黃廣一，喻好好，李世鈺,2，黃家雄，呂玉蘭，何飛飛**

(1.云南大學 農學院，云南 昆明 650500；2.云南省瑞麗市農場管理委員會，云南 瑞麗 678600；3.云南省農業(yè)科學研究院 熱帶亞熱帶經濟作物研究所，云南 保山 678000)

硝化作用是土壤氮素轉化的關鍵過程，決定著植物可利用氮素形態(tài)的數量和相對比例.就農業(yè)生產和環(huán)境保護領域而言，硝化過程產生的NO3?極易淋失并造成水體污染；NO3?是反硝化作用的底物，土壤中NO3?的增加會加速土壤氮素的氣體損失和溫室氣體N2O 的排放，氮素流失也導致氮肥的使用量增加，生產成本上升；硝化過程H+的釋放和累積可引起土壤酸化，繼而導致土壤退化并使作物減產[1].因此，了解硝化過程及影響硝化作用的主導因素，對生態(tài)系統(tǒng)健康和農業(yè)生產力提高都有重要意義.

酸性土壤的硝化活性一般較弱[2-3]，但長期施用氮肥和有機肥會明顯提高酸性土壤硝化活性[4-5]，導致酸化加劇[6-7].因此，深入研究酸性土壤硝化作用，是退化土壤修復和土壤質量提升的重要基礎.咖啡是云南重要的經濟作物，種植面積和產量占全國的98%以上[8]，是云南省熱區(qū)邊疆農民的主要收入來源之一，對云南省的經濟社會發(fā)展和邊疆鄉(xiāng)村振興具有重要影響.有研究表明，云南咖啡主產區(qū)超過50%的土壤pH 值已低于適宜范圍5.5～6.5[9]，土壤酸化趨勢明顯.云南咖啡產區(qū)氣溫高，雨量大，高溫多雨會加快土壤氮素轉化，硝化作用強烈[10-12]，由此帶來的氮素損失和土壤酸化風險較高.因此以咖啡園土壤為典型材料開展硝化作用研究，通過測定凈硝化速率和氨氧化微生物，闡明云南熱區(qū)咖啡園土壤硝化作用特征及其關鍵影響因子，能為該區(qū)域防治土壤酸化提供科學依據，預期成果還可以為其它類型土壤酸化研究提供參考.

1 材料與方法

1.1 土壤采集區(qū)概況云南熱區(qū)總面積81 110 km2左右，占云南省土地總面積的21%，≥10 ℃年積溫6 000 ℃以上，年平均氣溫≥17.5 ℃，年降雨量600～2 700 mm，5—10 月為雨季，降雨量占全年的86%，年日可照時數1 750～2 250 h.土壤類型主要是磚紅壤、赤紅壤、燥紅壤和褐紅壤，pH=4.1～6.5.

云南咖啡產區(qū)主要分布在怒江、瀾滄江、紅河、金沙江等流域海拔500～1 800 m 之間的熱區(qū)，南部與越南、老撾、緬甸接壤，北部抵達金沙江流域.土壤采集區(qū)域設置在保山市潞江壩和德宏州芒市.保山市潞江壩是南亞熱帶干熱河谷氣候，德宏州芒市屬于南亞熱帶季風濕熱氣候.

1.2 土壤樣品采集2017 年咖啡采摘結束后，選擇種植年限5～20 a 咖啡園土壤，按S 形取樣法取10 個點合成1 個混合樣，每塊取樣地重復采集3 次，采集深度0～20 cm 耕層.采集的土樣存于冰盒中帶回實驗室，存于4 ℃冷庫中備用.供試土壤基本情況見表1.

表1 供試土壤基本信息和理化性質Tab.1 Basic information and physicochemical properties of the soil samples

1.3 土壤硝化作用培養(yǎng)實驗將保存于4 ℃冷庫中備用的新鮮土樣取出，稱取40 g 置于250 mL 三角瓶中，調節(jié)土壤含水量至45%最大持水量，用透氣保水膜封口，在30 ℃黑暗條件下預培養(yǎng)1 周以激活微生物，每個處理重復3 次.預培養(yǎng)結束后的土樣中加入硫酸銨，銨態(tài)氮(NH+?N)添加量為20 mg·kg?1，同時把土壤含水量調至60%最大持水量，于30 ℃黑暗條件下繼續(xù)培養(yǎng)，在第0、1、2、4、7 d 測定土樣中的NH4+?N、硝態(tài)氮(NO3??N)質量比，其中0 d 為加入硫酸銨2 h 后采樣，凈硝化速率計算見文獻[13].

