黃小征 吳江華 周立新 宋志杰 徐婉彤 賈玲 刁新婷 吳琪 林冬梅

近年來，基于程序性死亡受體1（programmed cell death 1, PD-1）/程序性死亡配體1（programmed cell death ligand 1, PD-L1）的免疫檢查點(diǎn)抑制劑（immune checkpoint inhibitors, ICI）的免疫治療為晚期非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）患者帶來了新的希望[1]。PD-L1作為肺癌免疫治療的預(yù)測生物標(biāo)志物，其臨床應(yīng)用價值在近年的大量臨床研究中被證實，并被美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（National Comprehensive Cancer Network, NCCN）指南推薦作為NSCLC病理常規(guī)檢測項目。通過NSCLC樣本組織的免疫組織化學(xué)染色（immunohistochemistry, IHC）檢測腫瘤細(xì)胞的PD-L1表達(dá)狀態(tài)，即腫瘤陽性比例評分（tumor proportion score, TPS）可預(yù)測NSCLC免疫治療藥物的療效，對篩選治療獲益人群具有重要臨床意義[2-5]。

在臨床實踐中，用于PD-L1檢測的樣本主要依賴于臨床實踐操作獲取的組織樣本。晚期NSCLC常伴有多發(fā)性遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。除肺部原發(fā)的腫瘤外，來自轉(zhuǎn)移部位的組織樣本，如淋巴結(jié)、骨、腎上腺等肺外轉(zhuǎn)移的樣本也常用于PD-L1檢測。多項研究[6-8]表明PD-L1的表達(dá)存在時間和空間的異質(zhì)性，可在腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移進(jìn)展過程中產(chǎn)生變化，從而為晚期肺癌患者PD-L1的精準(zhǔn)檢測和樣本選擇帶來了挑戰(zhàn)。取材于轉(zhuǎn)移部位NSCLC組織樣本的PD-L1評分是否與肺內(nèi)腫瘤組織樣本具有異質(zhì)性差異仍是臨床檢測所關(guān)注的重點(diǎn)問題[9]。由于臨床實踐中通常難以同時獲取同一患者的多發(fā)轉(zhuǎn)移瘤樣本，因此PD-L1不同瘤灶間空間異質(zhì)性的直接對比研究缺乏較大樣本量的研究結(jié)果。目前國內(nèi)仍缺乏相關(guān)臨床研究數(shù)據(jù)表明不同部位NSCLC組織樣本的PD-L1表達(dá)檢測結(jié)果差異以及對免疫治療獲益人群預(yù)測的影響。

在本研究中，我們通過收集臨床病理實際檢測的病例，對NSCLC不同轉(zhuǎn)移部位樣本的PD-L1表達(dá)水平檢測結(jié)果和同期的肺內(nèi)腫瘤PD-L1表達(dá)的檢測結(jié)果進(jìn)行對比研究，探討肺外樣本與肺內(nèi)樣本的PD-L1評分差異以及轉(zhuǎn)移部位對腫瘤PD-L1表達(dá)空間異質(zhì)性的潛在影響，這對晚期肺癌患者的PD-L1檢測策略具有重要幫助。

1 資料和方法

1.1 病例收集 研究回顧性收集了2020年6月-2021年4月期間北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院和天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院病理科PD-L1（22c3抗體）連續(xù)的臨床實際檢測的病例，均為初治患者并排除曾行新輔助治療或既往肺癌治療史的病例。最終納入分析的病例為共計1,103例，包含629例活檢以及474例手術(shù)樣本的病理資料；其中轉(zhuǎn)移性腫瘤131例，同期非配對肺內(nèi)腫瘤972例。131例轉(zhuǎn)移性NSCLC中，轉(zhuǎn)移部位包括淋巴結(jié)60例（局部轉(zhuǎn)移12例和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移48例），腦16例、骨23例、胸膜10例、其他胸外實體器官16例（腎上腺9例、肝7例）、軟組織6例。研究收集了組織病理蠟塊的PD-L1（22c3抗體）臨床病理科常規(guī)檢測的切片，同時研究收集了臨床病理特征資料包括性別、年齡、病理類型、吸煙狀況以及已行檢測的肺癌驅(qū)動基因表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）突變狀況等。本研究由北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院倫理委員會（編號2018KT94）和天津市腫瘤醫(yī)院倫理委員會（編號Ek2020140）批準(zhǔn)。

