袁宗勝

（閩江學(xué)院 海洋研究院，福建 福州 350108）

植物內(nèi)生細(xì)菌是指其生活史的一定階段或全部階段均生活在健康植物的各種組織和器官內(nèi)部，并且與植物建立了和諧聯(lián)合關(guān)系的細(xì)菌［1］。內(nèi)生細(xì)菌通過自身產(chǎn)生代謝產(chǎn)物或借助信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)宿主植物生長發(fā)育產(chǎn)生重要影響，主要表現(xiàn)在促進(jìn)宿主植物生長、增強(qiáng)宿主植物抗性及提高植物修復(fù)能力等方面［2-6］，例如，Microbacterium具有促進(jìn)植物生長的作用［7］，Bacillus具有良好的生防潛力［8］，Sphingomonas對(duì)植物有自我修復(fù)功能［9］等。內(nèi)生菌對(duì)植物病害的防病作用通過產(chǎn)生抗生素類物質(zhì)［10］、產(chǎn)生水解酶［11］、產(chǎn)生生長調(diào)節(jié)劑［12］、內(nèi)生菌與病原菌競(jìng)爭(zhēng)營養(yǎng)物質(zhì)［13］等途徑抑制病原菌的生長。

據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，食用菌生產(chǎn)栽培過程中由于病蟲的危害，可導(dǎo)致減產(chǎn)10%~30%，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)w粒無收［14］。防治病蟲害最常見的方法就是化學(xué)藥劑，但是長時(shí)間使用單一的化學(xué)藥劑會(huì)使得病蟲害的抗性增強(qiáng)和防治效果下降，而且藥品的殘留量大都會(huì)對(duì)人的身體健康造成威脅，也會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的環(huán)境污染，因而針對(duì)病蟲害的生物防治近年來受到世界各地的高度重視［15］。國內(nèi)外研究人員在內(nèi)生菌對(duì)于防治植物病害方面進(jìn)行了大量的研究，也取得了非常顯著的效果。本文選取對(duì)主要食用菌病原菌具有較好拮抗效果的內(nèi)生細(xì)菌菌株CT-A16，研究其生物學(xué)特性及其對(duì)3種食用菌病害的生防機(jī)制，為食用菌病蟲害的生物防治奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

1.1.1 內(nèi)生細(xì)菌菌株CT-A16 該菌株由本實(shí)驗(yàn)室分離并篩選出，其對(duì)主要食用菌病原菌具有較好拮抗效果，初步鑒定為金黃短桿菌。

1.1.2 供試食用菌病原菌 疣孢病菌為疣孢霉（Mycogone perniciosa）；蛛網(wǎng)病菌為葡枝霉（Cladobotryum semicirculare）；油疤病菌為木棲柱孢霉（Scytalidium lignicola）。

1.2 培養(yǎng)基及主要試劑

內(nèi)生細(xì)菌培養(yǎng)采用NA培養(yǎng)基：牛肉膏3 g、蛋白 胨5 g、NaCl 5 g、瓊 脂18 g、水1000 mL，pH值7.0~7.2（液體培養(yǎng)基則不加瓊脂）。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、瓊脂粉20 g、葡萄糖20 g，水1000 mL。

主要試劑：所用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 金黃短桿菌CT-A16的生物學(xué)特性

1.3.1 培養(yǎng)特征和形態(tài)特征 取供試金黃短桿菌CT-A16接種于NA平板培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)2~3 d，觀察菌落顏色和形態(tài)，包括菌體形狀和芽孢形態(tài)等重要鑒別特征。對(duì)菌體進(jìn)行革蘭氏染色、芽孢染色、莢膜染色，在顯微鏡下觀察染色結(jié)果，細(xì)菌形態(tài)觀察方法參照東秀珠等［16-17］的方法。

