李蘇濤，李 妍，張 磊，陳思齊，韓雪林，張 娟，蘇德偉，羅海凌，周 晶

（1. 福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院(蜂學(xué)學(xué)院), 福建 福州 350002；2. 福建農(nóng)林大學(xué)國家菌草工程技術(shù)研究中心, 福建 福州 350002）

實時熒光定量PCR (real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction, qRT-PCR)技術(shù)因其特異識別性強、高靈敏度、高通量等特點[1]，在分子生物學(xué)領(lǐng)域中常被用于檢測基因表達與轉(zhuǎn)錄分析等研究[2]。使用合適的內(nèi)參基因?qū)δ康幕虻南鄬Ρ磉_量進行校正和標(biāo)準(zhǔn)化，是獲得準(zhǔn)確試驗數(shù)據(jù)的前提[3]。目前，在動物、植物內(nèi)參基因的研究中常用的內(nèi)參基因評估方法都是基于qRT-PCR的Ct值進行軟件分析，常用的軟件有g(shù)eNorm、NormFinder和BestKeeper[4-5]。

內(nèi)參基因是指在理想狀態(tài)下，其表達量不會因不同試驗條件、組織器官、物種等而改變的穩(wěn)定基因。然而，不斷有研究表明，不可能存在一種基因，其表達量不隨試驗條件變化而變化[6]。更不存在一種在所有物種中均能穩(wěn)定表達的基因。如GAPDH和Actin在草地早熟禾(Poa pratensis)中表達穩(wěn)定性較好，但在小麥(Triticum aestivum)中GAPDH和Actin表達穩(wěn)定性較差[7-8]。因此使用未篩選的內(nèi)參基因進行目的基因相對表達量的校正會影響數(shù)據(jù)的可靠性。目前，在植物領(lǐng)域中已有如小麥[9-10]、大麥(Hordeum vulgare)[11]、黑麥草(Lolium perenne)[12]、水稻(Oryza sativa)[13-14]、玉米(Zea mays)[15-16]、甘蔗(Saccharum officinarum)[17]、擬南芥 (Arabidopsis thaliana)[18-19]、草地早熟禾[7]、羊草(Leymus chinensis)[20]、大針茅(Stipa grandis)[21]等內(nèi)參基因篩選的研究報道。

巨菌草(Pennisetum giganteum)為禾本科多年生狼尾草屬植物，其根部發(fā)達，可用于修復(fù)生態(tài)環(huán)境。因其在生態(tài)、經(jīng)濟方面的潛力，巨菌草成為菌草的主要推廣品種[22]。目前，已有揭示巨菌草基因調(diào)控機理的研究報道。有研究通過對巨菌草幼苗的葉片和根進行轉(zhuǎn)錄組功能測序，揭示了葉片和根的主要轉(zhuǎn)錄因子家族。對不同土培干旱和復(fù)水條件下巨菌草進行了高通量測序，報道了巨菌草干旱、復(fù)水相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[23-24]。但目前暫未看到關(guān)于巨菌草內(nèi)參基因篩選的報道研究。因此，本試驗以正常生長、不同干旱脅迫和鹽堿脅迫下巨菌草的葉片、莖、根為試驗材料，分別用geNorm、NormFinder和BestKeeper對18s rRNA、Actin、GAPDH、ACTB、EF-1α、UBQ、TUB、CYP共8個傳統(tǒng)內(nèi)參基因進行表達穩(wěn)定性排序，最后根據(jù)賦值法進行排序，以期得到巨菌草基因表達中穩(wěn)定的內(nèi)參基因。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

巨菌草原產(chǎn)于北非，由國家菌草工程技術(shù)研究中心首席科學(xué)家林占熺引進國內(nèi)并命名，種植于國家菌草工程技術(shù)研究中心菌草培育基地。試驗選用帶有飽滿側(cè)芽、莖粗一致的植株，于2020年12月，將巨菌草種植在以草炭土和蛭石1 : 1混勻填充的花盆中。每個花盆裝約1.5 kg草炭土和蛭石混合物，將花盆置于溫度為(25 ± 1) ℃的溫室進行培養(yǎng)，每天每盆澆水250 mL。1個月后，選取21盆長出7片葉子、長勢一致的巨菌草進行后續(xù)試驗。