1.2 PD-L1染色和判讀 在本研究中所收集的PD-L1切片均是使用PD-L1 22c3抗體試劑盒（Dako, Carpinteria, CA,USA）和相應(yīng)的Dako檢測平臺進(jìn)行的標(biāo)準(zhǔn)化染色。根據(jù)PD-L1 22c3抗體試劑盒設(shè)定的標(biāo)準(zhǔn)化程序，使用Dako-Link AS-48自動免疫組化儀器對4 μm腫瘤組織切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。PD-L1 22c3抗體染色的結(jié)果判讀使用TPS，即陽性腫瘤細(xì)胞數(shù)占腫瘤細(xì)胞總數(shù)的比例×100%。由于所收集的PD-L1評分檢測結(jié)果均是由受過專門培訓(xùn)的醫(yī)師所簽發(fā)，因此，本研究中TPS評分采用臨床實際檢測報告結(jié)果。根據(jù)目前對PD-L1 22c3抗體的臨床應(yīng)用指南，當(dāng)TPS≥1%時視為PD-L1陽性表達(dá)；TPS為1%-49%時視為PD-L1低表達(dá)；TPS≥50%時視為PD-L1高表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計分析 當(dāng)PD-L1作為一個連續(xù)變量進(jìn)行分析時，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗比較組間差異，并使用Kruskal-Wallis檢驗進(jìn)行多組間的差異比較。采用卡方檢驗和Logistic回歸分析臨床病理參數(shù)與PD-L1表達(dá)分類變量之間的關(guān)系。使用SPSS統(tǒng)計軟件22版（IBM Corp., Armonk, NY）進(jìn)行統(tǒng)計分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病例資料 在131例轉(zhuǎn)移性NSCLC中，男性72例（55.0%），女性59例（45.0%）；平均年齡59.93歲，范圍33歲-82歲。轉(zhuǎn)移性肺腺癌111例（84.7%），鱗狀細(xì)胞癌16例（12.2%），非特殊型或其他少見類型4例（3.1%）。在79例臨床已檢測EGFR的病例中，42例（53.2%）具有EGFR突變。同期972例肺內(nèi)腫瘤中，男性537例（55.2%），女性435例（44.8%），平均年齡62.34歲，范圍26歲-85歲，在450例臨床已檢測EGFR的病例中，243例（54.0%）具有EGFR突變。腺癌766例（78.8%），鱗狀細(xì)胞癌177例（18.2%），非特殊型或其他少見類型29例（3.0%）。

2.2 肺外轉(zhuǎn)移樣本和肺內(nèi)樣本的PD-L1檢測結(jié)果差異 肺外轉(zhuǎn)移樣本中，PD-L1表達(dá)的TPS評分平均值為26.24%，PD-L1陽性表達(dá)率為61.83%（81/131），高表達(dá)率為26.72%（35/131）；而肺內(nèi)樣本，TPS評分平均值為17.87%，陽性表達(dá)率為53.50%（520/972），高表達(dá)率為17.90%（174/972）。肺外樣本的TPS評分顯著高于肺內(nèi)樣本（P=0.03）。

