張 鵬，薛世玉，李小飛，徐大平，崔之益

(中國林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所，廣東 廣州 510520)

白木香（Aquilaria sinensis(Lour.) Spreng.）又稱土沉香、香樹、女兒香、牙香樹，是瑞香科（Thymelaeaceae）沉香屬（Aquilaria）常綠喬木，為我國特有珍貴藥用植物、國家二級重點保護(hù)野生植物[1-2]。白木香受到外界脅迫后能產(chǎn)生沉香，是我國生產(chǎn)沉香的重要植物資源。沉香是名貴的傳統(tǒng)中藥材[3]，也是一種天然的高級香料[4-6]，同時在世界五大宗教中備受推崇[7]。由于沉香在藥用、香料、宗教、收藏等方面的廣泛用途，使其在國內(nèi)外供不應(yīng)求[8-9]。為了沉香資源的可持續(xù)利用，培育沉香人工林與人工誘導(dǎo)結(jié)香是目前解決沉香緊缺的有效途徑。

物理機(jī)械損傷、化學(xué)物質(zhì)刺激以及微生物與病蟲害侵染均能誘導(dǎo)沉香形成。物理、化學(xué)或生物因素都是沉香形成的誘因，它們作為激發(fā)子誘導(dǎo)沉香樹防御反應(yīng)的發(fā)生，使沉香樹體產(chǎn)生具有防御作用的次生代謝產(chǎn)物（倍半萜和2-（2-苯乙基）色酮類物質(zhì)），這些次生代謝產(chǎn)物與細(xì)胞其他組分復(fù)合形成導(dǎo)管填充物（侵填體），對沉香次生木質(zhì)部導(dǎo)管造成堵塞，從而抵御外界物理機(jī)械損傷、化學(xué)物質(zhì)刺激以及微生物與病蟲害侵染對沉香樹體的進(jìn)一步傷害，最終形成沉香[10]。

目前，關(guān)于白木香的結(jié)香機(jī)理尚未有定論，對沉香形成的研究主要集中在沉香組成成分分析[11-12]、沉香形成機(jī)理假說驗證[10,13-14]、人工誘導(dǎo)結(jié)香方法[15-16]、沉香物質(zhì)合成代謝途徑以及形成過程信號調(diào)控機(jī)制等方面[17-18]。雖然前人對白木香結(jié)香過程中的防御反應(yīng)已有大量研究[19-20]，但對與其生長相關(guān)的內(nèi)源激素、光合、熒光等生理特性缺乏關(guān)注。鑒于白木香的結(jié)香過程不僅是沉香屬植物進(jìn)行脅迫防御的過程，也是一種防御與生長的動態(tài)平衡過程。因此，研究白木香結(jié)香過程的防御與生長的動態(tài)平衡狀態(tài)，對揭示其結(jié)香機(jī)制，促進(jìn)白木香結(jié)香具有重要意義。

本研究應(yīng)用注射真菌菌劑與機(jī)械損傷2 種誘導(dǎo)結(jié)香方法對白木香進(jìn)行脅迫制香，通過分析其調(diào)控生長與防御的激素含量、抗氧化酶活性、防御物質(zhì)總酚與總萜含量以及光合與葉綠素?zé)晒馓匦缘?，研究白木香對真菌侵染及機(jī)械損傷脅迫的生理響應(yīng)，以期探明白木香結(jié)香過程的生長與防御過程，揭示其結(jié)香過程的生理響應(yīng)機(jī)制，為促進(jìn)白木香結(jié)香提供理論依據(jù)。

1 研究方法

1.1 試驗材料與設(shè)計

試驗于2020 年9 月在廣西省北流市石窩鎮(zhèn)良沖沉香產(chǎn)業(yè)示范園進(jìn)行（22°15′ N, 110°50′ E, 海拔426 m）。選取生長健壯、無病蟲害、生長環(huán)境相同、長勢一致的3 年生普通白木香，分別設(shè)置生物誘導(dǎo)（注射真菌菌劑）、物理誘導(dǎo)（樹干鉆孔）與空白對照3 種處理，每組處理選取10 株樣本，3 次重復(fù)，共計30 株。普通白木香平均樹高與地徑（距地面10 cm 直徑）分別為（2.95±0.66）m、（6.44±1.49）cm。

