廖 磊，劉 浩，趙柳蘭，劉 巧，黃 瑞，劉昌勇，唐小鴻，胡一帆，楊 淞

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，成都 611130)

糖類(碳水化合物)是魚類的重要能源物質(zhì)之一，飼料中添加適宜水平的糖有利于節(jié)約蛋白質(zhì)，降低飼料成本，促進(jìn)魚類生長。但多數(shù)魚類對糖的利用能力有限，特別是肉食性魚類。大口黑鱸()是典型的肉食性魚類，在中國和許多其他國家都是重要的養(yǎng)殖淡水經(jīng)濟(jì)魚類。大口黑鱸的人工養(yǎng)殖受全球水產(chǎn)動物飼料生產(chǎn)趨勢的影響，例如使用高水平的碳水化合物和脂肪以減少飼料中昂貴的蛋白質(zhì)含量。為探求魚類對糖類的利用能力，診斷人類糖尿病的糖耐量實(shí)驗(yàn)已被運(yùn)用于多種魚類的營養(yǎng)研究中，如鯉()、羅非魚()和大黃魚()等。研究發(fā)現(xiàn)大口黑鱸攝食高糖飼料會出現(xiàn)代謝紊亂、肝組織損傷和損害腸道健康等現(xiàn)象。因此，探討大口黑鱸對葡萄糖的耐受能力具有一定的生產(chǎn)意義。

眾所周知，葡萄糖的代謝包括分解代謝和合成代謝過程。魚類消化吸收后開始從糖酵解途徑利用膳食中的碳水化合物，并通過三羧酸循環(huán)產(chǎn)生能量。過量的葡萄糖也可能通過糖異生過程轉(zhuǎn)化為糖原。在體內(nèi)，能量代謝物(例如葡萄糖，丙酮酸和乳酸等)處于動態(tài)平衡狀態(tài)，且受主要飼料營養(yǎng)成分調(diào)節(jié)；已經(jīng)證明調(diào)節(jié)葡萄糖和脂質(zhì)代謝途徑的關(guān)鍵酶對飲食中碳水化合物的攝入有反應(yīng)。因此了解高糖負(fù)荷是否影響葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)過程和葡萄糖代謝酶的活性，是闡釋大口黑鱸對糖利用能力必不可少的步驟。

本研究以大口黑鱸為研究對象，通過腹腔注射高濃度葡萄糖溶液，測定0～48 h過程中血糖濃度、肝臟和肌肉中糖代謝相關(guān)酶的活性和物質(zhì)含量，并檢測肝臟中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)因子的基因表達(dá)，以闡釋大口黑鱸對糖的利用能力。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用大口黑鱸購自眉山市洪氏水產(chǎn)養(yǎng)殖場，在實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)2周后，挑選96尾健康、體質(zhì)強(qiáng)壯、體質(zhì)量(165.42±5.45)g的大口黑鱸作為試驗(yàn)魚。使用0.8%生理鹽水將分析純葡萄糖溶解為400 mg/mL濃度的葡萄糖溶液用于腹腔注射，配置后經(jīng)過高壓蒸汽滅菌后，冷藏于4 ℃冰箱中備用。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與取樣

將禁食24 h的96尾魚隨機(jī)分到容積為(120 cm×40 cm×21 cm)的6個水族箱內(nèi)，對照組(C組)、實(shí)驗(yàn)組(G組)各設(shè)3個重復(fù)，每個水族箱16尾魚。G組腹腔注射2 g/kg體重葡萄糖溶液；為了確保兩個組的注射量相同，C組注射相同劑量的生理鹽水。實(shí)驗(yàn)過程中水環(huán)境如下：溫度，(20.0±0.5)℃；pH 7.5±0.2；溶解氧(DO)>(7.0±0.2)mg/L;氨氮和亞硝酸鹽<0.02 mg/L。

在注射前(0 h)和注射后1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h進(jìn)行采樣，每個時(shí)間點(diǎn)分別從C組和G組中各取6尾魚，用MS-222(濃度為50.0 mg/L)麻醉后采取血液、肝臟和肌肉樣品。血液樣品先用肝素鈉抗凝，室溫靜置30 min，再離心10 min(2 500 r/min)，收集上層血漿。肝臟和肌肉樣品經(jīng)液氮冷凍后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱中保存待測。

1.3 生化指標(biāo)測定

將-80 ℃保存的血漿、肝臟和肌肉組織于冰上解凍，肝臟解凍后加入9倍體積的0.8%預(yù)冷生理鹽水(組織∶生理鹽水=1∶9)，在1.5 mL離心管中使用碾磨器充分研磨，然后在4 ℃，2 500 r/min條件下離心10 min，取上清液進(jìn)行檢測。所有生化檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，并按照試劑盒的說明進(jìn)行操作，利用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測。測定指標(biāo)及試劑盒貨號見表1。

