曾倩凌，劉能輝，燕 怡，李艷萍，趙 靜

(1.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，湖南 長沙 410008；2.湖南省人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，湖南 長沙 410000；3.湖南省女性生殖健康臨床醫(yī)學(xué)研究中心，湖南 長沙 410008)

自1978年第1例試管嬰兒Louise Brown誕生至今，輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive technology，ART)發(fā)展日新月異，從最初的體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET)，到其衍生技術(shù)凍融胚胎移植(frozen-thawed embryo transfer，F(xiàn)ET)，再到卵胞漿內(nèi)單精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)、經(jīng)皮附睪/睪丸穿刺取精術(shù)(percutaneous epididymal sperm aspiration/testicular sperm extraction，PESA/TESE)及胚胎植入前遺傳學(xué)診斷/篩查(preimplantation genetic diagnosis/screen，PGD/PGS)等技術(shù)，為各種不孕原因的夫婦解決了生育難題。隨著ART的廣泛應(yīng)用，人們逐漸認(rèn)識到ART在給人們帶來福音的同時，也增加了不孕夫婦不良妊娠結(jié)局的風(fēng)險；其中ART后異位妊娠發(fā)生風(fēng)險高達(dá)2.1%～8.6%，顯著高于自然妊娠中異位妊娠發(fā)生率的1%～2%[1]。如未及時發(fā)現(xiàn)異位妊娠，最嚴(yán)重可導(dǎo)致致死性休克，危及孕婦生命。因此對ART中異位妊娠相關(guān)因素進(jìn)行研究分析，并根據(jù)研究對治療方法進(jìn)行改進(jìn)，從而降低異位妊娠發(fā)生率尤為重要。

目前有一些關(guān)于ART后異位妊娠相關(guān)因素的報(bào)道顯示，在不孕因素中，輸卵管因素是公認(rèn)的異位妊娠獨(dú)立危險因素，而多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)對異位妊娠的影響尚存爭議，PCOS患者僅在新鮮胚胎移植周期中為異位妊娠的高危因素[2]。有研究指出，子宮內(nèi)膜厚度(endometrium thickness，EMT)是異位妊娠發(fā)生的相關(guān)因素，胚胎移植前EMT>12mm的患者異位妊娠風(fēng)險下降[3]。移植周期類型和移植胚胎類別對異位妊娠的影響存在爭議，部分研究認(rèn)為FET和移植囊胚可以減少異位妊娠發(fā)生的幾率；也有研究提示兩者之間并無相關(guān)性[1，4]。但目前分別分析新鮮胚胎移植周期(新鮮周期)和凍融胚胎移植周期(凍融周期)異位妊娠相關(guān)因素的研究較少，且較多研究納入因素不全。本研究同時將亞生育因素及ART治療相關(guān)因素納入研究，并分別分析新鮮周期和凍融周期中與異位妊娠相關(guān)的因素，有望更好地發(fā)現(xiàn)影響因素，進(jìn)而優(yōu)化ART治療程序。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

選取2015年5月至2019年1月在中南大學(xué)湘雅醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心行ART治療并獲得臨床妊娠的病例為研究對象，研究獲得倫理批準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①行IVF/ICSI/FET助孕者；②獲得臨床妊娠者；③臨床資料及隨訪記錄完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病，如高血壓、糖尿病、肝病等內(nèi)科疾??；②夫妻任何一方染色體異常。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)，納入到異位妊娠組的病例為170例，選取同一時期宮內(nèi)妊娠的病例1 999例為對照組；其中宮內(nèi)妊娠合并宮外妊娠納入異位妊娠組，樣本量的確定：最小樣本量為自變量數(shù)目的15倍。

1.2 資料的收集

從中南大學(xué)湘雅醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心電子病歷系統(tǒng)采集病例的一般情況、治療過程、實(shí)驗(yàn)室結(jié)果及妊娠結(jié)局等資料。

納入的影響因素指標(biāo)包括：患者的一般情況[年齡、身體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)、吸煙史]、不孕相關(guān)因素(基礎(chǔ)性激素、不孕年限、不孕類型、異位妊娠史、流產(chǎn)史、剖宮產(chǎn)史、不孕因素)、ART相關(guān)因素(周期類型、促排卵方案、內(nèi)膜準(zhǔn)備方案、周期數(shù)、扳機(jī)日/內(nèi)膜轉(zhuǎn)化日EMT、受精方式、移植胚胎數(shù)、胚胎類型、胚胎質(zhì)量)。