研究比較了不同轉(zhuǎn)移部位樣本的PD-L1的陽性率差異。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移樣本PD-L1陽性率為60.00%（36/60），其中低表達(dá)率為33.33%（20/60），高表達(dá)率為26.67%（16/60）。其中，局部區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移樣本PD-L1陽性表達(dá)率為58.33%（7/12），與遠(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶（60.42%, 29/48）相當(dāng)。肺外實質(zhì)器官轉(zhuǎn)移樣本中，肝轉(zhuǎn)移樣本PD-L1陽性表達(dá)率最高（85.71%, 6/7），其次為腎上腺轉(zhuǎn)移樣本（77.78%,7/9）。軟組織轉(zhuǎn)移樣本PD-L1陽性表達(dá)率為66.67%（4/6），腦轉(zhuǎn)移瘤為62.50%（10/16），骨轉(zhuǎn)移瘤為60.87%（14/23）；而胸膜轉(zhuǎn)移瘤陽性表達(dá)率較低（40.00%, 4/10）（表1，圖1A）。

進(jìn)一步比較不同部位樣本的PD-L1評分差異，顯示不同部位樣本中TPS檢測結(jié)果具有顯著差異（P=0.007，Kruskal-Wallis檢驗）。肝臟轉(zhuǎn)移樣本的平均TPS評分最高，為61.71%，其次腎上腺轉(zhuǎn)移樣本為47.78%，兩者均顯著高于肺內(nèi)樣本的TPS評分（17.87%）（分別為P＜0.001、P=0.002，獨(dú)立樣本t檢驗）。軟組織、腦、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移樣本的TPS評分分別為30.83%、28.13%和24.22%，均略高于同期肺內(nèi)腫瘤，而骨轉(zhuǎn)移和胸膜轉(zhuǎn)移樣本的TPS評分較低，分別為16.96%和9.70%，統(tǒng)計顯示這些轉(zhuǎn)移部位的TPS評分與肺內(nèi)樣本相比均無顯著差異（表1，圖1B）。

表1 NSCLC原發(fā)腫瘤和不同部位轉(zhuǎn)移性腫瘤的PD-L1表達(dá)狀況Tab 1 PD-L1 expression in primary and metastatic NSCLC

2.3 肺外轉(zhuǎn)移樣本和肺內(nèi)樣本不同組織學(xué)類型的PD-L1表達(dá)比較 111例肺外腺癌樣本中，TPS評分平均值為27.14%，PD-L1陽性表達(dá)率為62.16%（69/111），高表達(dá)率為27.93%（31/111）；766例肺內(nèi)腺癌樣本中，TPS評分平均值為15.75%，PD-L1陽性表達(dá)率為49.22%（377/766），高表達(dá)率為15.80%（121/766）。兩者比較顯示，肺外腺癌樣本的TPS評分顯著高于肺內(nèi)腺癌樣本（P＜0.001）。

16例肺外鱗狀細(xì)胞癌樣本中，TPS評分平均值為25.00%，PD-L1陽性表達(dá)率為62.50%（10/16），高表達(dá)率為25.00%（4/16）；177例肺內(nèi)鱗狀細(xì)胞癌樣本中，TPS評分平均值為25.15%，PD-L1陽性表達(dá)率為70.06%（124/177），高表達(dá)率為25.99%（46/177）；肺外鱗狀細(xì)胞癌樣本的TPS評分與肺內(nèi)樣本無顯著差異（P=0.986）（圖2A）。

2.4 肺外轉(zhuǎn)移和肺內(nèi)腫瘤不同樣本類型的PD-L1表達(dá)比較在38例轉(zhuǎn)移腫瘤的手術(shù)樣本中，TPS評分平均值為28.45%，PD-L1陽性表達(dá)率為57.89%（22/38），高表達(dá)率為28.95%（11/38）；在436例肺內(nèi)手術(shù)樣本中，PD-L1表達(dá)TPS評分平均值為10.27%，PD-L1陽性表達(dá)率為44.04%（192/436），高表達(dá)率為9.17%（40/436）。肺外轉(zhuǎn)移與肺內(nèi)腫瘤手術(shù)樣本的TPS評分具有顯著差異（P＜0.001）。