1.2 方法

1.2.1試驗材料處理

將上述21盆巨菌草按每個處理組3盆，隨機分成7組。分別進行正常生長、干旱脅迫和鹽堿脅迫處理。正常處理組以蒸餾水進行澆灌，使其土壤含水量保持在80%左右；干旱脅迫處理組在其土壤含水量為80%左右時，分別進行連續(xù)7、14和21 d的不澆水處理；鹽堿脅迫處理組參考潘羿壅[25]的研究，用蒸餾水將NaCl、Na2SO4、NaHCO3和Na2CO3以1 : 1 : 1 : 1比例混合，配置成濃度為60、120、180 mmol·L-1的混合鹽堿溶液，以上述混合鹽堿溶液對巨菌草進行澆灌，每個花盆每天澆灌250 mL，連續(xù)澆灌7 d。最后，快速采取每個處理組的葉片、莖和根置于液氮中，后將樣品放入-80 ℃冰箱中保存。

1.2.2巨菌草組織RNA提取和cDNA合成

不同處理組均取約100 mg的葉片、莖和根組織，置于研缽中，加入液氮充分研磨，按RNAprep Pure Plant Kit (TIANGEN BIOTECH，Beijing，China)試劑盒進行總RNA提?。蝗缓竺總€組織部位以1 μg的RNA作為模板，按照Fasting gDNA Dispelling RT SuperMix(TIANGEN BIOTECH，Beijing，China)試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄操作，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。反轉(zhuǎn)錄程序為42 ℃反應(yīng)15 min，后95 ℃反應(yīng)3 min。反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA置于-20 ℃冰箱中暫時保存。

1.2.3引物的設(shè)計與合成

根據(jù)熒光定量引物設(shè)計原則，使用Primer Premier 5軟件進行內(nèi)參基因的引物設(shè)計。引物交由福州尚亞生物技術(shù)公司合成(引物序列如表1所列)。

表1 內(nèi)參基因信息及其引物序列Table 1 Information of reference genes and their primer sequences

1.2.4內(nèi)參基因的普通PCR和qRT-PCR擴增

不同處理組均以1 μL葉片、莖和根的cDNA作為模板，按照Golden Easy PCR System (TIANGEN BIOTECH，Beijing，China)試劑盒進行普通PCR擴增。擴增程序：94 ℃反應(yīng)3 min；94 ℃反應(yīng)30 s，55 ℃反應(yīng)20 s，72 ℃反應(yīng)1 min，30個循環(huán)；最后于72 ℃反應(yīng)5 min。分別以1 μL葉片、莖和根的cDNA作為模板，使用RealUniversal Color PreMix (SYBR Green)(TIANGEN BIOTECH，Beijing，China)試 劑 盒進行qRT-PCR擴增操作。qRT-PCR試驗使用CFX Manager(Bio-Rad，USA)儀器。擴增程序：首先在95 ℃預(yù)變性反應(yīng)15 min；然后95 ℃變性反應(yīng)10 s；接著60 ℃退火反應(yīng)20 s；最后72 ℃延伸反應(yīng)30 s，其中變性、退火、延伸反應(yīng)重復(fù)40個循環(huán)。不同處理組下每個組織均選用3個生物學(xué)重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

通過CFX Manager (Bio-Rad，USA)分析軟件直接獲得內(nèi)參基因qRT-PCR的Ct值。geNorm軟件由Ct值計算出每個內(nèi)參基因的平均表達穩(wěn)定值(M)和配對變異值(Vn/n+1)。其中，M值越小，基因越穩(wěn)定。Vn/n+1用來確定最適基因的數(shù)量，當(dāng)Vn/n+1＜ 0.15時，最適基因數(shù)為n個；NormFinder軟件也是由Ct值計算內(nèi)參基因穩(wěn)定值；BestKeeper軟件由Ct值計算標(biāo)準(zhǔn)偏差值(SD)，SD值越小，基因越穩(wěn)定。最后通過賦值法綜合排序，穩(wěn)定性從高到低依次記為1～8，數(shù)值最小的基因最穩(wěn)定。