1.3 治療方式

1.4 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.4.1 胚胎質(zhì)量評估

1.4.1.1 卵裂期胚胎 卵裂期胚胎評分標(biāo)準(zhǔn)如下：Ⅰ級，細(xì)胞大小均勻，形狀規(guī)則，透明帶完整，碎片率<5%；Ⅱ級，細(xì)胞大小稍不均勻，形狀稍不規(guī)則，碎片率為10%～20%；Ⅲ級，細(xì)胞大小明顯不均勻，碎片率為21%～50%；Ⅳ級，細(xì)胞大小嚴(yán)重不均勻，碎片率>50%。優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎定義為卵裂球數(shù)目8～9個，評級為1～2級的胚胎，其余胚胎為非優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎[5-6]。

1.4.1.2 囊胚 按照Gardner評分系統(tǒng)對囊胚進(jìn)行評級。優(yōu)質(zhì)囊胚的標(biāo)準(zhǔn)定義為3期及3期以上、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)及滋養(yǎng)層細(xì)胞均為B級及以上，其余囊胚為非優(yōu)質(zhì)囊胚[5-6]。

1.4.2 妊娠結(jié)局

臨床妊娠：移植后28天超聲檢查見妊娠囊則判斷為臨床妊娠，2個或2個以上妊娠囊定義為多胎妊娠(包含異位妊娠)。異位妊娠：受精卵在子宮體腔以外著床者。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 妊娠結(jié)局情況

2015年5 月到2019年1月在中南大學(xué)湘雅醫(yī)院生殖中心經(jīng)IVF/ICSI/FET助孕并獲得臨床妊娠周期5 654個，其中失訪311例。在隨訪到的5 343個臨床妊娠周期中，異位妊娠194例，占臨床妊娠的3.63%。

2.2 異位妊娠相關(guān)因素

2.2.1 兩組的一般情況和不孕因素及ART相關(guān)因素

2）知識目標(biāo)：了解方言與普通話的關(guān)系，結(jié)合方言與普通話進(jìn)行自我介紹。掌握普通話的形成、發(fā)展及與方言之間的聯(lián)系等相關(guān)知識及要點(diǎn)。

異位妊娠組與對照組比較，女方年齡和BMI、基礎(chǔ)卵泡刺激素(basic follicle-stimulating hormone,bFSH)、基礎(chǔ)雌二醇(basic estradiol,bE2)、基礎(chǔ)黃體生長素(basic luteinizing hormone,bLH)、不孕年限，流產(chǎn)史、剖宮產(chǎn)史、PCOS、子宮內(nèi)膜異位癥、DOR、宮腔粘連、子宮畸形、子宮內(nèi)膜息肉的分布，周期類型、受精方式、移植胚胎數(shù)、移植胚胎類型、移植胚胎質(zhì)量，以及男方年齡和BMI，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；兩組的男方吸煙史、不孕類型、異位妊娠史、輸卵管炎癥分布，以及周期數(shù)和扳機(jī)日/內(nèi)膜轉(zhuǎn)化日EMT比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1、表2。

表1 異位妊娠組與對照組的基線資料、妊娠史及不孕原因的比較Table 1 Comparison of baseline data,pregnancy history and causes of infertility between the ectopic and intrauterine pregnancy

表2 異位妊娠組與對照組ART相關(guān)因素的比較Table 2 Comparison of ART related factors between ectopic pregnancy group and intrauterine pregnancy

2.2.2 異位妊娠的多因素分析及風(fēng)險預(yù)測模型的構(gòu)建

不區(qū)分新鮮周期與凍融周期，經(jīng)多因素分析顯示，與異位妊娠相關(guān)的獨(dú)立影響因素包括男方吸煙史、異位妊娠史、輸卵管炎癥、周期數(shù)和扳機(jī)日/內(nèi)膜轉(zhuǎn)化日EMT，見表3。

將這些因素帶入回歸公式構(gòu)建風(fēng)險預(yù)測模型：LogitP=0.410×男方吸煙史+0.513×EMT(<8mm)/(-0.682)×EMT(≥13mm)+0.815×輸卵管炎癥+0.712×異位妊娠史+0.164×周期數(shù)-2.708，對模型行似然比檢驗(yàn)，回歸方程有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=52.433，P<0.001)；對模型做判別能力評估，ROC曲線評估曲線下面積為0.671，標(biāo)準(zhǔn)誤=0.021，P<0.001，見圖1。