1.3.2 最適溫度的測(cè)定 在潔凈試管中加入10 mL NB液體培養(yǎng)基，滅菌冷卻后將金黃短桿菌CTA16 按1%接種量接種于液體培養(yǎng)基試管中，分別置于15、20、25、30、35、40 ℃等 6個(gè)溫度梯度下、180 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h，以不接種金黃短桿菌CTA16的NB液體培養(yǎng)基作為對(duì)照，每個(gè)處理3次重復(fù)，測(cè)定OD600值，以確定其生長的最適溫度。

1.3.3 最適pH值的測(cè)定 在潔凈試管中加入10 mL NB液體培養(yǎng)基，用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH調(diào)整液體培養(yǎng)基的初始pH值，使培養(yǎng)基pH值梯度為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。接種金黃短桿菌CT-A16于培養(yǎng)基后，在30 ℃下、180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，再測(cè)定OD600值，以確定其生長的最適pH值。

1.3.4 生長曲線的測(cè)定 在潔凈試管中加入10 mL NB液體培養(yǎng)基，滅菌冷卻后，按1%的接種量接種金黃短桿菌CT-A16，在30 ℃、180 r/min下振蕩培養(yǎng)。以開始放搖床振蕩培養(yǎng)開始進(jìn)行第1次取樣（零小時(shí)取樣），測(cè)量其OD600值，以后隔2 h定時(shí)取樣，測(cè)定菌液的OD600值。

1.4 金黃短桿菌CT-A16對(duì)主要食用菌病害的生防機(jī)制

1.4.1 金黃短桿菌CT-A16發(fā)酵過濾液的制備 取供試金黃短桿菌CT-A16，分別用無菌接種環(huán)挑取單菌落，接種于裝液量為100 mL的NB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，在28 ℃、180 r/min的條件下培養(yǎng)3 d，再4 ℃，10000 r/min離心15 min，取得上清液。在無菌條件下，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾后將所得濾液，即為金黃短桿菌CT-A16發(fā)酵過濾液。

1.4.2 金黃短桿菌CT-A16發(fā)酵滅菌液的制備取供試金黃短桿菌CT-A16，分別用無菌接種環(huán)挑取單菌落，接種于裝液量為100 mL的NB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，在28 ℃、180 r/min的條件下培養(yǎng)3 d，放入高壓滅菌鍋，121 ℃條件下滅菌30 min，即為金黃短桿菌CT-A16發(fā)酵滅菌液。

1.4.3 金黃短桿菌CT-A16發(fā)酵過濾液對(duì)病原菌菌絲生長的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用菌落生長法測(cè)定金黃短桿菌CT-A16過濾液的抑菌活性，將上述金黃短桿菌CT-A16過濾液與PDA培養(yǎng)基混合制成混合平板（濃度分別為5%、10%、15%、20%），以不加過濾液的PDA平板為對(duì)照。分別在平板中央接入病原菌菌原片，每個(gè)處理3次重復(fù)，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)，然后觀察病原菌的菌絲生長狀況，待對(duì)照CK滿板時(shí)采用十字交叉法測(cè)量菌絲直徑，并計(jì)算相對(duì)抑制率。

相對(duì)抑制率/%=（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/對(duì)照菌落直徑×100%

1.4.4 金黃短桿菌CT-A16發(fā)酵滅菌液對(duì)病原菌菌絲生長的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用菌落生長法測(cè)定金黃短桿菌CT-A16滅菌液的抑菌活性，將上述金黃短桿菌CT-A16滅菌液與PDA培養(yǎng)基混合制成混合平板（濃度分別為5%、10%、15%、20%），以不加滅菌液的PDA平板為對(duì)照。分別在平板中央接入病原菌菌原片，每個(gè)處理3次重復(fù)，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)，然后觀察病原菌的菌絲生長狀況，待對(duì)照（CK）滿板時(shí)采用十字交叉法測(cè)量菌絲直徑，并計(jì)算相對(duì)抑制率。