2 結(jié)果分析

2.1 樣品RNA質(zhì)量檢測、引物擴增特異性及內(nèi)參基因qRT-PCR分析

通過NanoDrop 2000C分光光度計檢測總RNA的濃度和純度。本研究中OD260/OD280值均在1.8～2.1，表明RNA的純度高。將巨菌草葉片、莖和根的cDNA等量混合后擴增內(nèi)參基因片段，并用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。在100～250 bp存在較亮的特異性條帶，條帶的大小與預(yù)期相符合，說明引物可用于接下來的qRT-PCR試驗(圖1)。將巨菌草葉片、莖、根的cDNA等量混合后，以此為模板進行qRT-PCR。由溶解曲線可知(圖2)，所有曲線均為單一峰，未出現(xiàn)其他峰段，表明試驗過程中沒有出現(xiàn)非特異擴增。此外，內(nèi)參基因Tm值均80～90 ℃，引物特異性表達強，符合qRT-PCR分析的要求。

圖1 內(nèi)參基因的PCR擴增產(chǎn)物Figure 1 PCR amplification products of 8 reference genes

圖2 內(nèi)參基因溶解曲線圖Figure 2 Melting curves of 8 reference genes

2.2 正常生長下巨菌草內(nèi)參基因的穩(wěn)定性分析

2.2.1正常生長下巨菌草內(nèi)參基因穩(wěn)定性geNorm分析

geNorm算法不受基因表達豐度的影響，通過一個基因與其他基因?qū)Ρ?，計算M值。M ＜ 1.5的基因表達相對穩(wěn)定[7]。正常生長下的巨菌草葉片、莖和根中所有內(nèi)參基因的M值均小于1.5，表明所選內(nèi)參基因都穩(wěn)定表達。其中，葉片中ACTB(0.050)和Actin(0.050)表達最穩(wěn)定；莖中ACTB(0.015)和UBQ(0.015)表達最穩(wěn)定；根中ACTB(0.034)和GAPDH(0.034)表達最穩(wěn)定(圖3)。此外，通過geNorm軟件計算Vn/n+1，當(dāng)Vn/n+1＜ 0.15時，最適基因數(shù)為n。葉片、莖和根中的V2/3依次為0.035、0.019和0.028 (圖4)，均小于0.15。所以正常生長下巨菌草葉片、莖、根所需的最適內(nèi)參基因數(shù)均為2。

圖3 正常生長下不同組織中內(nèi)參基因geNorm分析穩(wěn)定值Figure 3 Expression stability value of the reference genes in different tissues under normal growth by geNorm

圖4 正常生長下不同組織中配對差異分析(Vn/n+1)最佳組合的內(nèi)參基因數(shù)Figure 4 Paired difference analysis (Vn/n+1), the best combination of reference genes number in different tissues under normal growth

2.2.2正常生長下巨菌草內(nèi)參基因穩(wěn)定性NormFinder分析

雖然原理與geNorm軟件相似，但NormFinder軟件不能確定最適基因數(shù)，其在分析數(shù)據(jù)前需將基因的Ct值轉(zhuǎn)化成相對表達量，然后基于方差分析計算M值。正常生長下，ACTB(0.017)和Actin(0.017)在葉片中表達最穩(wěn)定；ACTB(0.006)在莖中表達最穩(wěn)定；ACTB(0.010)在根中表達最穩(wěn)定(表2)。

表2 正常生長下不同組織中內(nèi)參基因NormFinder分析穩(wěn)定值Table 2 Analysis of the stabilities of reference genes in different tissues under normal growth by NormFinder

2.2.3正常生長下巨菌草內(nèi)參基因穩(wěn)定性BestKeeper分析

BestKeeper通過比較內(nèi)參基因的Ct值，計算得到標(biāo)準(zhǔn)偏差值SD(standard deviation,SD)，從而評價內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，當(dāng)SD＞ 1，表明該基因不適合作為內(nèi)參基因，反之SD越小，基因越穩(wěn)定。所以，正常生長的巨菌草葉片中最穩(wěn)定基因為Actin(0.04)和EF-1α(0.04)；莖中為ACTB(0.04)；根中為Actin(0.04)和18srRNA(0.04) (表3)。

表3 正常生長下不同組織中內(nèi)參基因BestKeeper分析標(biāo)準(zhǔn)差Table 3 Standard deviation of reference genes in different tissues under normal growth by BestKeeper analysis

