寧 朋，李 燕，張 敏，王 菲，黃曉霞

(西南林業(yè)大學 園林園藝學院，國家林業(yè)與草原局 西南風景園林工程技術研究中心，云南 昆明 650224)

近年來，全球氣候變暖以及環(huán)境破壞的加劇，使得水資源匱乏問題日益嚴峻，導致中國全國范圍內干旱危害和水分缺乏日益加重[1].尤其是伴著城市化的快速發(fā)展，全國城市綠地面積高速增加，城市園林綠地灌溉用水量逐年增加，在水資源可供給量與社會總需求量矛盾日益尖銳的背景下，水資源匱乏問題在城市綠地發(fā)展和建設過程中尤其嚴重[2-3].因此選擇抗旱性較強的園林植物以及通過有效手段增強園林植物的抗旱能力，對于當前水資源匱乏背景下城市綠地的建設與發(fā)展具有重要意義.

一氧化氮(NO)是普遍分布在植物體內的內源物質，作為一種信號分子，通過影響植物基因的表達，在植物的生長、發(fā)育及抗逆性調節(jié)等一系列生理過程的調控[4-5]中發(fā)揮著重要作用.前人研究表明，干旱使植物光合色素含量減少，光合速率和營養(yǎng)物質積累受到抑制[6-7]，而外源NO 可以促進抗氧化基因的表達，提高抗氧化酶活性，緩解活性氧的積累，降低丙二醛(MDA)含量，維持膜的穩(wěn)定性[8]，調節(jié)可溶性滲透調節(jié)物質含量以維持細胞正常吸水[9]，從而增強植物的抗旱能力，維持植物在干旱環(huán)境下生物量積累和正常生長[10].此外，外源NO 也被發(fā)現(xiàn)可以提高植物抵御鹽脅迫[11]、重金屬脅迫[12]和低溫脅迫[13-14]的能力.在SNP 的施用方式上，前人研究大多數(shù)以葉面噴施的方式對植物進行處理[9,13,15]，以澆灌的方式處理的研究較少[16]，更少有報道對兩種施用方式及不同濃度的作用效果進行過對比研究.滇潤楠(Machilus yunnanensis)為樟科潤楠屬常綠喬木，在云南地區(qū)城市綠化中作為主要鄉(xiāng)土樹種被廣泛種植，其在綠化中對改善人居環(huán)境、提升生活質量方面具有重要作用，被評為昆明市民最喜愛的10 種園林綠化樹種之一[17].本研究以半年生滇潤楠幼苗為材料，探討不同濃度外源NO 及其施用方式對干旱脅迫下滇潤楠的生長及生理特性的影響，旨在為當前水資源匱乏背景下如何通過有效手段提升城市綠化樹種抗旱能力提供一定的理論依據(jù)，也可為進一步探究外源NO 提高植物的抗逆性機制提供科學基礎.

1 實驗材料與方法

1.1 試驗地概況試驗地設在西南林業(yè)大學園林園藝學院后山苗圃大棚內(24°23′～26°22′N，102°10′～103°40′E)，年均溫14.9 ℃，屬于低緯度高原山地季風氣候，年降水量1 011.2 mm，年蒸發(fā)量1 838.3 mm，相對濕度74%，全年無霜期在240 d 以上，年日照數(shù)2 196.7 h，日照百分率56%，年均總輻射量5 430 MJ·m?2，其中雨季2 630 MJ·m?2，干季2 800 MJ·m?2，兩季之間差異不大.