在93例轉(zhuǎn)移腫瘤的活檢樣本中，TPS評分平均值為25.33%，PD-L1陽性表達(dá)率為63.44%（59/93），高表達(dá)率為25.81%（24/93）；在536例肺內(nèi)腫瘤活檢樣本中，TPS評分平均值為24.05%，PD-L1陽性表達(dá)率為61.19%（328/536），高表達(dá)率為25.00%（134/536）。肺外轉(zhuǎn)移與肺內(nèi)腫瘤活檢樣本的TPS評分無顯著差異（P=0.731）（圖2B）。

2.5 PD-L1表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性 在1,103例NSCLC中，單因素分析顯示PD-L1的陽性表達(dá)和高表達(dá)均與患者男性、吸煙史、組織學(xué)鱗狀細(xì)胞癌類型以及EGFR野生型顯著相關(guān)（均P＜0.05）；Logistic回歸分析表明患者男性、具有吸煙史以及EGFR野生型均是PD-L1陽性表達(dá)的獨(dú)立相關(guān)因素（均P＜0.05）（表2）。

表2 NSCLCPD-L1表達(dá)的臨床病理特征Tab 2 Clinicopathological correlations of PD-L1 expression in NSCLC

在肺內(nèi)腫瘤中，PD-L1的陽性表達(dá)和高表達(dá)均與患者男性、腫瘤組織類型顯著相關(guān)（均P＜0.05），并與EGFR突變負(fù)相關(guān)（P＜0.001）。轉(zhuǎn)移性NSCLC中，PD-L1的陽性表達(dá)和高表達(dá)與患者性別、年齡、吸煙史以及腫瘤組織類型無顯著相關(guān)性（均P＞0.05）；PD-L1的高表達(dá)與EGFR突變呈顯著負(fù)相關(guān)（P=0.008）（表3）。

表3 轉(zhuǎn)移性NSCLCPD-L1表達(dá)的臨床病理特征Tab 3 Clinicopathological correlations of PD-L1 expression in metastatic NSCLC

2.6EGFR主要突變位點(diǎn)與PD-L1表達(dá)的關(guān)系 285例EGFR突變病例中，PD-L1表達(dá)的TPS評分平均值為8.02%，PD-L1陽性表達(dá)率為39.65%（113/285），高表達(dá)率為7.02%（20/285）；EGFR野生型病例的TPS評分平均值為20.62%，PD-L1陽性表達(dá)率為56.97%（139/244），高表達(dá)率為20.90%（51/244）。EGFR野生型樣本的TPS評分顯著高于EGFR突變型（P＜0.001）。

EGFR突變位點(diǎn)檢測結(jié)果顯示，外顯子21點(diǎn)突變（L858R）為158例（55.44%）、外顯子19刪失（Del 19）為102例（35.79%）以及其他少見位點(diǎn)的突變?yōu)?5例（8.77%）。組間比較顯示，不同EGFR突變位點(diǎn)之間TPS評分檢測結(jié)果無顯著差異（P=0.398）（圖3，表4）。

表4 NSCLCEGFR突變位點(diǎn)與PD-L1表達(dá)的關(guān)系Tab 4 Relationship between EGFR mutation site and PD-L1 expression in NSCLC

3 討論

晚期NSCLC患者常表現(xiàn)為肺外轉(zhuǎn)移，來自不同取樣部位的腫瘤組織樣本中PD-L1的表達(dá)差異是困擾臨床檢測的難題。在本研究中，我們對比取材于不同部位NSCLC樣本的PD-L1檢測結(jié)果，顯示PD-L1表達(dá)水平在轉(zhuǎn)移樣本中的TPS評分顯著高于肺內(nèi)樣本，且不同部位轉(zhuǎn)移灶樣本的PD-L1染色陽性率和TPS評分具有明顯差異，表明PD-L1表達(dá)在肺外轉(zhuǎn)移樣本可存在異質(zhì)性差異。