2.3 不同干旱脅迫下巨菌草內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析

2.3.1不同干旱脅迫下巨菌草內(nèi)參基因穩(wěn)定性geNorm分析

干旱脅迫7 d，葉片中g(shù)eNorm表達穩(wěn)定性最好的基因為UBQ(0.024)和18s rRNA(0.024)；莖中為GAPDH(0.057)和ACTB(0.057)；根中為GAPDH(0.037)和UBQ(0.037) (圖5)。干旱脅迫14 d，Actin(0.044)和GAPDH(0.044)在葉片中穩(wěn)定性最好；18s rRNA(0.068)和UBQ(0.068)在莖中穩(wěn)定性最好；ACTB(0.038)和18s rRNA(0.038)在根中穩(wěn)定性最好。干旱脅迫21 d，葉片中UBQ(0.025)和ACTB(0.025)表達最穩(wěn)定；莖中18s rRNA(0.031)和TUB(0.031)表達最穩(wěn)定；根中GAPDH(0.053)和18s rRNA(0.053)表達最穩(wěn)定。對干旱脅迫7、14和21 d基因geNorm表達穩(wěn)定性進行綜合排序。其中葉片中內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性由低到高依次為CYP＜EF-1α＜TUB＜18s rRNA＜ACTB=UBQ＜GAPDH＜Actin；莖中為CYP＜EF-1α＜Actin＜UBQ＜GAPDH＜TUB＜ACTB＜18s rRNA；根中 為TUB＜EF-1α＜CYP＜UBQ＜Actin＜ACTB＜GAPDH＜18s rRNA。即geNorm分析干旱脅迫處理下巨菌草葉片的最穩(wěn)定基因為Actin；莖和根均為18s rRNA。

圖5 不同干旱脅迫、不同組織中內(nèi)參基因geNorm分析穩(wěn)定值Figure 5 Analysis of the stabilities of reference genes in different tissues under different drought stress by geNorm

干旱脅迫7 d處理下，葉片、莖、根的V2/3值依次為0.019、0.020和0.05 (圖6 )；干旱脅迫14 d，葉片、莖、根的V2/3值依次為0.026、0.036和0.019；干旱脅迫21 d，葉片、莖、根的V2/3值依次為0.033、0.017和0.045。上述V2/3值均小于0.15。表明干旱脅迫處理下巨菌草葉片、莖、根所需的最適內(nèi)參基因數(shù)均為2。

圖6 不同干旱脅迫、不同組織中配對差異分析(Vn/n+1)最佳組合的內(nèi)參基因數(shù)Figure 6 Paired difference analysis (Vn/n+1), the best combination of reference genes number in different tissues under different drought stress

2.3.2不同干旱脅迫下巨菌草內(nèi)參基因穩(wěn)定性NormFinder分析

干旱脅迫處理下內(nèi)參基因NormFinder分析的穩(wěn)定值(表4)中，干旱脅迫7 d，葉片中最穩(wěn)定基因為ACTB(0.006)；莖中為GAPDH(0.015)；根中為18s rRNA(0.029)和ACTB(0.029)。干旱脅迫14 d，Actin(0.015)和GAPDH(0.015)在葉片中表達最穩(wěn)定；18s rRNA(0.024)在莖中表達最穩(wěn)定；UBQ(0.016)在根中表達最穩(wěn)定。干旱脅迫21 d，葉片中GAPDH(0.009)表達最穩(wěn)定；莖中ACTB(0.009)表達最穩(wěn)定；根中18s rRNA(0.018)和GAPDH(0.018)表達最穩(wěn)定。對干旱脅迫7、14和21 d NormFinder表達穩(wěn)定性進行綜合排序，其中葉片中內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性由低到高依次為TUB＜UBQ＜CYP＜EF-1α＜ACTB=18s rRNA＜GAPDH=Actin；莖中為CYP＜Actin=EF-1α=UBQ＜TUB＜ACTB＜GAPDH＜18s rRNA；根中為TUB＜UBQ=EF-1α＜CYP＜GAPDH＜Actin=ACTB＜18s rRNA。即NormFinder分析干旱脅迫處理下巨菌草葉片的最穩(wěn)定基因為Actin和GAPDH；莖和根均為18s rRNA。

表4 不同干旱脅迫、不同組織中內(nèi)參基因NormFinder分析穩(wěn)定值Table 4 Analysis of the stabilities of reference genes in different tissues under different drought stress by NormFinder