1.2 實驗設計于2020 年7 月選取半年生滇潤楠實生苗，以腐殖土與紅土質量比按3∶2 的比例混合作為栽培基質，種植于容量為3 L 的聚乙烯塑料花盆中.于2020 年8 月選取生長健壯，無病蟲害，大小相當?shù)挠酌邕M行實驗處理.從移栽到處理這段時間，所有幼苗均保持水分充足.本研究參考Rahimian 等[15]的方法，以硝普鈉(SNP)為外源NO 供體.如表1 所示，共設置6 個處理組.水分處理以隔天澆水補充水分至實驗設計中相應的田間持水量，SNP 處理待土壤干旱程度達到50%～55%田間持水量后進行，D+S1 組、D+S2 組每天噴施1次SNP 溶液，因幼苗植株體較小，每株噴施溶液量為5 mL 即噴施均勻.D+W1 組、D+W2 組每天使用5 mL SNP 溶液進行根際澆灌處理.為減少誤差，除D+S1 和D+S2 外其余各組每日葉面噴施5 mL純水，除D+W1 和D+W2 之外其余各組每日使用5 mL 純水進行根際澆灌.實驗處理共3 個月，于2020 年11 月進行生長及生理指標測量.

表1 實驗設計Tab.1 Experimental design

1.3 測定項目與方法

1.3.1 生長指標測定 用卷尺測量株高、根長；葉片相對含水量(LWRC)采用飽和稱重法測定.在2020 年11 月處理結束時收獲所有植株，洗凈，每處理選取5 棵植株，量取株高及根系長度，取其平均值，并將根、莖、葉分開，放入烘箱80 ℃烘至恒重，稱量植株根、莖、葉生物量、總生物量及葉片相對含水量.

1.3.2 光合指標測定 光合參數(shù)采用Li-6400XT便攜式光合儀(美國LI-COR Biosciences 公司)測定.選擇晴朗的天氣，測定時間為光合作用比較活躍的9:00—11:00(溫度24 ℃)，每處理選取3 株無病蟲害植株的成熟功能葉片進行光合參數(shù)的測定，每株測3 片葉子，每片葉子重復5 次，最后取其平均值.測定植株凈光合速率(Pn，μmol·m?2·s?1)、氣孔導度(Gs，μmol·mol?1)、胞間二氧化碳濃度(Ci，mmol·m?2·s?1)、蒸騰速率(Tr，mmol·m?2·s?1)，測定時使用二氧化碳(CO2)鋼瓶，物質的量比設定為400 μmol·mol?1，空氣流速為1 L·min?1，光強為1 200 μmol·m·?2·s?1，葉溫25 ℃，相對濕度60%.

1.3.3 其他生理指標的測定 每處理組選取3 株植株，每個指標在每植株取葉片0.2 g 進行生理指標的測定.光合色素采用丙酮?乙醇(等體積比)混合液浸提法進行測定；丙二醛(MDA)含量釆用硫代巴比妥酸法測定；脯氨酸(PRO)質量比采用茚三酮比色法測定；可溶性蛋白(SP)質量比測定采用考馬斯亮藍(G-520)染色法；過氧化物酶(POD)活性釆用愈創(chuàng)木酚法測定，超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍四唑法測定；過氧化氫酶(CAT)活性和抗壞血酸過氧化物酶(APⅩ)活性采用紫外吸收法測定[18]，可溶性糖(SS)采用GOD-POD 比色法測定.

1.4 數(shù)據(jù)處理分別采用Excel 和SPSS 19.0 軟件對數(shù)據(jù)進行初步統(tǒng)計和單因素方差分析(one-way，ANOVA)，采用Duncan 法進行多重比較(α=0.05)，采用Origin 2017 軟件作圖；采用ggcorrplot 包的“cor”函數(shù)進行pearson 相關性分析并采用“ggcorrplot”函數(shù)繪制相關性熱圖.柱狀圖與表格中數(shù)據(jù)均為平均值±標準誤.

2 結果與分析

2.1 外源NO 對干旱脅迫滇潤楠幼苗葉片相對含水量的影響葉片相對含水量是反映植物葉片水分狀況的重要指標，可直接反映干旱環(huán)境下植物體內水分的虧缺情況.由圖1 可以看出，與CK 相比，滇潤楠幼苗的LRWC 在D 處理組中顯著(P<0.05)降低，在SNP 處理后升高，其中0.1 mmol·L?1的葉片噴施處理(D+S1)和0.2 mmol·L?1的根際澆灌處理(D+S2)顯著(P<0.05)提高了滇潤楠幼苗的LRWC.