1.1.1 真菌脅迫組設(shè)置 采用直徑0.5 cm 鉆頭的電鉆在樹干兩側(cè)距離地面80 cm 處分別鉆孔，以打點滴輸液方式注入配好的菌液（黑綠木霉菌 +腐皮鐮孢菌 + 龍眼焦腐菌（菌液體積比1:1:1））250 mL，真菌誘導(dǎo)結(jié)香實驗菌液配比方法參照宋曉琛等[21]方法，略有改動。

1.1.2 機(jī)械損傷脅迫組設(shè)置 采用直徑0.5 cm 鉆頭的電鉆在樹體的基部0.5 m 處直至樹干頂端（直徑約5 cm）全面打洞鉆孔，上下洞口相距5 cm。

分別于處理后第1、3、6 個月，選取中上部枝條頂端下第3～4 片生長健壯的成熟功能葉，進(jìn)行光合及熒光指標(biāo)測定；同時，每個處理隨機(jī)選擇6 株樹，將其鉆孔傷口上方1 cm 處的適量木塊取下，取樣后用錫箔紙包好，迅速放入液氮中直至冷凍徹底，運回實驗室后，將液氮速凍樣品放置于?80 ℃的超低溫冰箱中保存，用于生理生化指標(biāo)測定。

1.2 生理指標(biāo)測定

1.2.1 激素含量、抗氧化酶活性與防御物質(zhì)含量測定 使用酶聯(lián)免疫法測定白木香莖干內(nèi)源激素(茉莉酸（JA）、水楊酸（SA）、乙烯前體（ACC）)的含量和抗氧化酶（過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、多酚氧化酶（PPO）、抗壞血酸氧化酶（APX）、谷胱甘肽還原酶（GR））活性。次生代謝防御物質(zhì)總酚類（Phenol）與總萜類（Terpene）分別以沒食子酸、芳樟醇作為標(biāo)準(zhǔn)品，使用分光光度測定其含量[22-23]，且均以鮮質(zhì)量計。

1.2.2 光合指標(biāo)測定 在晴朗天氣的上午9：00—11：30，利用光合儀（Li-6400 XT），在飽和光強(qiáng)下完成光誘導(dǎo)，穩(wěn)定后測定葉內(nèi)氣體交換參數(shù)，包括凈光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（Gs）、胞間CO2濃度（Ci）和蒸騰速率（Tr），每組測定3 株，每株測定3 次。測定時設(shè)定光合有效輻射為1 500 μmol·m?2·s?1，相對濕度為60%～70%，葉室溫度為20 ℃，CO2濃度為400～410 μmol?mol?1[24]。

1.2.3 葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定 利用便攜式脈沖調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨x（OPTI-Sciences OS5P，USA）于天氣晴朗的上午9：00—11：30 進(jìn)行葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定，每組測定3 株，每株測定3 次，取平均值。在光照充足下進(jìn)行，將葉夾夾在葉片中部，葉片暗適應(yīng)30 min 后，先測定吸光系數(shù)、初始熒光（F0），照射一個飽和脈沖光（2 500 μmol·m?2·s?1）后，測量最大熒光（Fm）、可變熒光（Fv）、PS Ⅱ原初光能轉(zhuǎn)化效率（Fv/Fm）和PSⅡ潛在活性（Fv/F0）等。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行顯著性分析，單因素方差分析（One-way ANOVA）白木香不同脅迫處理間與受脅迫不同時間各指標(biāo)的差異，Duncan法進(jìn)行多重比較，顯著性檢驗α=0.05，Excel 2016制表做圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 真菌侵染（BS）及機(jī)械損傷(AS)對白木香內(nèi)源激素含量的影響

圖1 表明：與對照相比，在受脅迫1 個月與3 個月時，激活防御反應(yīng)的激素茉莉酸、水楊酸、乙烯前體含量都上調(diào)，含量基本顯著高于對照（脅迫3 個月的水楊酸除外），而負(fù)責(zé)協(xié)調(diào)植物生長的赤霉素與生長素的含量顯著低于對照；在受脅迫6 個月后，水楊酸與赤霉素含量在AS 處理中與對照差異不顯著，同時生長素含量在3 組處理間均無顯著差異。