1.4.5 金黃短桿菌CT-A16發(fā)酵過濾液對(duì)病原菌孢子萌發(fā)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 取上述金黃短桿菌CT-A16過濾液，將過濾液按照20%、40%兩個(gè)比例與PDA培養(yǎng)基混合，分別制成混合培養(yǎng)基平板。在生長成熟的3個(gè)病原菌的培養(yǎng)皿中加入無菌水，收集病原菌孢子，制成孢子懸浮液，然后用移液槍將孢子懸浮液加入上述混合培養(yǎng)基平板上，用涂布棒均勻涂抹。每個(gè)處理3次重復(fù)，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)，然后觀察病原菌的孢子萌發(fā)狀況，并計(jì)算相對(duì)抑制率。

1.4.6 金黃短桿菌CT-A16發(fā)酵滅菌液對(duì)病原菌孢子萌發(fā)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 取上述金黃短桿菌CT-A16滅菌液，將滅菌液按照20%、40%兩個(gè)比例與PDA培養(yǎng)基混合，分別制成混合培養(yǎng)基平板。在生長成熟的3個(gè)病原菌的培養(yǎng)皿中加入無菌水，收集病原菌孢子，制成孢子懸浮液。然后用移液槍將孢子懸浮液加入到上述混合培養(yǎng)基平板上，用涂布棒均勻涂抹。每個(gè)處理3次重復(fù)，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)，然后觀察病原菌的孢子萌發(fā)狀況，并計(jì)算相對(duì)抑制率。

1.4.7 金黃短桿菌CT-A16揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)病原菌菌絲生長的影響 將3個(gè)病原菌菌株（疣孢病菌、蛛網(wǎng)病菌、油疤病菌）和金黃短桿菌CT-A16分別轉(zhuǎn)接到不同的PDA平板上，并分別在適宜的溫度條件下培養(yǎng)2 d后，在無菌條件下去掉平板蓋，將接有病原菌的培養(yǎng)皿相對(duì)扣合，并用封口膜沿邊緣封口，防止揮發(fā)性物質(zhì)漏出。以不接金黃短桿菌CT-A16的PDA平板作為對(duì)照，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)，每個(gè)處理3次重復(fù)。觀察病原菌的菌絲生長情況，并計(jì)算相對(duì)抑菌率。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)繪圖用Excel 2007，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用 DPS V7.05軟件的相應(yīng)分析功能進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 金黃短桿菌CT-A16的生物學(xué)特性

2.1.1 金黃短桿菌CT-A16的培養(yǎng)特征和形態(tài)特征 取供試金黃短桿菌CT-A16接種于NA平板培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)3 d，觀察到菌落顏色為白色，菌落邊緣光滑平整，通過顯微鏡觀察菌體呈短桿狀。對(duì)菌體進(jìn)行革蘭氏染色、芽孢染色、莢膜染色，結(jié)果顯示金黃短桿菌CT-A16為革蘭氏染色為陽性，無芽孢，有莢膜。

2.1.2 金黃短桿菌CT-A16最適溫度的測(cè)定 由圖1可知，金黃短桿菌CT-A16的OD值隨著培養(yǎng)溫度的逐步升高而升高，在培養(yǎng)溫度為30 ℃時(shí)OD值最大。在30~40 ℃時(shí)，隨著培養(yǎng)溫度的增加，OD值呈下降趨勢(shì)，因此金黃短桿菌CT-A16的最適生長溫度為30 ℃。

2.2 金黃短桿菌CT-A16最適pH值

由金黃短桿菌CT-A16最適pH值的測(cè)定結(jié)果（圖2）表明：隨著pH值的升高，金黃短桿菌CTA16菌液的OD值逐步升高，待pH值為6時(shí)達(dá)到最高值，隨后OD值隨pH值的增加呈下降趨勢(shì)。即最佳生長pH值為6.0，適宜金黃短桿菌CT-A16生長的pH值范圍為5.0~7.0。