圖1 外源NO 對干旱脅迫下滇潤楠幼苗葉片相對含水量的影響Fig.1 Effect of exogenous NO on leaf relative water content of Machilus yunnanensis seedlings under drought stress

2.2 外源NO 對干旱脅迫滇潤楠幼苗生長的影響由表2 可知，干旱脅迫抑制了滇潤楠幼苗的生長.相比CK，D 組的葉、莖、根生物量與總生物量分別降低了36.00%、33.33%、5.26%和25.27%，根冠比(R/S)增加了39.47%.SNP 處理有效促進了干旱脅迫下滇潤楠幼苗生長和營養(yǎng)物質積累，其中0.1 mmol·L?1葉片噴施處理(D+S1)的葉、根生物量和總生物量相比D 組顯著(P<0.05)增加、R/S上升了17.11%，且均高于SNP 噴施濃度更高的D+S2 處理組和根際澆灌處理組(D+W1，D+W2).

表2 干旱脅迫下外源NO 對滇潤楠幼苗生長的影響Tab.2 Effect of exogenous NO on the growth of Machilus yunnanensis seedlings under drought stress

2.3 外源NO 對干旱脅迫滇潤楠幼苗光合色素含量的影響由表3 可知，干旱脅迫顯著(P<0.05)降低了滇潤楠幼苗的葉綠素a(Chla)、葉綠素b(Chlb)、葉綠素(Chl(a+b))質量比，卻使類胡蘿卜素(Car)質量比、類胡蘿卜素/葉綠素比值w(Car)/w(Chl)顯著(P<0.05)增加.干旱脅迫下，滇潤楠幼苗的Chla、Chlb、Chl(a+b)質量比在施用SNP 后增加，其中以低濃度(0.1 mmol·L?1)葉面噴施處理(D+S1)和高濃度(0.2 mmol·L?1)的根際澆灌處理增加最為顯著(P<0.05).而Car 質量比和w(Car)/w(Chl)比值則在施用SNP 后降低.這表明0.1 mmol·L?1的SNP葉面噴施處理可顯著(P<0.05)提高滇潤楠幼苗的Chl 質量比，作用效果隨著SNP 濃度的增高減弱；而在根際澆灌處理中則可能需要較高濃度(0.2 mmol·L?1)的SNP 處理才能顯著(P<0.05)提高滇潤楠幼苗的Chl 質量比.

表3 外源NO 對干旱脅迫下滇潤楠幼苗光合色素質量比的影響Tab.3 Effects of exogenous NO on photosynthetic pigment conents of Machilus yunnanensis seedlings under drought stress

2.4 外源NO 對干旱脅迫下滇潤楠幼苗丙二醛(MDA)含量的影響MDA 含量可以衡量植物細胞膜脂過氧化程度，其含量越高，表明細胞膜脂過氧化程度越高，細胞膜受到的傷害越嚴重.由圖2可知，干旱脅迫使滇潤楠幼苗的MDA 含量顯著(P<0.05)增加.D+S1、D+S2、D+W1 和D+W2 處理組的MDA 含量相比D 分別降低了29.12%、29.67%、30.56%和26.02%.這表明外源NO 可有效減輕干旱脅迫下滇潤楠幼苗的膜脂過氧化程度.

圖2 外源NO 對干旱脅迫下滇潤楠幼苗葉片丙二醛含量的影響Fig.2 Effects of exogenous NO on MDA content in leaves of Machilus yunnanensis seedlings under drought stress

2.5 外源NO 對干旱脅迫下滇潤楠幼苗光合特性的影響由圖3 可知，滇潤楠幼苗的最大凈光合速率(Pn)、氣孔導度(Gs)、胞間二氧化碳濃度(Ci)、蒸騰速率(Tr)均在干旱脅迫下顯著降低，在SNP 處理后升高，在D+S1 處理組中顯著(P<0.05)高于D處理組，且高于D+S2 處理組；D+W1 和D+W2 處理組的Pn均顯著(P<0.05)高于D 處理，但是低于D+S1 處理.說明SNP 處理可有效緩解干旱脅迫對滇潤楠幼苗光合特性的影響；并且以低濃度(0.1 mmol·L?1)SNP 葉面噴施處理作用效果最佳.