1.4 土壤性質和DNA 分析全氮：凱氏定氮法；有機碳：低溫外熱重鉻酸鉀?容量法測定有機質，參考張維理等[14]計算方法將有機質換算成有機碳；速效鉀：乙酸銨提取?火焰光度計法；有效磷：碳酸氫鈉浸提?鉬藍比色法；土壤pH∶液土質量比為5∶1，pH 儀 (inolabpH7300) 測定.土壤NH4+?N∶按液土質量比5∶1 加入100 mL 濃度為2 mol·L?1KCl 浸提，靛酚藍比色法測定；土壤NO3??N：紫外分光光度法測定[15]；土壤最大持水量：把過20 目篩（孔徑0.85 mm）的風干土樣20 g 置于用棉球塞住的漏斗中，加去離子水浸泡2 h，加蓋，除去棉塞，讓水分自由下滲，放置過夜后，測定土壤質量含水量作為土壤最大持水量.

土壤DNA 提取及PCR 擴增及測序：土壤基因組DNA 提取試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)提取樣本的微生物基因組DNA.根據測序的土壤細菌16S rRNA 基因V4 區(qū)選擇特異引物515F和806R 進行PCR 擴增[16].PCR 反應體系如下 (50 μL) ：2×Phusion Master Mix 25 μL，515F Primer (10 μmol/L)2.5 μL，806R Primer (10 μmol/L) 2.5 μL，1 ng/μL gDNA 10 μL (5-10 ng)，H2O 10 μL.PCR 反應程序為：98 ℃預變性30 s；98 ℃ 10 s；50 ℃ 30 s；72 ℃30 s，循環(huán)30 次；72 ℃延伸5 min.利用2%的瓊脂糖膠電泳和GeneJET 膠回收試劑盒(Thermo Scientific，USA)對PCR 產物進行純化回收.隨后，PCR產物送至北京諾禾致源科技股份有限公司進行文庫構建和高通量測序（基于IonS5TMXL 測序平臺）.

1.5 土壤數據分析IonS5TMXL 測序數據經過Cutadapt (v1.9.1)軟件過濾和按barcode 拆分樣本后，利用Uparse 軟件(v7.0.1001)進行OTUs (Operational Taxonomic Units)聚類和物種分類分析[17].根據OTUs聚類結果，利用Silva 數據庫[17]，對每個OTU 的代表序列進行物種注釋.同時，對OTUs 進行基于物種的豐度分布情況分析，根據所有樣品在屬水平上的物種注釋及豐度信息，篩選氨氧化微生物(AOA和AOB)和亞硝酸鹽氧化細菌(NOB)，從物種層面進行5 個樣品聚類，繪制成熱圖.熱圖對應的值為每一行物種相對豐度經過標準化處理后得到的Z值，即一個樣品在某個分類上的Z值為樣品在該分類上的相對豐度和所有樣品在該分類的平均相對豐度的差除以所有樣品在該分類上的標準差所得到的值.

利用SPSS 25.0 進行數據分析，多重比較采用Duncan 檢驗，相關分析采用Pearson 相關系數表示，多元線性回歸分析采用后退法，通徑系數即多元線性回歸中的標準回歸系數.

2 結果與分析

2.1 土壤硝化特征添加NH4+源后，除土樣B 外，其余土樣的NH4+?N 質量比在培養(yǎng)期間隨時間增加下降，特別在培養(yǎng)2 d 后，土樣A、D 和E 的NH4+?N 質量比下降較為迅速，土樣C 則下降幅度較小，可能是硝化作用受到了抑制.培養(yǎng)期間，土樣B 的NH4+?N 質量比增加，可能與礦化作用較強有關(圖1(a))，其原因有待進一步研究.培養(yǎng)初始，土樣C 的NO3??N 質量比最高，且NO3??N 質量比在培養(yǎng)過程中小幅增加，其余土樣在培養(yǎng)2 d 內NO3??N質量比增幅較快，培養(yǎng)2～4 d 時，NO3??N 質量比增加緩慢，土樣D 還出現下降趨勢，可能發(fā)生了微生物固定.培養(yǎng)4 d 后，除土樣C 外，其余土樣的NO3??N 質量比又開始增加，其中，土樣E 增幅最大 (圖1(b)).