在轉(zhuǎn)移性NSCLC中，多項研究[10-12]發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶的PD-L1評分與原發(fā)灶存在不一致的現(xiàn)象。我們前期在NSCLC配對手術(shù)樣本中對PD-L1表達(dá)水平定量分析顯示，腫瘤轉(zhuǎn)移灶相對于配對原發(fā)灶TPS評分明顯升高[13]。在本研究隊列中，PD-L1在實體器官肝臟和腎上腺轉(zhuǎn)移灶中具有明顯較高的陽性率，而在骨和胸膜轉(zhuǎn)移瘤中表達(dá)水平較低。與本研究類似，Hong等[14]發(fā)現(xiàn)PD-L1在腎上腺、肝臟和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PD-L1表達(dá)較高，而在骨和腦轉(zhuǎn)移中表達(dá)較低。研究[15,16]表明腫瘤細(xì)胞PD-L1的表達(dá)可能與所在轉(zhuǎn)移部位的免疫微環(huán)境有關(guān)。肝臟和腎上腺這類富于血供的器官更容易募集效應(yīng)T細(xì)胞進(jìn)行有效的腫瘤免疫監(jiān)測，該部位轉(zhuǎn)移瘤中表達(dá)免疫檢測點(diǎn)負(fù)性調(diào)控因子PD-L1的腫瘤細(xì)胞更易存活，并產(chǎn)生免疫抑制效應(yīng)。因此肝、腎上腺轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞更有可能陽性表達(dá)PD-L1；而骨、軟組織中招募效應(yīng)T細(xì)胞能力較弱，腫瘤細(xì)胞可在較低的免疫選擇壓力下存活，PD-L1表達(dá)對免疫逃逸的作用較小，因此骨、胸膜等轉(zhuǎn)移灶中PD-L1表達(dá)率較低。這表明PD-L1的表達(dá)調(diào)控隨著腫瘤所在部位的不同可存在差異，可能是形成空間異質(zhì)性的重要原因[17]。

不同轉(zhuǎn)移部位的PD-L1評分可能對NSCLC中ICIs獲益具有不同的預(yù)測價值。Qiao等[18]的研究顯示肺癌肝轉(zhuǎn)移患者無進(jìn)展生存期（progression-free survival, PFS）最短，而基于ICI的聯(lián)合治療可以有效控制肝轉(zhuǎn)移，延長PFS并改善客觀緩解率（objective response rate, ORR）。Hong等[14]研究顯示肺或遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移樣本中PD-L1水平越高，其應(yīng)答率越高，而在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤中PD-L1評分和ICI的臨床獲益之間缺乏相關(guān)性。淋巴結(jié)組織對轉(zhuǎn)移瘤的PD-L1調(diào)控可能由于其獨(dú)特的免疫微環(huán)境而產(chǎn)生的免疫效應(yīng)不同[14]。腦轉(zhuǎn)移是晚期肺癌常見的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移部位。Mansfeld等[6]發(fā)現(xiàn)與配對的原發(fā)性肺癌樣本相比，腦轉(zhuǎn)移瘤中表達(dá)PD-L1較低。Kluger等[19]研究同樣顯示腦轉(zhuǎn)移瘤中PD-L1的表達(dá)水平較低，可能與腦器官的免疫保護(hù)特征有關(guān)。但我們在本研究的腦轉(zhuǎn)移灶中觀察到PD-L1的表達(dá)并無明顯下降趨勢，而與肺內(nèi)腫瘤陽性率相似，提示免疫治療應(yīng)用于腦轉(zhuǎn)移瘤的潛力。

目前，NSCLC中不同部位組織樣本產(chǎn)生PD-L1表達(dá)空間異質(zhì)性的相關(guān)因素和機(jī)制仍然不明。本研究顯示轉(zhuǎn)移腫瘤和肺內(nèi)腫瘤的PD-L1表達(dá)評分差異主要體現(xiàn)于肺腺癌中，而在肺鱗狀細(xì)胞癌類型中無顯著差異，提示腫瘤PD-L1的空間異質(zhì)性存在組織學(xué)類型差異?？紤]到活檢樣本和手術(shù)樣本之間潛在的異質(zhì)性，研究對比了兩種類型的樣本對PD-L1表達(dá)水平差異的影響，結(jié)果顯示肺外和肺內(nèi)腫瘤活檢樣本的PD-L1表達(dá)陽性率無明顯差異，而手術(shù)樣本之間的PD-L1表達(dá)差異明顯，提示用于檢測的樣本類型對PD-L1檢測結(jié)果具有潛在影響。

