5 X-ray diffraction pattern of complex

2.2.5 掃描電鏡分析 圖6顯示了500 倍數(shù)下多糖和復合物的掃描電鏡圖像?？梢杂^察到多糖結構較為松散，具有許多孔隙，而多糖與綠原酸復合后孔隙消失，呈現(xiàn)出大小不一、棱角分明、質地相對密實的無定型片狀結構，這與XRD 分析得出的“復合物以一種無定形狀態(tài)存在” 的結論一致，也證實了多糖與綠原酸之間具有較強的相互作用力，成功地復合在一起。

圖6 多糖（a）與復合物（b）的掃描電鏡圖（500×）Fig.6 Scanning electron microscope images of polysaccharide （a） and complex （b） （500×）

2.3 體內抗氧化酶活力測定

SOD 可以清除活性氧自由基，能夠將超氧自由基轉換為氧氣和過氧化物，進而對機體起到保護作用[39]。CAT 可以催化生物體內的H2O2發(fā)生反應，使其轉化為分子氧和水，可保護機體免受H2O2誘導的氧化損傷[40]。如圖7a 和7b 所示，T-SOD 活力與CAT 活力遵循一樣的趨勢。模型組的T-SOD活力、CAT 活力較空白組均顯著降低，表明甲硝唑對機體造成了氧化損傷，而加入各樣品后，T-SOD與CAT 活力均表現(xiàn)出不同程度的增強，表明機體的氧化損傷得到緩解。尤其是復合物的T-SOD、CAT 活力更高，表明其具有更強的體內抗氧化作用。MDA 反映了機體內脂質過氧化的程度，含量越高，表明機體的氧化損傷越嚴重。圖7c 為MDA含量測定結果。與空白組相比，模型組的MDA 含量顯著升高，證實了甲硝唑對斑馬魚造成了嚴重的氧化損傷。樣品處理后，與預期結果一樣，復合物的3 種濃度的MDA 含量均呈極顯著下降趨勢，說明復合物降低氧化損傷的能力更強。上述數(shù)據證實牛蒡多糖-綠原酸復合物可以有效增加機體中T-SOD 與CAT 活力并降低MDA 含量，進而抑制機體的氧化損傷。

圖7 不同樣品處理后的斑馬魚體內T-SOD（a）、CAT（b）、MDA（c）活力Fig.7 T-SOD （a），CAT （b），MDA （c） activity of zebrafish exposed to different samples

2.4 體外抗氧化活性評價

圖8a 和8b 分別為各樣品對DPPH 和ABTS+自由基的清除能力?？梢杂^察到復合物和綠原酸對兩種自由基的清除率呈現(xiàn)相似的趨勢，復合物的最高清除率與綠原酸十分接近。經過計算，復合物和綠原酸清除DPPH 自由基、ABTS+自由基的IC50分別為0.095，0.087 mg/mL 和0.35，0.28 mg/mL，表明復合物清除DPPH 和ABTS+自由基的能力與綠原酸相當。而多糖的DPPH 自由基清除能力有所下降，約從10%增至70%；對ABTS+自由基的清除能力顯著降低，僅為10%左右。圖8c 和8d分別顯示了各樣品對OH-和O2-自由基的清除率。復合物對兩種自由基的清除率均稍低于綠原酸而明顯強于多糖。經計算，復合物和綠原酸清除OH-自由基、O2-自由基的IC50分別為1.06，0.86 mg/mL和0.73，0.54 mg/mL，表明復合物清除OH-和O2-自由基的能力稍弱于綠原酸。而多糖對兩種自由基的清除能力均較低，清除率僅為15%～20%左右，且與濃度無明顯關聯(lián)。綜上所述，復合物的體外抗氧化能力顯著優(yōu)于多糖，且與綠原酸較為接近。

圖8 不同樣品的DPPH（a）、ABTS+（b）、OH-（c）、O2-（d）自由基清除率Fig.8 DPPH （a）、ABTS+ （b）、OH- （c）、O2- （d） free radical clearance rate of different samples

3 結論

本研究通過構建斑馬魚氧化損傷模型，篩選了體內協(xié)同抗氧化作用最佳的牛蒡多糖-綠原酸復合物比例，制備了牛蒡多糖-綠原酸復合物，并對其進行結構表征及體內、外抗氧化活性評價。斑馬魚的氧化損傷模型結果表明，牛蒡多糖-綠原酸復合物發(fā)揮協(xié)同抗氧化的最佳比例為多糖∶綠原酸=1∶3。該比例下的復合物平均粒徑約為50～60 nm，Zeta 電位為（-6.36±0.80）mV。紅外光譜和掃描電鏡結果顯示多糖與綠原酸之間形成了質地緊密的無定形片狀結構，氫鍵可能是復合物形成的主要作用力。此外，復合物可以顯著提高機體的T-SOD 活力和CAT 活力，降低MDA 含量，有效抑制機體的氧化損傷，且具有良好的清除DPPH、ABTS+、OH-、O2-自由基的能力。以上研究表明牛蒡多糖-綠原酸復合物可以作為一種新型抗氧化劑協(xié)同發(fā)揮抗氧化作用，為抗氧化產品的研發(fā)提供理論支撐和技術支持。