注：圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，不同大寫字母表示處理間在同一時間差異顯著（p＜0. 05）。不同小寫字母表示同一處理在不同時間間差異顯著（p＜0. 05）。CK: 對照；BS：真菌侵染；AS：機(jī)械損傷。下同。Notes: Data are presented in the mean ± SE．Different capital letters indicate the significant differences atp＜0. 05 level among treatments at the sampling time．Different small letters indicate that the same treatment has significant differences atp＜0. 05 level in the different sampling time． CK: control check; BS: biological Stress; AS: abiotic stress. The same below．

隨脅迫處理時間的延長，茉莉酸、水楊酸與乙烯前體含量逐步降低，而赤霉素與生長素的含量在白木香莖干中逐漸增加。脅迫第6 個月與第1 個月相比，茉莉酸含量在BS 和AS 脅迫中分別顯著降低了20.78%、18.00%，水楊酸含量分別顯著降低了18.22%、15.98%；而赤霉素含量分別顯著增高了33.98%、34.63%，生長素含量分別顯著增高了17.55%、16.92%。

2.2 真菌侵染（BS）及機(jī)械損傷（AS）脅迫對白木香抗氧化酶活性的影響

由圖2 可知：在脅迫1 個月時，BS 和AS 的6 種抗氧化酶活性都顯著高于對照；在脅迫3 個月時，除APX 與GR 外，其余4 種抗氧化酶活性也顯著高于對照；在脅迫6 個月時，SOD，CAT，PPO，APX 的活性均與對照無顯著差異。

圖2 不同脅迫對白木香抗氧化酶活性的影響Fig. 2 Effect of different stress on the antioxidant enzyme activity ofAquilaria sinensis

2.3 真菌侵染（BS）及機(jī)械損傷（AS）脅迫對白木香防御物質(zhì)的影響

圖3 表明：在脅迫1 個月時，總酚與總萜含量與對照差異顯著，其中，BS 和AS 的總酚含量分別比對照增加了57.10%、33.10%，總萜含量分別增加了54.02%、27.33%；當(dāng)脅迫6 個月時，BS 和AS 的總酚含量分別是對照的1.90、1.71倍，總萜含量分別是對照的2.24、2.20 倍。

圖3 不同脅迫對白木香總酚和總萜含量的影響Fig. 3 Effect of different stress on the total phenols and total terpenes ofAquilaria sinensis

在受脅迫過程中，總酚和總萜含量隨時間的延長而增加，其中，BS 的總酚含量第3 個月與第6 個月分別比第1 個月增加了26.34%、42.32%，總萜類含量分別比第1 個月增加了16.39%、35.54%；AS 的總酚含量第3 個月與第6 個月分別比第1 個月增加了40.10%、50.78%，總萜含量分別比第1 個月增加了13.83%、61.36%。

2.4 真菌侵染（BS）及機(jī)械損傷(AS)脅迫對白木香光合作用的影響

由圖4 可知：與對照相比，在BS 和AS 脅迫1 個月時，白木香葉片的Pn、Gs、Tr和WUEi均下降，而Ls增加，其中，BS 和AS 脅迫的Pn分別下降了27.47%、25.23%，Gs分別下降了28.97%、20.11%，Tr分別下降了23.90%、11.63%，WUEi分別下降了4.83%、15.50%，Ls分別增加了14.61%、6.96%。

圖4 不同脅迫對白木香光合參數(shù)的影響Fig. 4 Effect of different stress on photosynthetic parameters ofAquilaria sinensis

在脅迫6 個月時，AS 處理的Pn與對照無顯著差異，BS 脅迫的Pn與對照差異顯著，BS 和AS 處理的Gs、Ci、Tr顯著高于對照，而Ls比對照分別降低了11.45%、25.70%。

2.5 真菌侵染（BS）及機(jī)械損傷(AS)脅迫對白木香葉綠素?zé)晒獾挠绊?/h3>

由表1 可知：受到脅迫后F0較對照顯著增加，但隨時間的延長增幅變??；脅迫1 個月時，BS 和AS 處理的F0較對照分別增加了37.19%、33.02%；脅迫3 個月時，BS 和AS 處理的F0較對照分別增加了25.25%、18.83%；脅迫6 個月時，BS 和AS 處理的F0較對照分別增加了7.30%、12.04%。