2.2.3 新鮮周期中異位妊娠的多因素分析及風(fēng)險預(yù)測模型的構(gòu)建

新鮮周期中與異位妊娠相關(guān)的獨(dú)立影響因素包括異位妊娠史、剖宮產(chǎn)史、輸卵管炎癥、PCOS、扳機(jī)日EMT及促排卵方案，見表4。

將這些因素帶入回歸公式構(gòu)建風(fēng)險預(yù)測模型：LogitP=1.047×有異位妊娠史(保守手術(shù))+0.801×剖宮產(chǎn)史+1.308×輸卵管炎癥+0.734×PCOS-1.111×卵泡期長方案+0.946×EMT(<8mm)-4.382，對模型行似然比檢驗(yàn)，回歸方程有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=80.396，P<0.001)；對模型做判別能力評估，ROC曲線評估曲線下面積為0.746，標(biāo)準(zhǔn)誤=0.027，P<0.001，見圖2。

表4 在新鮮周期中對異位妊娠進(jìn)行多因素Logistic回歸分析Table 4 Multi-factor logistic regression analysis of ectopic pregnancy in fresh cycle

2.2.4 凍融周期中異位妊娠的多因素分析及風(fēng)險預(yù)測模型的構(gòu)建

凍融周期中與異位妊娠相關(guān)的獨(dú)立影響因素包括輸卵管炎癥、周期數(shù)及內(nèi)膜準(zhǔn)備方案，見表5。

將這些因素帶入回歸公式構(gòu)建風(fēng)險預(yù)測模型：LogitP=1.114×輸卵管炎癥+0.306×周期數(shù)-0.671×內(nèi)膜準(zhǔn)備方案(自然周期)-4.071，對模型行似然比檢驗(yàn)，回歸方程有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=25.368，P=0.005)；對模型做判別能力評估，ROC曲線評估曲線下面積為0.674，標(biāo)準(zhǔn)誤=0.031，P<0.001，見圖3。

表5 在凍融周期中對異位妊娠進(jìn)行多因素Logistic回歸分析Table 5 Multi-factor logistic regression analysis of ectopic pregnancy in FET cycle

3 討論

3.1 ART中輸卵管炎癥及異位妊娠手術(shù)史與異位妊娠

1976 年報(bào)道了第1例IVF-ET術(shù)后異位妊娠的病例，之后有越來越多的IVF-ET術(shù)后異位妊娠的報(bào)道，異位妊娠是IVF-ET術(shù)公認(rèn)的并發(fā)癥[7]；且特殊類型的異位妊娠，如卵巢妊娠、宮內(nèi)合并宮外妊娠、宮頸妊娠等，在ART術(shù)后也大大增加[8-10]。1989年就有研究指出，在胚胎移植進(jìn)入宮腔的過程中，由于推力的作用，44%的胚胎進(jìn)入輸卵管，如果輸卵管功能受損則無法將胚胎送回宮腔而導(dǎo)致輸卵管妊娠[7]。國內(nèi)有研究指出，有過異位妊娠史的女性在IVF/ICSI-ET治療結(jié)局中更容易再發(fā)異位妊娠，而異位妊娠保守手術(shù)治療與輸卵管切除手術(shù)治療對IVF/ICSI-ET術(shù)后妊娠再發(fā)異位妊娠的幾率無差別[11]。Jacob等[12]的一項(xiàng)大樣本研究中回顧性分析了既往婦科手術(shù)史對異位妊娠的影響，發(fā)現(xiàn)既往異位妊娠及生殖器手術(shù)與異位妊娠密切相關(guān)，這些對盆腔的操作均可能導(dǎo)致盆腔炎癥，從而影響輸卵管的運(yùn)輸功能。一項(xiàng)回顧性研究指出，輸卵管性不孕癥與異位妊娠密切相關(guān)，該研究指出，既往有過異位妊娠史再次異位妊娠風(fēng)險增加，但未說明既往異位妊娠是否切除輸卵管[13]。本研究顯示，既往異位妊娠保守手術(shù)治療后再次異位妊娠的風(fēng)險增加，而異位妊娠后切除輸卵管則未增加異位妊娠的發(fā)生率；但在凍融周期中，有異位妊娠史(保守手術(shù))不再是異位妊娠的獨(dú)立影響因素，可能的原因是凍融周期中激素幾乎無超生理水平，子宮內(nèi)膜容受性較新鮮周期好。目前，切除輸卵管后對卵巢儲備的影響存在爭議，Noventa等[14]對29篇關(guān)于輸卵管切除后對ART妊娠結(jié)局及卵巢儲備影響的文章進(jìn)行分析指出，對于輸卵管疾病，以單側(cè)輸卵管切除術(shù)為基礎(chǔ)的手術(shù)方式是安全的，不會對卵巢儲備功能及卵巢控制性促排卵反應(yīng)產(chǎn)生負(fù)面影響，而對妊娠率有積極的影響。