2.3.3不同干旱脅迫下巨菌草內(nèi)參基因穩(wěn)定性BestKeeper分析

干旱脅迫7 d，BestKeeper分析葉片中最穩(wěn)定基因為TUB(0.03)；莖中為ACTB(0.02)；根中為Actin(0.03)。干旱脅迫14 d，GAPDH(0.04)和ACTB(0.04)在葉片中表達最穩(wěn)定；18s rRNA(0.02)在莖中表達最穩(wěn)定；ACTB(0.01)在根中表達最穩(wěn)定。干旱脅迫21 d，葉片中UBQ(0.02)和ACTB(0.02)表達最穩(wěn)定；莖中TUB(0.06)、GAPDH(0.06)和ACTB(0.06)表達最穩(wěn)定；根中18s rRNA(0.02)表達最穩(wěn)定(表5)。對干旱脅迫7、14和21 dBestKeeper表達穩(wěn)定性進行綜合排序，其中葉片中內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性由低到高依次為CYP＜TUB＜18s rRNA＜Actin=UBQ＜GAPDH=EF-1α＜ACTB；莖中為CYP＜Actin＜UBQ＜EF-1α＜TUB＜18s rRNA=GAPDH=ACTB；根中為TUB＜UBQ＜EF-1α＜GAPDH＜CYP＜Actin＜ACTB＜18s rRNA。即BestKeeper分析干旱脅迫處理下巨菌草葉片的最穩(wěn)定基因為ACTB；莖為18s rRNA、GAPDH和ACTB；根為18s rRNA。

表5 不同干旱脅迫、不同組織中內(nèi)參基因BestKeeper分析穩(wěn)定值Table 5 Analysis of the stabilities of reference genes in different tissues under different drought stress by BestKeeper

2.4 不同鹽堿脅迫下巨菌草內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析

2.4.1不同鹽堿脅迫下巨菌草內(nèi)參基因穩(wěn)定性geNorm分析

60 mmol·L-1混合鹽堿脅迫，geNorm分析葉片中最穩(wěn)定基因為UBQ(0.079)和EF-1α(0.079)；莖中為TUB(0.039)和GAPDH(0.039)；根中為UBQ(0.066)和TUB(0.066) (圖7)。120 mmol·L-1混合鹽堿脅迫，Actin(0.031)和GAPDH(0.031)在葉片中表達最穩(wěn)定；ACTB(0.054)和Actin(0.054)在莖中表達最穩(wěn)定；TUB(0.069)和CYP(0.069)在根中表達最穩(wěn)定。180 mmol·L-1混合鹽堿脅迫，葉片中UBQ(0.078)和GAPDH(0.078)表達最穩(wěn)定；莖中TUB(0.037)和GAPDH(0.037)表達最穩(wěn)定；根中UBQ(0.050)和EF-1α(0.050)表達最穩(wěn)定。對60、120和180 mmol·L-1混合鹽堿脅迫geNorm表達穩(wěn)定性進行綜合排序，其中葉片中內(nèi)參基因表達穩(wěn)定性由低到高依次為CYP＜ACTB＜18s rRNA＜EF-1α＜Actin＜TUB＜UBQ＜GAPDH；莖中 為CYP＜UBQ=18s rRNA＜Actin＜ACTB=EF-1α＜GAPDH＜TUB；根中為Actin＜18s rRNA＜EF-1α=CYP=GAPDH＜ACTB＜TUB＜UBQ。即geNorm分析鹽堿脅迫處理下巨菌草葉片的最穩(wěn)定基因為GAPDH；莖為TUB；根為UBQ。

圖7 不同鹽堿脅迫、不同組織中內(nèi)參基因geNorm分析穩(wěn)定值Figure 7 Analysis of the stabilities of reference genes in different tissues under different salt-alkali stress by geNorm

60 mmol·L-1混合鹽堿脅迫處理下，葉片、莖、根的V2/3值依次為0.036、0.030和0.029 (圖8)；120 mmol·L-1混合鹽堿脅迫，葉片、莖、根的V2/3值依次為0.016、0.035和0.046；180 mmol·L-1混合鹽堿脅迫，葉片、莖、根的V2/3值依次為0.031、0.024和0.043。上述V2/3值均小于0.15，表明鹽堿脅迫處理下巨菌草葉片、莖、根所需的最適內(nèi)參基因數(shù)均為2。