表1 不同脅迫對白木香葉綠素?zé)晒獾挠绊慣able 1 Effect of different stress on chlorophyll fluorescence parameters ofAquilaria sinensis

脅迫1 個月與3 個月時，BS 和AS 處理的Fm、Fv與對照差異顯著，而脅迫6 個月時，BS 和AS 處理的Fm、Fv與對照差異不顯著。

BS 和AS 處理后，葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm與Fv/F0均顯著下降，隨處理時間的延長降幅減?。幻{迫1 個月時，BS 和AS 處理的Fv/Fm較對照分別下降9.88%、12.35%；脅迫6 個月時， BS和AS 處理的Fv/Fm較對照分別下降了2.47%、3.70%。脅迫1 個月時，BS 和AS 處理的Fv/F0較對照分別下降了38.48%、41.94%。脅迫6 個月后， BS 和AS 處理的Fv/F0較對照分別下降了11.11%、14.25%。

3 討論

3.1 真菌侵染(BS)及機(jī)械損傷(AS)脅迫對白木香內(nèi)源激素的影響

植物的防御反應(yīng)依賴于各種信號通路的復(fù)雜相互作用，每一種激素啟動一個特定的分子途徑，這些不同的激素途徑被整合在一個協(xié)同、拮抗和相互作用的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)中[25]。在脅迫條件下，防御反應(yīng)會被激活，然而，作為防御反應(yīng)的一部分，植物生長會受到抑制。此外，防御反應(yīng)中的植物激素（包括茉莉酸、水楊酸、乙烯、脫落酸）通常與生長相關(guān)的激素（如赤霉素、油菜素內(nèi)酯、細(xì)胞分裂素和生長素）起拮抗作用[26-27]。

本研究中，在脅迫初期，防御相關(guān)的激素含量上調(diào)，而負(fù)責(zé)生長的激素含量降低，表明白木香的防御反應(yīng)被激活，防御反應(yīng)占主導(dǎo)地位。在脅迫6 個月后，很多激素含量處理與對照之間差異不顯著，表明無論是防御類激素還是生長類激素都朝著正常生長狀態(tài)靠近。研究表明，隨著脅迫持續(xù)時間和強(qiáng)度的變化，各激素信號通路的拮抗和協(xié)同互作，在植物應(yīng)對各種脅迫時平衡著生長與防御，調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育[28]。

3.2 真菌侵染(BS)及機(jī)械損傷(AS)脅迫對白木香抗氧化酶的影響

植物在逆境脅迫下產(chǎn)生的超氧陰離子自由基（O2?-）等易造成膜脂過氧化，而植物抗氧化酶系統(tǒng)能夠降低產(chǎn)生的O2?-量，從而維持植株的正常生長[29]。通過抗氧化酶系統(tǒng)中的過氧化氫酶、過氧化物酶以及超氧化物歧化酶能將植物體內(nèi)過氧化物自由基分解清理[30]。多酚氧化酶與酚類物質(zhì)反應(yīng)生成醌類物質(zhì)，可增加植物對生物脅迫和非生物脅迫的抗性[31]?？箟难嵫趸概c其它氧化還原反應(yīng)相偶聯(lián)起到末端氧化酶的作用，能催化抗壞血酸的氧化[32]。谷胱甘肽還原酶將氧化型谷胱甘肽還原成還原型谷胱甘肽，從而為活性氧的清除提供還原力，保護(hù)植物免受傷害[33]。

本研究中，隨著脅迫時間的延長，抗氧化酶活性隨著減少。植物的脅迫反應(yīng)涉及動態(tài)的生長調(diào)節(jié)，脅迫條件下生長受到限制，當(dāng)條件改善后，迅速恢復(fù)[34]。夏蘊等[35]研究也表明，當(dāng)植物脅迫條件減輕或者消失時，其抗氧化酶活性增幅也隨之減少，與本研究結(jié)果類似。