圖3 外源NO 對干旱脅迫下滇潤楠幼苗光合參數(shù)的影響Fig.3 Effect of exogenous NO on photosynthetic parameters of Machilus yunnanensis seedlings under drought stress

2.6 外源NO 對干旱脅迫下滇潤楠幼苗滲透調節(jié)物質含量的影響脯氨酸(Pro)、可溶性蛋白(SP)、可溶性糖(SS)是植物體內的主要滲透調節(jié)物質，在植物抵御逆境的過程中發(fā)揮著重要作用.由圖4可知，滇潤楠幼苗的Pro、SS 含量在干旱脅迫下顯著(P<0.05)升高，并且在SNP 處理后進一步升高，SP 質量比也在SNP 處理后增加.3 種滲透調節(jié)物質含量均在低濃度(0.1 mmol·L?1)的葉面噴施處理(D+S1)中達到最大值，且顯著(P<0.05)高于D處理組；在2 個葉面噴施處理組(D+S1、D+S2)中分別高于同等SNP 濃度的兩個根際澆灌處理組(D+W1、D+W2).

圖4 外源NO 對干旱脅迫下滇潤楠幼苗滲透調節(jié)物質含量的影響Fig.4 Effect of exogenous NO on osmotic adjustment substance contents of Machilus yunnanensis seedlings under drought stress

2.7 外源NO 對干旱脅迫下滇潤楠幼苗抗氧化酶活性的影響植物在干旱脅迫下，活性氧含量增加，植物通過增強抗氧化酶活性以清除過量活性氧[15].由圖5 可知，滇潤楠幼苗的抗壞血酸過氧化物酶(APX)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)活性在干旱脅迫下顯著(P<0.05)增強；其中APX、POD 和CAT 活性在D+S1 處理組中顯著(P<0.05)高于D 處理組，并高于D+S2 處理組.APX、POD 活性在D+S1處理組中顯著(P<0.05)高于D+W1 處理組；而在D+S2 和D+W2兩個處理組之間無顯著差異.這表明較低濃度(0.1 mmol·L?1)的SNP 葉面噴施處理可有效提高滇潤楠幼苗的抗氧化酶活性，在根際澆灌處理和高濃度(0.2 mmol·L?1)的葉面噴施處理時作用效果減弱.

圖5 外源NO 對干旱脅迫下滇潤楠幼苗抗氧化酶活性的影響Fig.5 Effect of exogenous NO on antioxidant enzyme activities of Machilus yunnanensis seedlings under drought stress

2.8 施用SNP 后干旱脅迫下滇潤楠幼苗生長及生理指標相關性分析由圖6 可知，相關性分析顯示，MDA 含量與SS 含量、Car 質量比、w(Car)/w(Chl)比值呈顯著正相關關系，與Chl 質量比、Pn、Tr、Ci、Gs呈顯著負相關關系.抗氧化酶(APX、CAT、POD、SOD)活性與Pro、SP、SS 含量呈顯著正相關關系.(Chl)、R/S均與LRWC、總生物量呈顯著正相關關系.

圖6 滇潤楠幼苗生長及生理指標相關性分析Fig.6 Correlation analysis of growth and physiological indexs of Machilus yunnanensis seedlings