3.2 ART中子宮內(nèi)膜容受性及促排卵方案與異位妊娠

良好的子宮內(nèi)膜容受性是胚胎正常著床的關(guān)鍵，EMT是評判子宮內(nèi)膜容受性的最佳指標(biāo)。本研究顯示，EMT偏薄(<8mm)患者異位妊娠風(fēng)險增加了1.671倍(95%CI：1.053～2.650)，而EMT偏厚(≥13mm)是異位妊娠的保護(hù)因素。在一項(xiàng)病例對照研究中指出，與EMT<8mm相比，EMT在8～12mm之間并不會增加宮內(nèi)臨床妊娠率，然而，EMT>12mm是對異位妊娠的強(qiáng)大保護(hù)因素[3]，與本研究結(jié)果存在一致性。一項(xiàng)前瞻性研究表明，EMT預(yù)測宮內(nèi)妊娠的最佳截?cái)嘀禐?0mm，其靈敏度和特異度分別為93.6%和34.5%[15]。Liu等[16]的一項(xiàng)研究指出，與EMT≥14mm相比，內(nèi)膜越薄，異位妊娠的風(fēng)險越高，該研究提到內(nèi)膜偏薄導(dǎo)致較高異位妊娠率的原因可能與氧分壓的差異有關(guān)，偏薄的EMT意味著植入的胚胎將更接近基底子宮內(nèi)膜層的螺旋動脈，因此由于活性氧的產(chǎn)生，胚胎將暴露在更高的氧濃度中，較高的氧濃度會抑制胚胎的生長，而輸卵管內(nèi)氧濃度較低，因此導(dǎo)致胚胎進(jìn)入輸卵管內(nèi)種植，從而發(fā)生異位妊娠。本研究中剖宮產(chǎn)手術(shù)史是新鮮周期中異位妊娠的危險因素，可能的原因是剖宮產(chǎn)術(shù)后導(dǎo)致切口憩室形成，降低了子宮內(nèi)膜容受性，且有研究發(fā)現(xiàn)與無瘢痕子宮相比，瘢痕子宮血管化明顯減少，白細(xì)胞浸潤減少和子宮內(nèi)膜成熟延遲，這表明剖宮產(chǎn)后子宮內(nèi)膜容受性受損[17]。盧紅瓊等[18]研究了自然妊娠中200例異位妊娠患者潛在的發(fā)病相關(guān)因素指出，分娩方式是影響異位妊娠的相關(guān)因素，異位妊娠組的既往剖宮產(chǎn)率接近宮內(nèi)妊娠組的2倍。有研究指出，對于新鮮周期中EMT較薄的女性，凍融周期中額外的E2刺激可能有助于子宮內(nèi)膜的充分發(fā)育[19]。本研究單獨(dú)分析了凍融周期中異位妊娠的相關(guān)因素顯示，單因素分析中EMT<8mm是異位妊娠的危險因素，但在多因素分析調(diào)整混雜因素后，EMT不是異位妊娠的獨(dú)立影響因素，原因可能是凍融周期中激素替代治療在一定程度上增加了EMT，因此凍融周期中整體的EMT較新鮮周期厚；而本研究凍融周期中自然周期內(nèi)膜準(zhǔn)備方案是異位妊娠的保護(hù)因素，可能的原因在于行自然周期的人群本身內(nèi)膜容受性較行激素替代周期好。在本生殖中心，通常對既往有規(guī)律排卵及子宮內(nèi)膜生長良好者才納入自然周期，而對自然周期失敗、有排卵障礙者，或者既往有規(guī)律排卵但EMT偏薄的患者納入激素替代組。本研究顯示，新鮮周期中卵泡期長方案是異位妊娠的保護(hù)因素。有研究指出，在卵巢儲備功能下降的年輕患者中，早卵泡期長方案較拮抗劑方案EMT厚，提示其可提高子宮內(nèi)膜容受性[20]。另有一項(xiàng)研究指出，在PCOS患者中卵泡期長方案較拮抗劑方案及黃體期長方案EMT顯著增厚，臨床妊娠率增加[21]。還有一項(xiàng)研究比較了卵泡期長方案與黃體期長效長方案及短效長方案臨床結(jié)局，顯示卵泡期長方案有更高的胚胎著床率及臨床妊娠率；提示卵泡期長方案可能改善了子宮內(nèi)膜容受性，幫助胚胎著床，但3種促排卵方案的異位妊娠率及流產(chǎn)率無明顯差異[22]。本文為病例對照研究，即由果推因，在調(diào)整了其他因素的情況下得出卵泡期長方案是異位妊娠的保護(hù)因素，提示卵泡期長方案可能改善了患者子宮內(nèi)膜容受性及盆腔微環(huán)境。但本研究樣本量有限，尚需更大樣本量的隨訪研究加以證實(shí)。