圖2 不同pH值對(duì)金黃短桿菌CT-A16的影響

2.3 金黃短桿菌CT-A16的生長曲線

金黃短桿菌CT-A16生長曲線（圖3）的測(cè)定結(jié)果表明，由金黃短桿菌CT-A16不同時(shí)段內(nèi)的OD值所反映出的生長曲線呈現(xiàn)出階段性變化。第一階段為遲滯期：生長16 h內(nèi)，OD值呈現(xiàn)逐步增長的趨勢(shì)，增長速度非常緩慢；第二階段為對(duì)數(shù)生長期：生長16~36 h內(nèi)，OD值呈現(xiàn)快速增長趨勢(shì)，36 h時(shí)OD值達(dá)到峰值；隨后進(jìn)入穩(wěn)定期：生長36~40 h（或40 h以后）內(nèi)OD值不再增加并出現(xiàn)降低現(xiàn)象。綜上所述，在測(cè)定時(shí)間內(nèi),內(nèi)生金黃短桿菌CT-A16的生長階段為：遲滯期細(xì)菌接種至培養(yǎng)基后，對(duì)新環(huán)境有一個(gè)短暫適應(yīng)過程；對(duì)數(shù)生長期細(xì)菌快速繁殖增長，菌數(shù)顯著增多，此時(shí)期活菌數(shù)直線上升，細(xì)菌以穩(wěn)定的幾何級(jí)數(shù)極快增長;第三階段穩(wěn)定期培養(yǎng)40 h時(shí)內(nèi)生細(xì)菌基本上是處于穩(wěn)定期的階段，尚未進(jìn)入衰退階段。

圖3 金黃短桿菌CT-A16的生長曲線

2.4 金黃短桿菌CT-A16發(fā)酵過濾液對(duì)病原菌菌絲生長的抑制效果

通過對(duì)病原菌菌絲生長情況進(jìn)行觀察，統(tǒng)計(jì)不同比例內(nèi)生金黃短桿菌過濾液對(duì)不同病原菌的抑制率（表1），由表1可以看出，內(nèi)生金黃短桿菌CTA16對(duì)病原菌的抑制效果較好，在菌液濃度為20%時(shí)，內(nèi)生金黃短桿菌CT-A16對(duì)油疤病菌原菌的抑制效果最好。

表1 不同濃度金黃短桿菌CT-A16過濾液對(duì)病原菌菌絲生長的抑制率

2.5 金黃短桿菌CT-A16發(fā)酵滅菌液對(duì)病原菌菌絲生長的抑制效果

通過對(duì)病原菌菌絲生長情況進(jìn)行觀察，統(tǒng)計(jì)不同種不同比例內(nèi)生金黃短桿菌滅菌液對(duì)病原菌的抑制率，結(jié)果如表2所示，濃度為20%的金黃短桿菌CT-A16滅菌液對(duì)油疤病菌的抑制效果最佳，其次是疣孢病菌、蛛網(wǎng)病菌。

表2 不同濃度金黃短桿菌CT-A16滅菌液對(duì)病原菌菌絲生長的抑制率

2.6 金黃短桿菌CT-A16發(fā)酵過濾液對(duì)病原菌孢子萌發(fā)的抑制效果

通過對(duì)病原菌孢子萌發(fā)生長情況進(jìn)行觀察，統(tǒng)計(jì)不同比例內(nèi)生菌過濾液對(duì)不同病原菌的抑制率，結(jié)果見表3。內(nèi)生金黃短桿菌CT-A16對(duì)于病原菌抑制效果最好的濃度為40%，對(duì)疣孢病菌、油疤病菌都能100%地抑制孢子的萌發(fā)，對(duì)蛛網(wǎng)病菌孢子萌發(fā)的抑制效果相對(duì)較弱。