圖1 培養(yǎng)期間NH4+?N (a) 和NO3??N (b) 質量比動態(tài)變化Fig.1 Dynamics of soil NH4+?N (a) and NO3??N (b) content in the incubation experiment

5 個土樣0～7 d 凈硝化速率如圖2 所示,5 個土樣的凈硝化速率大小順序為E (7.42 mg·kg?1·d?1) >A (5.91 mg·kg?1·d?1) >D (5.11 mg·kg?1·d?1) >B (4.69 mg·kg?1·d?1) >C (1.83 mg·kg?1·d?1).結合表1 土 壤性質，土樣C 的pH 值最低，為4.44，說明低pH 值能抑制土壤硝化作用.

圖2 各供試土樣0～7 d 的凈硝化速率Fig.2 The net N nitrification rates of the experimented soils from 0 to 7 day

2.2 氨氧化微生物和硝化細菌的相對豐度利用5 個咖啡種植地土樣的微生物樣品16S rDNA 擴增子測序數據[18]，根據物種注釋結果篩選硝化作用相關微生物，結果發(fā)現5 個咖啡種植地土樣是主要由氨氧化古菌（Ammonia-oxidizing archaea,AOA）、氨氧化細菌（Ammonia-oxidizing bacteria,AOB）和亞硝化氧化細菌（Nitrite oxidizing bacteria,NOB）的7 個屬進行硝化作用（圖3）.其中，氨氧化古菌（AOA）可能是云南熱區(qū)咖啡種植地土壤中起主要氨氧化作用的微生物[18].

硝化作用相關微生物的相對豐度在不同產區(qū)和種植年份均存在明顯差異（圖3）.其中，Candidatus Nitrosotalea相對豐度在樣點B 最高，樣點C 和E最低，樣點A 和D 居中（圖4）.從土壤性質來看（表1），氨氧化古菌相對豐度與有效磷含量變化一致，并且，有效磷和速效鉀含量高的樣點A、B 和D，其氨氧化古菌相對豐度高于有效磷和速效鉀含量的低的樣點C 和E.

圖3 云南熱區(qū)咖啡種植地土壤中氨氧化古菌和硝化細菌的相對豐度熱圖Fig.3 Heatmap of relative abundance of ammonia-oxidizing archaea and nitrifying bacteria in coffee-growing regions of Tropical Yunnan

圖4 供試土壤氨氧化古菌Candidatus nitrosotalea相對豐度Fig.4 Relative abundance of Candidatus nitrosotalea (group I.1a-associated ammonia-oxidizing archaea) in soil samples

2.3 凈硝化速率與土壤性質的關系從表2 可知，凈硝化速率與土壤pH 值呈極顯著正相關關系（p<0.01），說明低pH 值能抑制硝化作用.有機碳和全氮與凈硝化速率分別呈極顯著（p<0.01）和顯著負相關關系（p<0.05），并都與土壤pH 值呈極顯著負相關（p<0.01），可能與低pH 值條件下微生物活性受到抑制，導致碳氮轉化速率下降有關.氨氧化古菌相對豐度與有效磷和速效鉀均呈極顯著正相關關系（p<0.01），因為磷、鉀能改善微生物生存的營養(yǎng)環(huán)境，最終，氨氧化古菌豐度得以增加.有機碳與全氮呈極顯著正相關（p<0.01），有機氮一般占全氮的98%以上，土壤氮的含量與供應取決于有機質的積累和分解.

表2 凈硝化速率與土壤性質的相關性Tab.2 Correlation between net nitrification rate and physicochemical properties with soil samples

將凈硝化速率與土壤性質作逐步回歸分析，得到y(tǒng)=? 0.004x1+6.225x2? 26.180 (r2=0.776)，x1為速效鉀，x2為pH 值，通徑系數為x2(0.891) >x1(0.359)，對凈硝化速率影響最大的土壤因子是土壤pH 值，兩者呈正相關關系.

