王 蘭，錢(qián) 斌，賴(lài)敏輝，嚴(yán)冬霞，宋 岑，徐岳正

（1.浙江古越龍山紹興酒股份有限公司，浙江紹興 312000；2.國(guó)家黃酒工程技術(shù)研究中心，浙江紹興 312000）

生物胺是一類(lèi)堿性含氮化合物，因其潛在的毒性作用和對(duì)生產(chǎn)衛(wèi)生條件的指示作用而受到消費(fèi)者、制造商和研究者的關(guān)注。適量的生物胺對(duì)人體的各項(xiàng)生理機(jī)能有調(diào)節(jié)作用，濃度過(guò)高則會(huì)引起頭疼、嘔吐、眩暈等不適感。有研究表明，酒類(lèi)飲品中生物胺含量過(guò)高是飲后“上頭”的主要原因之一。

黃酒主要經(jīng)浸米、蒸飯、發(fā)酵和陳釀等環(huán)節(jié)釀制而成，生物胺的形成主要集中于浸米與發(fā)酵階段。浸米和蒸飯的目的是使原料米吸水膨脹，能夠達(dá)到糊化的目的，使淀粉結(jié)晶構(gòu)造破壞而α-化，有利于淀粉酶、糖化酶作用，同時(shí)也進(jìn)行了滅菌。

目前控制黃酒中生物胺含量的手段主要分為：

（1）針對(duì)發(fā)酵階段，如向發(fā)酵過(guò)程中添加具有降解生物胺能力的微生物或?qū)S酒酵母進(jìn)行基因改造以降低黃酒中生物胺含量。

（2）針對(duì)浸米階段，如利用乳酸菌直投技術(shù)降低黃酒浸米過(guò)程中生物胺的積累。

本試驗(yàn)以黃酒生產(chǎn)工藝為研究對(duì)象，研究替代浸米工藝的方法及工藝參數(shù)，即原料直接粉碎，經(jīng)糊化液化，再進(jìn)行糖化發(fā)酵釀制黃酒，從而降低黃酒中生物胺含量。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

原料：糯米、麥曲，浙江古越龍山紹興酒股份有限公司提供。

耗材：耐酸型高溫α-淀粉酶、紹酒風(fēng)味曲、活性干酵母，安琪酵母股份有限公司生產(chǎn)。

1.1.2 化學(xué)試劑

生物胺標(biāo)樣：苯乙胺，組胺，尸胺，腐胺，酪胺，精胺，色胺，丹磺酰氯(衍生劑)，異硫氰酸苯酯，三乙胺，三氯甲烷，正丁醇，正己烷，三氯乙酸，丙酮，甲醇，乙腈，均為色譜純。

可溶性淀粉：浙江菱湖淀粉廠(chǎng)。

1.1.3 儀器設(shè)備

高效液相色譜儀(Agilentl100，Waters XBrige C(4.6×250 mm，5 μm)，配紫外檢測(cè)器)；離心機(jī)；旋渦混合器；恒溫箱；氮吹儀；超聲波清洗器；分析天平(精確至0.0001 g)；pH 計(jì)；超純水器；0.45 μm 針頭微孔濾膜過(guò)濾器。

1.2 工藝流程（圖1）

圖1 液化法與傳統(tǒng)法黃酒釀造工藝比較

具體操作流程見(jiàn)圖1：

（1）糊化：糯米粉按一定比例投入水中，投料溫度55 ℃，攪拌均勻。

（2）液化：α-淀粉酶按一定比例添加，調(diào)pH5.4～6.0，升溫至一定溫度，保溫一定時(shí)間。

（3）冷卻：將液化液冷卻至24 ℃左右。

（4）發(fā)酵：在液化液中按比例加入活化后的紹酒曲和活性干酵母，再加入麥曲，充分?jǐn)嚢杌靹颉Ｂ涓缀?，每? h開(kāi)耙一次，第4天開(kāi)耙兩次，第5天至第10 天，每天開(kāi)耙一次。前酵溫度不能超過(guò)36 ℃，時(shí)間為7 d；后酵溫度在15～25 ℃，時(shí)間為14 d。