3 討論

3.1 干旱脅迫對滇潤楠幼苗生長及生理特性的影響本研究中，滇潤楠的生長及生理特性均受到干旱脅迫影響顯著.干旱脅迫使滇潤楠幼苗葉片含水量顯著下降，并抑制了滇潤楠幼苗的營養(yǎng)物質積累和正常生長，導致莖、葉生物量顯著下降，而根生物量下降趨勢并不顯著，根冠比增加，這可能是由于植物可以通過提高對地下部分投資的比例、提高根冠比以增強對逆境的耐受能力[19].本研究中滇潤楠幼苗的葉綠素質量比在干旱環(huán)境下顯著下降，且相關性分析顯示葉綠素質量比與丙二醛含量呈顯著負相關，這可能是由于干旱環(huán)境中活性氧增加導致葉綠素降解、葉綠素合成酶活性受到抑制[20-21]；而滇潤楠幼苗的類胡蘿卜素質量比與w(類胡蘿卜素)/w(葉綠素)比值均在干旱環(huán)境下顯著增加，相關性分析顯示類胡蘿卜素質量比與丙二醛含量顯著正相關.類胡蘿卜素是一種抗氧化劑，可以清除光呼吸產(chǎn)生的H2O2、淬滅活性氧[22]，因此滇潤楠幼苗類胡蘿卜素質量比的升高可能是植物對干旱環(huán)境的一種適應機制[23-24].干旱脅迫導致滇潤楠幼苗的凈光合速率、氣孔導度、胞間二氧化碳濃度均顯著降低，表明此時氣孔限制是滇潤楠幼苗凈光合速率降低的主要因素，可能是因為滇潤楠幼苗在水分虧缺環(huán)境中關閉氣孔以減少蒸騰失水，從而使凈光合速率降低[25-26].脯氨酸、可溶性糖含量在干旱脅迫下均顯著上升，表明滇潤楠幼苗通過調節(jié)其滲透調節(jié)物質含量以應對水分虧缺環(huán)境，這是植物對干旱脅迫做出的積極響應[21].丙二醛含量在干旱脅迫下增加，表明滇潤楠幼苗細胞膜的結構和功能受到破壞，這可能是由于干旱使植物體內活性氧和自由基大量產(chǎn)生，導致活性氧代謝平衡被打破，引發(fā)膜脂過氧化[8]，而超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶、抗壞血酸過氧化物酶酶活性升高是植物應對不利環(huán)境下氧化脅迫的方式[15]，表明滇潤楠幼苗通過調節(jié)其抗氧化酶活性以抵御干旱環(huán)境造成氧化脅迫.

3.2 外源NO 對干旱脅迫下滇潤楠幼苗生長及生理特性的影響外源NO 顯著緩解了干旱脅迫對滇潤楠幼苗生長及生理特性的影響.無論是葉面噴施還是根際澆灌SNP，均有利于干旱下植株的生長.滇潤楠幼苗的葉片含水量在SNP 處理后顯著上升.有研究表明，NO 作為植物感知干旱脅迫的信號分子，可以促進ABA 的合成[27]，從而提高滇潤楠植株的水分利用效率，維持植株細胞原生質體水分平衡，增強細胞穩(wěn)定性，提高了葉片的保水能力[17].外源NO 可有效提高滇潤楠幼苗的根冠比和生物量，相關性分析亦表明根冠比與生物量呈顯著正相關關系，這可能是由于NO 作為生長素信號轉導通路中的下游信號分子參與了植物不定根的發(fā)育，從而促進了植物根系生長[6]，進而使滇潤楠幼苗的根冠比升高，抗旱能力增強.外源NO 提高了干旱脅迫下滇潤楠幼苗葉綠素的含量，緩解了干旱脅迫對滇潤楠幼苗光合特性的影響.有研究表明外源NO 減少了植物在干旱脅迫下活性氧的積累，保護了葉綠體膜的完整性，緩解了活性氧對葉綠素的破壞作用[8].滇潤楠幼苗的凈光合速率、氣孔導度、胞間二氧化碳濃度在施用外源NO 后得到提高，可能是由于外源NO 促進了硫化氫信號的生成[14]，硫化氫可以通過增加氣孔開度和密度從而促進凈光合速率升高[28]；另一方面，外源NO 也可以通過提高光合色素含量，增加PSⅡ反應中心的開放比例而提高植物的凈光合速率[29].外源NO 能有效提高植物可溶性滲透調節(jié)物質含量，維持細胞滲透勢，提高葉片細胞的保水能力[9].本研究亦表明外源NO 使干旱脅迫下滇潤楠幼苗脯氨酸、可溶性蛋白、可溶性糖的含量增加，提高了滇潤楠幼苗的滲透調節(jié)能力.此外，脯氨酸不僅是一種重要的滲透調節(jié)物質，還參與了活性氧的清除，具有穩(wěn)定生物大分子的結構的作用.可溶性糖是合成有機物質的碳架和能量來源，對細胞膜和原生質膠體具有重要的穩(wěn)定作用，兩者均對蛋白質有一定的保護作用，可防止酶脫水，兼做酶的保護劑[30].相關性分析顯示，脯氨酸、可溶性糖含量與抗氧化酶活性呈顯著正相關關系.據(jù)此推測，滇潤楠幼苗脯氨酸和可溶性糖含量的升高可能對抗氧化酶起到了一定的保護作用，在一定程度上緩解了滇潤楠幼苗的氧化脅迫.外源NO 增強了干旱下滇潤楠幼苗抗氧化酶活性，降低了其丙二醛含量，緩解了滇潤楠幼苗在干旱環(huán)境下受到的氧化脅迫，減輕了膜脂過氧化程度，維持了滇潤楠幼苗細胞膜結構的完整性.可能是由于NO 作為一種信號分子，誘導了植物抗氧化基因表達，增強了抗氧化酶活性[31]，并且NO 還可以誘導AOX1a基因的表達，促使丙酮酸含量增加，從而增強抗氰替代途徑以減少活性氧的產(chǎn)生[8].