表1 生化檢測試劑盒信息

1.4 RNA提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR

用動物總RNA提取試劑盒(Cat.No.re03011，福際生物，成都)從肝臟中提取總RNA，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量。用RT EasyTM II(with gDNase)試劑盒(CAT No.Rt-01031，福際生物)將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用real-time PCR試劑盒EASYTm-SYbr Green I(Cat.No.Qp-01011，福際生物)檢測mRNA表達(dá)水平。本試驗(yàn)所用引物和定量PCR的步驟參照已發(fā)表的文章，引物信息見表2。目的基因用內(nèi)參基因β-actin的幾何平均值進(jìn)行歸一化，目的基因的相對表達(dá)量采用2法計(jì)算。

表2 熒光定量PCR引物信息

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示(=6)，利用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，先對數(shù)據(jù)作單因素方差分析(One-Way ANOVA)；若統(tǒng)計(jì)結(jié)果有顯著差異，再進(jìn)行Tukey進(jìn)行多重比較，<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 大口黑鱸血糖、糖原和乳酸含量變化

在實(shí)驗(yàn)過程中，各組均無死亡。血糖水平變化如圖1(a)所示，注射生理鹽水的大口黑鱸血糖維持在一個較低且穩(wěn)定的水平；而注射葡萄糖之后，大口黑鱸血糖水平隨著時(shí)間推移呈先上升后下降的趨勢，且在1～24 h的各個檢測時(shí)間點(diǎn)均顯著高于C組，直至48 h恢復(fù)至基礎(chǔ)水平。肝臟和肌肉中糖原含量變化如圖1(b,c)所示，C組和G組大口黑鱸肝糖原含量均現(xiàn)呈先上升后下降的趨勢，但G組含量上升趨勢較大且始終高于C組，在12 h和48 h時(shí)間點(diǎn)顯著高于C組。兩組的肌糖原變化趨勢較小，且兩組之間始終無顯著差異。由圖1(d,e,f)可知，注射葡萄糖后，血液、肝臟和肌肉中乳酸含量均發(fā)生了一定程度的升高；其中G組血液中乳酸含量在24 h和48 h時(shí)間點(diǎn)顯著高于C組，肝臟中乳酸含量在1 h顯著高于C組，肌肉乳酸含量持續(xù)升高且在24 h顯著高于C組。

圖1 注射葡萄糖對大口黑鱸血糖、糖原和乳酸含量影響

2.2 大口黑鱸糖代謝酶活性的變化

肝臟和肌肉中糖代謝酶活性變化如圖2所示。注射葡萄糖后，肝臟和肌肉中糖酵解酶(HK和PK)活性都呈現(xiàn)了先上升后下降的趨勢，并且在一些時(shí)間點(diǎn)顯著高于C組。C組肝臟的PEPCK活性呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢，但變化幅度較??；G組肝臟的PEPCK活性在1 h顯著上升，然后持續(xù)下降并且在12 h顯著低于C組。由圖2(f,g)可知，注射葡萄糖造成了肝臟和肌肉組織中Na-K-ATP酶的活性顯著升高。

圖2 注射葡萄糖對大口黑鱸糖代謝酶活性影響

2.3 大口黑鱸肝臟AMPKα和Glut基因的表達(dá)

大口黑鱸肝臟和基因的表達(dá)情況如圖3所示?？偟膩碚f，C組和G組的相對表達(dá)量均呈現(xiàn)了先上升后下降的趨勢；在2～24 h期間，G組的表達(dá)量幾乎都低于C組，且在2 h具有顯著差異。在注射后2 h至試驗(yàn)結(jié)束期間，G組Glut1的相對表達(dá)量始終低于C組，且在24 h差異顯著。兩組Glut4的表達(dá)量則先升高后降低，G組變化趨勢高于C組，且在2 h達(dá)到最高。