（5）醪液經(jīng)濾布過(guò)濾、灌裝、85～90 ℃滅菌。

1.3 單因素試驗(yàn)研究

1.3.1 液化條件的選擇

高溫α-淀粉酶的適宜作用溫度在90～110 ℃，考察液化溫度80 ℃、90 ℃、100 ℃對(duì)液化程度和發(fā)酵的影響。設(shè)定淀粉酶用量0.3 ‰、0.6 ‰、1 ‰、1.5‰、2‰，考察液化程度和發(fā)酵過(guò)程。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步考察液化時(shí)間0.5 h、1 h、2 h、3 h、4 h 對(duì)發(fā)酵的影響。

采用碘液法判斷液化程度，碘試顏色：紅棕色→紅色→淺紅→淡紅→黃色，液化程度依次提高。

1.3.2 料水比的確定

設(shè)定料水比為1∶2.3、1∶2.4、1∶2.5、1∶2.6、1∶2.7，測(cè)定酒糟殘余淀粉含量，計(jì)算淀粉利用率，確定最佳料水比。

1.4 正交試驗(yàn)

麥曲在黃酒傳統(tǒng)釀造過(guò)程中起著舉足輕重的作用，被譽(yù)為“酒之骨”，它一方面作為釀造過(guò)程中糖化發(fā)酵時(shí)各種酶制劑的來(lái)源，另一方面賦予了黃酒特有的香氣、味道和顏色，對(duì)黃酒的品質(zhì)和風(fēng)味起著重要作用。紹酒曲是由多種活性微生物及酶制劑組成的復(fù)合酒曲，其產(chǎn)品穩(wěn)定、操作方便。黃酒活性干酵母是從紹興酒醪中分離出來(lái)的優(yōu)良黃酒酵母，具有耐酸、耐乙醇、發(fā)酵力強(qiáng)等特征，能有效防止黃酒酸敗，穩(wěn)定酒質(zhì)，提高出酒率。將三者同時(shí)引入新工藝，研究其相互作用對(duì)酒體品質(zhì)的影響，以確定用量。

根據(jù)傳統(tǒng)工藝麥曲用量和紹酒曲推薦用量（2.5 ‰～5 ‰），活性干酵母推薦用量（0.5 ‰～2‰），設(shè)計(jì)三因素三水平的全面試驗(yàn)，以感官評(píng)價(jià)為指標(biāo)選出最優(yōu)方案。

1.5 感官評(píng)定

請(qǐng)10 位國(guó)家黃酒評(píng)酒委員，按色（10 分）、香（25分）、味（50分）、格（15分）進(jìn)行評(píng)分。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)研究

2.1.1 液化條件的選擇

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，液化溫度為80 ℃時(shí)，液化液中淀粉呈明顯的顆粒感，碘試的顏色為紅棕色，且顏色不會(huì)隨著液化時(shí)間的延長(zhǎng)而改變，說(shuō)明在該溫度下高溫α-淀粉酶發(fā)揮的作用受限，故液化溫度80 ℃是不可行的。

在90 ℃和100 ℃兩個(gè)條件下，液化液中淀粉逐漸呈絮狀，兩個(gè)溫度對(duì)發(fā)酵影響不是很明顯（結(jié)果見(jiàn)表1）。

表1 不同液化溫度下成品酒指標(biāo)

隨著淀粉酶用量增加（結(jié)果見(jiàn)表2），碘試的顏色依次為紅棕、紅色、淺紅、黃色，其中碘試顏色為黃色，說(shuō)明原料中淀粉幾乎都轉(zhuǎn)化為寡糖和低聚糖等，液化較徹底，不利于發(fā)酵時(shí)麥曲作用的發(fā)揮以及保證酒的品質(zhì)，故高溫α-淀粉酶用量為0.6‰～1.5 ‰較為合適。根據(jù)發(fā)酵情況（結(jié)果見(jiàn)圖2、圖3），淀粉酶用量為1 ‰時(shí)，醪液糖分持續(xù)下降最為明顯，酒精度持續(xù)上升，故選擇該條件進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