高濃度的NO 與超氧陰離子相互作用生成過氧亞硝酸根陰離子[32].過氧亞硝酸根陰離子具有強氧化性，能破壞DNA 結構，氧化葉綠體蛋白質，并且引起不飽和脂肪酸氧化，使膜脂受到過氧化傷害[33].因此，許多研究均發(fā)現(xiàn)外源NO 的作用具有雙重性，即低濃度的外源NO 處理可以有效增強植物的抗逆性，促進逆境下植物的生長，而高濃度NO 的作用效果則會減弱，甚至對植物產(chǎn)生毒害作用[6,15].本研究結果亦表明較高濃度的外源NO 噴施處理對滇潤楠幼苗抗旱能力的提升效果減弱.再次證明了外源NO 的作用具有雙重性.

本研究結果表明SNP 葉面噴施處理對滇潤楠幼苗抗旱能力的提升作用效果好于根際澆灌處理.前人對葉面施肥的研究認為，與土壤施肥相比，葉面施肥的方式得益于葉片氣孔和角質層孔隙的滲透性，使營養(yǎng)元素可以更快地進入葉肉細胞，利用效率更高[34]，尤其是在補充一些金屬元素和微量元素時，葉面施肥的方式可以避免營養(yǎng)元素與土壤中其他元素的拮抗作用而提高吸收效率[35-36].據(jù)此推測，NO 作為一種氣體信號分子，在葉面噴施的處理組中可能通過氣孔而更快地進入葉肉細胞，相比于根際澆灌處理組更容易被滇潤楠幼苗吸收，對滇潤楠幼苗抗旱能力的提升效果更好.

4 結論

干旱脅迫顯著抑制了滇潤楠幼苗的生長，使其LRWC、生物量和凈光合速率顯著降低，MDA含量顯著增加.同時干旱脅迫提高了滇潤楠幼苗的類胡蘿卜素質量比、滲透調節(jié)物質含量、根冠比和抗氧化酶活性.SNP 處理后，滇潤楠幼苗的葉片相對含水量、葉綠素質量比、凈光合速率、生物量、根冠比、滲透調節(jié)物質含量和抗氧化酶活性顯著升高，MDA 含量顯著降低.這表明外源NO 可以通過提高滇潤楠幼苗的根冠比和滲透調節(jié)物質的含量，以增強其抗旱能力；增強了滇潤楠抗氧化酶活性，減輕其膜脂過氧化程度；提高了葉綠素質量比，促進氣孔開放，從而提高了滇潤楠幼苗的凈光合速率，維持其在干旱脅迫下的生物量積累和正常生長.在所有的SNP 處理組中，葉面噴施處理的作用效果要好于根際澆灌處理，并且外源NO 的作用具有雙重性，較低濃度(0.1 mmol·L?1)SNP 可有效提高滇潤楠幼苗的抗旱性，而在較高濃度(0.2 mmol·L?1SNP)下，作用效果則會減弱.