圖3 注射葡萄糖對大口黑鱸肝臟AMPKα和Glut基因表達(dá)的影響

3 討論

3.1 注射葡萄糖對大口黑鱸血糖穩(wěn)態(tài)和糖原積累的影響

不同魚類利用膳食碳水化合物作為能量來源的能力各不相同，肉食性魚類的利用能力一般低于雜食性和草食性魚類。葡萄糖耐量試驗(yàn)被廣泛用于評價(jià)魚類利用碳水化合物的能力，而血糖水平是魚體內(nèi)糖代謝和生理功能狀況的一個重要指標(biāo)，能反映糖類吸收狀況。本實(shí)驗(yàn)中，在注射之前，大口黑鱸被禁食24 h以恢復(fù)本研究中的基礎(chǔ)血糖水平；同時(shí)，注射生理鹽水后的大口黑鱸血糖水平變化較小，表明注射過程和時(shí)間變化對大口黑鱸血糖穩(wěn)態(tài)的影響較小。注射2 g/kg葡萄糖的大口黑鱸血糖升高持續(xù)了24 h以上，在48 h時(shí)檢測到恢復(fù)至基礎(chǔ)水平。已有的研究顯示，雜食性魚類吉富羅非魚()在腹腔注射2 g/kg葡萄糖后，高血糖持續(xù)6 h以上；暗紋東方鲀()在腹腔注1 g/kg葡萄糖后，高血糖會持續(xù)9 h。肉食性魚類虹鱒()在腹腔注射1 g/kg和0.3 g/kg葡萄糖后，高血糖分別持續(xù)24 h和18 h；歐洲海鱸()在腹腔注射1 g/kg葡萄糖后血糖水平上升直到12 h恢復(fù)到基礎(chǔ)水平。從血糖升高情況來看，本實(shí)驗(yàn)中血糖水平在8 h達(dá)到最大值，而其他魚類上的研究顯示，沙重牙鯛()在腹腔注射1 g/kg葡萄糖后血糖在2 h達(dá)到峰值。由此可知，與大多數(shù)肉食性魚類一樣，大口黑鱸糖耐受能力較差，對血液中葡萄糖的清除能力弱，從而表現(xiàn)為持續(xù)的高血糖。Na-K-ATP酶是一種水解酶，水解時(shí)釋放能量，可推動細(xì)胞膜上葡萄糖載體的開動，推動葡萄糖等物質(zhì)的跨膜運(yùn)輸。葡萄糖的運(yùn)輸雖然并不直接利用ATP，但間接利用Na-K泵產(chǎn)生的離子梯度所提供的能量進(jìn)行協(xié)同運(yùn)輸，葡萄糖可利用離子梯度，通過專一的運(yùn)輸載體，伴隨Na運(yùn)輸入細(xì)胞。本研究中，注射葡萄糖后肝臟中Na-K-ATP酶活力在除8 h外其他時(shí)間點(diǎn)均顯著高于對照組，肌肉中除2 h和4 h外也都顯著高于對照組。這表明大口黑鱸可通過增強(qiáng)Na-K-ATP酶活力來推動葡萄糖的跨膜運(yùn)輸，促進(jìn)血液中葡萄糖進(jìn)入組織，從而降低血糖。

通常，攝入后暫時(shí)未利用的葡萄糖也可以轉(zhuǎn)化為糖原儲存，其中肝糖原的合成與分解主要是為了維持血糖濃度的相對恒定，而肌糖原的合成與分解主要是為肌肉提供ATP。已有報(bào)道顯示，魚類在攝食高糖飼料之后，魚體會表現(xiàn)出較高的肝糖原水平。對軍曹魚()和虹鱒等實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)肝糖原含量先上升后下降，未引起肌糖原的明顯增加。本研究發(fā)現(xiàn)，大口黑鱸在注射高濃度葡萄糖后，肝糖原含量逐漸上升至12 h達(dá)最高水平，然后開始下降，肌糖原變化不顯著。這表明大口黑鱸在攝入高糖后能夠?qū)⑻妓衔镛D(zhuǎn)化為肝糖原進(jìn)行能量儲存和代謝。在魚類中，當(dāng)組織能量物質(zhì)沒有通過有氧呼吸或氧不足發(fā)揮作用時(shí)，乳酸濃度會上升。研究表明，隨著飼料中碳水化合物含量的增加，糖代謝會逐漸增強(qiáng)，產(chǎn)生更多的丙酮酸，不可避免地會消耗更多的氧氣，從而造成無氧呼吸增加，乳酸含量增加。本研究中，注射葡萄糖后，肝臟乳酸含量在1 h顯著增加，同時(shí)血液和肌肉中乳酸含量呈現(xiàn)了上升趨勢，這表明葡萄糖負(fù)荷促進(jìn)了大口黑鱸乳酸的生成。

3.2 注射葡萄糖對大口黑鱸糖酵解和糖異生酶活性的影響

魚類同其他動物一樣，糖酵解過程是其主要的葡萄糖代謝途徑，HK和PK酶是糖酵解過程中的限速酶。本研究中，注射葡萄糖后，大口黑鱸肝臟和肌肉組織中兩種酶的酶活性都呈現(xiàn)了先上升后下降的趨勢。在其他魚類上的研究顯示，大黃魚和鯉魚在葡萄糖注射后，HK酶活性先增大后減少；羅非魚注射葡萄糖后，HK酶活性沒有顯著變化；以上的結(jié)果表明了HK酶在糖酵解過程中的關(guān)鍵性地位，葡萄糖注射會提高HK活力。PK是促進(jìn)丙酮酸生成的關(guān)鍵酶，研究表明飼料中碳水化合物的比例會對PK的活性具有一定的影響。青魚()肝胰臟和肌肉部位中PK活性會隨著飼料中糖類的增加而顯著提高；鯉魚在注射葡萄糖后血漿中的PK活性呈先上升后下降的趨勢。本研究結(jié)果與以上報(bào)道基本一致，表明高糖負(fù)荷促進(jìn)了大口黑鱸糖酵解酶HK和PK活性的上升，從而加強(qiáng)了糖酵解過程。