圖2 不同淀粉酶用量下醪液總糖的變化

圖3 不同淀粉酶用量下醪液酒精度的變化

表2 不同淀粉酶添加量對(duì)液化程度的影響

隨著液化時(shí)間的延長(zhǎng)（結(jié)果見(jiàn)表3），碘試的顏色依次為紅棕、紅色、淺紅、黃色，根據(jù)液化程度選擇液化時(shí)間為1～3 h 進(jìn)行釀酒試驗(yàn)。不同液化時(shí)間對(duì)醪液總糖和酒精度的影響不顯著（結(jié)果見(jiàn)圖4、圖5），液化時(shí)間為2 h 時(shí)，成品酒的各項(xiàng)指標(biāo)最佳（結(jié)果見(jiàn)表4），因此選擇液化時(shí)間為2 h。

表4 不同液化時(shí)間下成品酒指標(biāo)

圖5 不同液化時(shí)間下醪液酒精度的變化

表3 不同液化時(shí)間對(duì)液化程度的影響

圖4 不同液化時(shí)間下醪液總糖的變化

綜上所述，液化條件為溫度90 ℃，時(shí)間2 h，淀粉酶用量1‰。

2.1.2 料水比的確定

在保證醪液流動(dòng)性適宜物料輸送的情況下，選擇料水比1∶2.3～1∶2.7 進(jìn)行釀酒試驗(yàn)，結(jié)果如表5所示，隨著加水量增加，原料淀粉利用率呈上升趨勢(shì)后趨于平緩，由此選擇料水比為1∶2.6。

表5 不同料水比對(duì)原料淀粉利用率的影響

2.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)傳統(tǒng)工藝麥曲用量和紹酒曲推薦用量（2.5 ‰～5 ‰），活性干酵母推薦用量（0.5 ‰～2 ‰），設(shè)計(jì)三因素三水平的全面試驗(yàn)（見(jiàn)表6），以感官評(píng)價(jià)為指標(biāo)選出最優(yōu)方案。

表6 各因素水平對(duì)照表

根據(jù)表6 進(jìn)行正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析見(jiàn)表7。

由表7 可知，對(duì)新工藝黃酒發(fā)酵影響順序?yàn)閭鹘y(tǒng)工藝麥曲用量（A）＞活性干酵母用量（C）＞紹酒曲用量（B），最優(yōu)水平為ACB，即傳統(tǒng)工藝麥曲用量5%，活性干酵母用量2 ‰，紹酒曲用量3 ‰，此時(shí)感官評(píng)分為83.32分。

表7 正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析

根據(jù)GB 5009.208—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中生物胺的測(cè)定》，對(duì)發(fā)酵結(jié)束后經(jīng)壓榨的試驗(yàn)酒與對(duì)照酒進(jìn)行生物胺檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表8。

表8 發(fā)酵結(jié)束時(shí)經(jīng)壓榨液化法與傳統(tǒng)法生物胺含量

試驗(yàn)酒中生物胺含量12.3 mg/L，對(duì)照酒中生物胺含量43.3 mg/L，新工藝黃酒中生物胺含量下降71.59%。

根據(jù)GB/T 13662—2018《黃酒》對(duì)新工藝黃酒進(jìn)行理化指標(biāo)檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表9。

表9 新工藝黃酒理化指標(biāo)

符合干型黃酒清爽型一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)論

為降低黃酒中生物胺含量，本研究以黃酒生產(chǎn)工藝為研究對(duì)象，研究替代浸米工藝的方法及工藝參數(shù)，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，以感官評(píng)價(jià)為指標(biāo)，確定最優(yōu)工藝條件：液化溫度為90 ℃，液化時(shí)間2 h，淀粉酶用量1‰，料水比為1∶2.6，傳統(tǒng)工藝麥曲用量5%，活性干酵母用量2‰，紹酒曲用量3 ‰。在此工藝下釀制的黃酒，口感清爽，生物胺含量較對(duì)照下降71.59 %，還可減少因浸米過(guò)程產(chǎn)生的大量米漿水，大大緩解了廢水排放壓力，產(chǎn)生了較好的經(jīng)濟(jì)社會(huì)效益。