2.4 土壤酸度變化供試土樣在硝化培養(yǎng)期間的pH 值變化見表3.培養(yǎng)1 d 時，一部分略微升高 (土樣A、B 和C)，另一部分土樣pH 值保持不變 (土樣D 和E).培養(yǎng)2 d 時，土樣A、B 和C 的pH 值下降，土樣D 和E 則小幅升高或基本不變.培養(yǎng)4 d時，除土樣C 的pH 值增加外，其余土樣的pH 值在下降.至培養(yǎng)7 d 時，全部土樣的pH 值都有所降低.整個培養(yǎng)期間內，5 個土樣pH 值均下降，幅度分別為0.20、0.22、0.05、0.04 和0.14.結合圖2 來看，除土樣D 外，有較高凈硝化速率的土樣A (5.91 mg·kg?1·d?1)、B (4.69 mg·kg?1·d?1) 和 E (7.42 mg·kg?1·d?1)，其ΔpH 分別為0.20、0.22 和0.14，顯著高于凈硝化速率低的土樣C (1.83 mg·kg?1·d?1)的0.05.土樣D 的凈硝化速率為5.11 mg·kg?1·d?1，但ΔpH 僅為0.04，說明其對酸的緩沖能力較強.結合表1，土樣D 速效鉀含量極高，K+是土壤鹽基離子組分之一，可能其較高的緩沖性能緩解了土壤酸化，具體原因有待進一步研究.

表3 供試土壤培養(yǎng)期間pH 值變化特征Tab.3 Dynamics of pH values of the soil samples during the incubation experiment

3 討論

土壤pH 值是影響硝化作用的重要因子.一般認為低pH 值能抑制土壤硝化作用[19-20]，但pH>4.5 的酸性土壤硝化速率明顯增強[21].本試驗條件下，初始pH 值在4.67～5.04 的土樣（土樣A、B、D和E），凈硝化速率顯著高于初始pH 值4.44 的土樣（土樣C），通徑分析表明土壤pH 是影響凈硝化速率最主要的因素，與前人研究結果一致[13,22].酸性土壤硝化活性提高的主要原因是長期施用氮肥和有機肥，由于NH3或NH4+硝化成NO3?會在其第一個反應步驟，即氨氧化過程中產生2 個H+，硝化作用增強，加速了土壤酸化[5-6，23].本試驗條件下，硝化培養(yǎng)結束時，凈硝化速率高的土樣pH 值下降0.14～0.22，顯著高于凈硝化速率低的土樣的0.05，與前人的報道的pH=4.34～5.14 的土壤其酸化速率與硝化速率呈顯著線性關系一致[24-25].

鹽基離子淋溶是土壤酸化的重要原因[26]，鹽基離子的組成和數量是pH 緩沖容量增加的主要機制[27-28]，如果鹽基離子與致酸離子（交換性H+、Al3+）發(fā)生交換反應，潛性酸含量可能下降，利于減緩酸化.本試驗條件下，凈硝化速率較高的土樣D，硝化培養(yǎng)結束時，pH 僅下降0.04，無酸化現象，推測與其速效鉀含量較高有關.研究表明，土壤pH值與交換性鹽基含量呈顯著正相關關系[29-30]，土壤交換性酸的減少與交換性鹽基的釋放呈線性關系[31-32]，由于缺乏更詳細的結果，需進一步加強鹽基離子與土壤酸化方面的研究.

氨氧化過程主要由氨氧化細菌（AOB）和氨氧化古菌（AOA）驅動.酸性紅壤中AOA 比AOB 與硝化作用的關系更為密切[33-34]，并且有了AOA 是酸性土壤活性氨氧化微生物的直接證據[35].本試驗條件下，在屬水平上的細菌群落的物種豐度聚類分析表明，相對豐度排名前35 的屬，僅發(fā)現AOA Group I.1 a-associated（Candidatus Nitrosotalea），AOB的排名在80 位以后，說明低pH 土壤中AOA 數量占主導優(yōu)勢.盡管本試驗條件下AOA 相對豐度與凈硝化速率沒有關系，但給出了中等酸度土壤（pH=4.44～5.04）AOA 數量高于AOB 的證據.

4 結論

土壤pH 是影響咖啡園酸性土壤硝化作用的重要因子，低pH 值能抑制土壤硝化作用，土壤pH值與凈硝化速率呈正相關關系，凈硝化速率高的土壤酸化明顯.咖啡園酸性土壤AOA 相對豐度高于AOB.在凈硝化速率高的土壤中存在酸化不明顯現象，通過調控鹽基離子增加土壤對酸的緩沖能力的作用機制和實踐需要進一步研究.