在健康的條件下，肝臟也可以通過抑制肝臟糖異生來處理葡萄糖負(fù)荷。PEPCK能催化草酰乙酸脫羧轉(zhuǎn)變?yōu)榱姿嵯┐际奖幔翘钱惿緩降年P(guān)鍵限速酶。多項(xiàng)研究表明糖尿病患者的肝臟糖異生關(guān)鍵酶PEPCK表達(dá)量均明顯升高，這表明控制PEPCK酶活性對維持正常血糖水平有著重要意義。魚類上的研究發(fā)現(xiàn)，暗紋東方鲀在注射葡萄糖后，PEPCK活性呈現(xiàn)不規(guī)律變化，在4、8 h顯著升高，其余時(shí)間點(diǎn)無顯著差異；葡萄糖注射對羅非魚肝臟中PEPCK的表達(dá)和酶活性均未造成顯著影響。與以上結(jié)果相似，本研究中注射葡萄糖的大口黑鱸肝臟PEPCK活性呈現(xiàn)無規(guī)律變化，在1、24 h顯著升高，其余時(shí)間點(diǎn)均低于對照組但無顯著差異，這表明大口黑鱸不能有效地處理葡萄糖負(fù)荷。以往研究也報(bào)道了肉食性魚類不能有效調(diào)節(jié)其糖異生，這被認(rèn)為是其糖耐量能力較低的主要原因之一。

3.3 注射葡萄糖對大口黑鱸葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的影響

AMP活化蛋白激酶(AMPK)是一種作為能量傳感器的關(guān)鍵酶，當(dāng)細(xì)胞中ATP/AMP比值降低時(shí)，該酶會被激活。作為營養(yǎng)感應(yīng)傳導(dǎo)分子，AMPK激活對糖代謝調(diào)節(jié)的影響是重要的，可調(diào)控葡萄糖吸收、糖原代謝、糖異生和脂肪生成過程。在大鼠腎小球系膜細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，高糖孵育造成了其總AMPKα蛋白和磷酸化AMPKα蛋白表達(dá)水平均低。本研究中，注射葡萄糖造成了的mRNA水平下調(diào)，這可能是由于葡萄糖攝入后ATP生成量增加了，從而下調(diào)了基因表達(dá)。因?yàn)锳MPK活化對營養(yǎng)代謝調(diào)節(jié)的總方向是抑制ATP消耗過程，促進(jìn)ATP的生成反應(yīng)。

肝臟和血液中葡萄糖濃度保持平衡是由于多種葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體的存在，它們介導(dǎo)了一個雙向的、能量獨(dú)立的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)過程。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體(Glut)轉(zhuǎn)移率的提高是AMPK發(fā)揮促進(jìn)葡萄糖吸收的重要原因，Glut l和Glut 4在生物體中廣泛分布，參與轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖，其中Glut l被認(rèn)為是種葡萄糖傳感器。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)羅非魚餐后血糖水平升高時(shí)，1～3 h肝臟1和2的表達(dá)均降低；另外的研究報(bào)道了羅非魚肌肉中4 mRNA的相對表達(dá)量在注射葡萄糖后3 h開始升高,在12 h時(shí)達(dá)到最高。在本研究中，注射葡萄糖的大口黑鱸肝臟1 mRNA的表達(dá)水平始終低于對照組，4先升高后降低。因此，我們推測肉食性大口黑鱸4表達(dá)上調(diào)可能參與了肝臟葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，而被高糖水平抑制。

4 結(jié)論

總的來說，作為肉食性魚類的大口黑鱸對葡萄糖的耐受能力較低，表現(xiàn)為對血液中葡萄糖的清除能力弱。在高糖負(fù)荷條件下，糖酵解過程被加強(qiáng)，也促進(jìn)了乳酸和糖原的生成。然而糖異生途徑的關(guān)鍵酶PEPCK活性不能被高濃度葡萄糖抑制，這可能導(dǎo)致內(nèi)源性葡萄糖不斷被合成而使大口黑鱸血糖持續(xù)偏高。此外，Na-K-ATP酶、AMPKα和Glut4可能參與了高糖負(fù)荷條件下的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，這對血糖的穩(wěn)態(tài)具有重要意義。