通過對本研究NSCLC病例的PD-L1表達(dá)評分與臨床病理特征參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)PD-L1的陽性表達(dá)與患者男性、吸煙史、組織類型以及EGFR野生型顯著相關(guān)，這與我們前期的研究以及多個亞洲人群的研究相似[20-23]。這些臨床基線特征與PD-L1的表達(dá)密切相關(guān)，是否對PD-L1評分的異質(zhì)性產(chǎn)生顯著影響需要較大樣本的配對病例進(jìn)行分析。有研究[24]顯示NSCLC中EGFR信號通路的激活抑制PD-L1和上調(diào)免疫抑制因子的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤免疫微環(huán)境的免疫抑制作用。本研究分析顯示，轉(zhuǎn)移瘤中PD-L1的高表達(dá)與EGFR突變呈顯著負(fù)相關(guān)，但不同EGFR的突變位點(diǎn)的患者PD-L1表達(dá)陽性率并無明顯差異。

PD-L1表達(dá)的空間異質(zhì)性也可表現(xiàn)為同一患者不同轉(zhuǎn)移瘤灶間的不同，這提示活檢取樣部位的不同可導(dǎo)致PD-L1表達(dá)檢測結(jié)果的不同。因此，在具有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的晚期NSCLC患者進(jìn)行免疫治療的過程中，應(yīng)考慮到PD-L1在肺外轉(zhuǎn)移灶和肺內(nèi)樣本之間的異質(zhì)性變化。同一患者中不同轉(zhuǎn)移瘤灶間的PD-L1表達(dá)差異是否對各個瘤灶的免疫治療效果產(chǎn)生影響仍然需要進(jìn)一步研究探討。由于臨床上很難獲取同時具有多發(fā)轉(zhuǎn)移瘤的組織樣本，實際研究具有一定的困難。

作為一個臨床實踐樣本數(shù)據(jù)的回顧性分析研究，本研究個別部位的轉(zhuǎn)移樣本，如肝轉(zhuǎn)移、軟組織轉(zhuǎn)移等病例數(shù)較少。在后續(xù)的臨床研究需要進(jìn)一步的大樣本量的隊列研究，并且探討不同部位PD-L1表達(dá)水平與肺癌免疫治療療效及預(yù)后的相關(guān)性。此外，目前TPS是PD-L1抗體22c3的NCCN指南推薦的檢測指標(biāo)，其在免疫細(xì)胞評分的異質(zhì)性差異，仍需要進(jìn)一步探索。

綜上所述，本研究表明NSCLC轉(zhuǎn)移樣本中PD-L1表達(dá)水平通常要高于肺內(nèi)腫瘤。不同的轉(zhuǎn)移部位樣本的PD-L1評分具有差異，其中肝臟和腎上腺陽性率較高、骨和胸膜轉(zhuǎn)移灶陽性率較低。肺外和肺內(nèi)樣本的PD-L1檢測結(jié)果差異可能與組織學(xué)類型和取材樣本類型有關(guān)。探討不同轉(zhuǎn)移部位對PD-L1檢測結(jié)果的影響，有助于理解PD-L1表達(dá)的空間異質(zhì)性，并對指導(dǎo)晚期多發(fā)轉(zhuǎn)移的肺癌的PD-L1的檢測策略具有一定幫助。

Author contributions

Huang XZ, Wu JH and Lin DM conceived and designed the study.Wu JH and Huang XZ wrote the manuscript and Lin DM edited the manuscript.Zhou LX assisted in data Statistics.Huang XZ, Zhou LX, Song ZJ and Xu WT prepared the slides and performed the experiments.Jia L, Diao XT and Wu Q collected the clinical data.