3.3 真菌侵染(BS)及機(jī)械損傷(AS)脅迫對白木香防御物質(zhì)的影響

植物受到脅迫時能激活自身防御反應(yīng)，啟動次生代謝合成，可產(chǎn)生萜類、酚類、含氮化合物，有利于防御自身和抵御生物和氧化物質(zhì)的傷害[36]。張爭等[37]在白木香的研究中表明，萜類含量增多是植物啟動相應(yīng)的防御反應(yīng)和抵御傷害脅迫的重要機(jī)制。

與對照相比，受脅迫白木香中的總酚與總萜含量差異顯著，且隨脅迫時間的延長總酚和總萜含量增加。此外，BS 處理的總酚與總萜含量高于AS處理，表明真菌侵染對于白木香來說脅迫強(qiáng)度可能更大，對其損傷更嚴(yán)重。白木香防御外界傷害的次生代謝產(chǎn)物，凝結(jié)于木材內(nèi)，形成了沉香，而隨脅迫時間的累積，沉香物質(zhì)也在不斷積累，從而使沉香的產(chǎn)量增加[6]。

3.4 真菌侵染(BS)及機(jī)械損(AS)傷脅迫對白木香光合作用的影響

當(dāng)植物受到脅迫時光合作用受阻，凈光合速率降低[38]。本研究中，BS 和AS 脅迫3 個月時，白木香葉片的Pn、Gs、Tr 和WUEi較對照基本下降，而Ls增加。Pn、Gs和Ci值三者同時降低，說明光合作用受氣孔限制影響[39]。BS 和AS 脅迫對白木香莖干部分造成了損傷，影響了植物水分運輸，減少光合作用原料供給，從而使氣孔部分關(guān)閉，進(jìn)而影響植物的光合速率。在AS 脅迫6 個月時，Pn與對照無顯著差異，BS 脅迫的Pn與對照差異顯著。相對于AS，BS 處理可能對白木香所造成的脅迫強(qiáng)度更大，損傷更嚴(yán)重，意味著白木香在受到脅迫后也在不斷的修復(fù)損傷情況，恢復(fù)最佳生長的狀態(tài)。華建峰等[40]對脅迫解除后中山杉的生長和光合特性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其能夠通過合理調(diào)整生長和光合策略得到恢復(fù)。

3.5 真菌侵染(BS)及機(jī)械損傷(AS)脅迫對葉綠素?zé)晒獾挠绊?/h3>

葉綠素?zé)晒鈪?shù)可用來評價植物生理變化和光能利用[39,41]。BS 和AS 處理的葉綠素?zé)晒鈪?shù)較對照差異顯著，但隨脅迫時間的延長差異變小，其中，F(xiàn)0值增加，說明PSⅡ受到損傷[42]。Fv/Fm與Fv/F0均顯著下降，說明真菌及機(jī)械損傷脅迫使白木香PSⅡ等光合機(jī)構(gòu)遭受傷害，光化學(xué)活性降低，產(chǎn)生了光抑制。光能在葉片中不能順利轉(zhuǎn)化為化學(xué)能，過剩的激發(fā)能易使光合機(jī)構(gòu)受到損傷從而導(dǎo)致光破壞[43]。在受脅迫6 個月時，F(xiàn)v/Fm與Fv/F0降幅減小，表明白木香光合組織的光系統(tǒng)（PSⅡ）在損傷后得到了一定修復(fù)[44]。

4 結(jié)論

綜上所述，當(dāng)白木香受到真菌侵染與機(jī)械損傷脅迫時，激活防御反應(yīng)的激素含量顯著升高，抗氧化酶活性增加，同時防御次生代謝產(chǎn)物酚類與萜類增加，光合作用受到抑制；而隨著時間的推移，白木香生長獲得恢復(fù)，脅迫得到緩解，表明白木香結(jié)香過程是生長與防御的動態(tài)平衡過程。本文研究了白木香對真菌侵染與機(jī)械損傷脅迫的生理響應(yīng)特征，初步闡述了白木香結(jié)香過程的生長與防御過程，為進(jìn)一步揭示其結(jié)香生理機(jī)制奠定基礎(chǔ)，為促進(jìn)白木香結(jié)香提供理論依據(jù)。在今后的研究中可考慮定期對白木香進(jìn)行脅迫，使其維持高強(qiáng)度防御狀態(tài)，提高沉香成分等次生代謝產(chǎn)物的合成，進(jìn)而促進(jìn)白木香結(jié)香。