3.3 ART中PCOS與異位妊娠

目前關(guān)于PCOS與ART后異位妊娠的關(guān)系尚不明確。有研究報(bào)道PCOS患者ART治療后異位妊娠的發(fā)生率從0～10%不等[2]。一項(xiàng)研究分析了PCOS與異位妊娠的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，對非PCOS患者，扳機(jī)日高E2水平會增加異位妊娠的風(fēng)險；而對PCOS患者，較低的E2水平就會增加異位妊娠的風(fēng)險；可能的解釋是患有PCOS者對雌激素作用更敏感，對超生理E2水平有較低的閾值，并且在該研究中發(fā)現(xiàn)PCOS僅在新鮮周期中增加異位妊娠的發(fā)生風(fēng)險[2]。E2可以調(diào)節(jié)輸卵管的生理過程，這些生理過程包括纖毛擺動頻率、輸卵管蛋白分泌和胚胎運(yùn)動。高E2水平可以促進(jìn)宮頸向?qū)m底方向蠕動，而孕激素則是不同的效應(yīng)[2，23]。本研究在調(diào)整了混雜因素后發(fā)現(xiàn)，PCOS在新鮮周期中是異位妊娠的獨(dú)立危險因素，而在凍融周期中無顯著性意義。

3.4 ART中移植胚胎類型與異位妊娠

本研究中未發(fā)現(xiàn)胚胎類型與異位妊娠之間存在相關(guān)性。Smith等[1]研究了13 654例新鮮周期妊娠，比較囊胚移植和卵裂期胚胎移植后的異位妊娠風(fēng)險，表明卵裂期胚胎移植的異位妊娠風(fēng)險與囊胚移植相比無差異。與之相反，F(xiàn)ang等[4]發(fā)現(xiàn)凍囊胚移植比卵裂期凍融胚胎移植及新鮮周期胚胎移植的異位妊娠率低。囊胚移植結(jié)局優(yōu)于卵裂期胚胎移植，這既是因?yàn)樗c自然周期的妊娠生理相似，也是因?yàn)槟遗呔哂懈叩闹踩霛摿24]。目前研究的結(jié)論存在矛盾，因此囊胚移植作為異位妊娠的保護(hù)因素仍然需要進(jìn)一步的研究來論證。

綜上所述，行ART助孕的患者相對自然妊娠而言更復(fù)雜，不僅包括自身的不孕因素，還有ART助孕過程中各種因素的影響。不孕患者妊娠很寶貴，如何最大限度地降低不良妊娠率及增加活產(chǎn)率是醫(yī)生和患者的共同目標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)輸卵管炎癥、異位妊娠保守手術(shù)史、EMT薄(<8mm)及治療周期數(shù)目越多的患者行ART治療時異位妊娠發(fā)生風(fēng)險增加，卵泡期長方案可能改善子宮內(nèi)膜容受性，降低異位妊娠的發(fā)生風(fēng)險，PCOS對異位妊娠的影響在新鮮周期中更顯著，其可為臨床工作帶來一定的參考價值，但仍需要多中心前瞻性隨機(jī)對照研究進(jìn)一步證實(shí)。