表3 不同濃度金黃短桿菌CT-A16過濾液對(duì)病原菌孢子萌發(fā)的抑制率

2.7 金黃短桿菌CT-A16發(fā)酵滅菌液對(duì)病原菌孢子萌發(fā)的抑制效果

通過對(duì)病原菌孢子萌發(fā)生長情況進(jìn)行觀察，統(tǒng)計(jì)不同比例內(nèi)生菌滅菌液對(duì)不同病原菌孢子萌發(fā)的抑制效果，結(jié)果見表4。濃度為40%的內(nèi)生金黃短桿菌CT-A16發(fā)酵滅菌液對(duì)病原菌的抑制效果最佳，對(duì)疣孢病菌和油疤病菌的抑制效果較好。

表4 不同濃度金黃短桿菌CT-A16滅菌液對(duì)病原菌孢子萌發(fā)的抑制率

2.8 金黃短桿菌CT-A16揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)病原菌菌絲生長的抑制效果

通過觀察病原菌與內(nèi)生金黃短桿菌CT-A16對(duì)接密封的培養(yǎng)皿中病原菌的菌絲生長狀況，結(jié)果表明：內(nèi)生金黃短桿菌CT-A16揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)病原菌菌絲生長具有一定的抑制作用。從表5可以看出，內(nèi)生金黃短桿菌CT-A16揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)于油疤病菌、蛛網(wǎng)病菌的抑制效果比較好，對(duì)于疣孢病菌的抑制效果相對(duì)較弱。

表5 金黃短桿菌CT-A16揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)病原菌菌絲生長的影響

3 結(jié)論與討論

金黃短桿菌CT-A16的生物學(xué)特性測(cè)定結(jié)果表明，金黃短桿菌CT-A16菌落顏色為白色，菌落邊緣光滑平整，通過顯微鏡觀察菌體呈短桿狀。對(duì)菌體進(jìn)行革蘭氏染色、芽孢染色、莢膜染色，結(jié)果顯示：金黃短桿菌CT-A16為革蘭氏染色為陽性，無芽孢，有莢膜。金黃短桿菌CT-A16進(jìn)行最適溫度為30 ℃，最適pH值為6.0。

由金黃短桿菌CT-A16對(duì)3種食用菌病原菌的生防效果可以看出，不同濃度金黃短桿菌CT-A16過濾液和滅菌液對(duì)病原菌菌絲生長均具有一定的抑制效果。其中濃度為20%的金黃短桿菌CTA16過濾液對(duì)病原菌的抑制效果較好，對(duì)疣孢病菌的抑制率達(dá)到66.53%，對(duì)油疤病菌的抑制率為62.73%，對(duì)蛛網(wǎng)病菌的抑制率為83.58%。在不同濃度金黃短桿菌CT-A16過濾液和滅菌液對(duì)病原菌孢子萌發(fā)的測(cè)定中發(fā)現(xiàn)，濃度為40%金黃短桿菌CT-A16對(duì)于3個(gè)病原菌的抑制效果都非常明顯；金黃短桿菌CT-A16的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)病原菌菌絲生長也表現(xiàn)出一定的抑制作用。

內(nèi)生菌對(duì)植物病害的生物防治已研究多年并取得了很好的應(yīng)用效果，何紅等［18］也證實(shí)了分離自辣椒的內(nèi)生芽孢桿菌對(duì)辣椒炭疽病菌有拮抗活性。用植物內(nèi)生的枯草芽孢桿菌處理辣椒苗，然后再接種病原菌，能夠?qū)l(fā)病率降低81.49%~93.34%。內(nèi)生菌的拮抗效果除了在實(shí)驗(yàn)室的抑菌效果測(cè)定外，還需要在大生產(chǎn)過程中的實(shí)際應(yīng)用，以進(jìn)一步驗(yàn)證內(nèi)生菌的拮抗效果，這將是今后內(nèi)生細(xì)菌的研究熱點(diǎn)。