圖8 不同鹽堿脅迫、不同組織中配對差異分析(Vn/n+1)最佳組合的內(nèi)參基因數(shù)Figure 8 Paired difference analysis (Vn/n+1), the best combination of reference genes number in different tissues under different salt-alkali stress

2.4.2不同鹽堿脅迫下巨菌草內(nèi)參基因穩(wěn)定性NormFinder分析

60 mmol·L-1混合鹽堿脅迫，NormFinder分析葉片中最穩(wěn)定基因為EF-1α(0.027)；莖中為TUB(0.034)；根中為GAPDH(0.029)。120 mmol·L-1混合鹽堿脅迫，Actin(0.011)和GAPDH(0.011)在葉片中表達最穩(wěn)定；UBQ(0.027)在莖中表達最穩(wěn)定；GAPDH(0.032)在根中表達最穩(wěn)定。180 mmol·L-1混合鹽堿脅迫，葉片中GAPDH(0.013)表達最穩(wěn)定；莖中TUB(0.013)表達最穩(wěn)定；根中UBQ(0.017)表達最穩(wěn)定(表6)。對60、120和180 mmol·L-1混合鹽堿脅迫NormFinder表達穩(wěn)定性進行綜合排序，其中內(nèi)參基因在葉片中表達穩(wěn)定性由低到高依次為CYP＜ACTB＜Actin=EF-1α＜TUB=18s rRNA＜UBQ＜GAPDH；莖中為CYP＜Actin＜UBQ＜18s rRNA=EF-1α＜GAPDH＜ACTB＜TUB；根中為TUB＜EF-1α＜Actin=18s rRNA＜CYP＜ACTB＜GAPDH=UBQ。即NormFinder分析鹽堿脅迫處理下巨菌草葉片的最穩(wěn)定基因為GAPDH；莖為TUB；根為UBQ和GAPDH。

表6 不同鹽堿脅迫、不同組織中內(nèi)參基因NormFinder分析穩(wěn)定值Table 6 Analysis of the stabilities of reference genes in different tissues under different salt-alkali stress by NormFinder

2.4.3不同鹽堿脅迫下巨菌草內(nèi)參基因穩(wěn)定性BestKeeper分析

60 mmol·L-1混合鹽堿脅迫， BestKeeper分析葉片中最穩(wěn)定基因為EF-1α(0.03)；莖中為GAPDH(0.04)、TUB(0.04)和EF-1α(0.04)；根中為18s rRNA(0.03)。120 mmol·L-1混合鹽堿脅迫，GAPDH(0.04)在葉中表達最穩(wěn)定；UBQ(0.04)在莖中表達最穩(wěn)定；GAPDH(0.04)在根中表達最穩(wěn)定。180 mmol·L-1混合鹽堿脅迫，葉片中GAPDH(0.04)表達最穩(wěn)定；莖中TUB(0.06)表達最穩(wěn)定；根中TUB(0.04)表達最穩(wěn)定(表7)。對60、120和180 mmol·L-1混合鹽堿脅迫BestKeeper表達穩(wěn)定性進行綜合排序，其中內(nèi)參基因在葉片中表達穩(wěn)定性由低到高依次為CYP＜ACTB＜18s rRNA=Actin＜EF-1α=UBQ＜TUB＜GAPDH；莖中為CYP＜Actin＜UBQ＜ACTB=GAPDH=18s rRNA＜EF-1α＜TUB；根中為CYP=Actin＜EF-1α＜18s rRNA＜TUB＜GAPDH＜UBQ＜ACTB。即BestKeeper分析鹽堿脅迫處理下巨菌草葉片的最穩(wěn)定基因為GAPDH；莖為TUB；根為ACTB。

表7 不同鹽堿脅迫、不同組織中內(nèi)參基因BestKeeper分析標(biāo)準(zhǔn)差Table 7 Standard deviation of reference genes in different tissues under different salt-alkali stress by BestKeeper analysis

2.5 不同處理下巨菌草內(nèi)參基因穩(wěn)定性賦值法綜合排序分析

由于各個算法得到的基因穩(wěn)定性表達結(jié)果存在差異，所以使用賦值法對3種算法的排序結(jié)果進行綜合分析。每個算法下各個內(nèi)參基因的穩(wěn)定性由高到低依次記為1～8，最終數(shù)值最小的基因最穩(wěn)定。賦值法綜合排序分析正常生長下，葉片中Actin基因穩(wěn)定性最好，CYP最差；莖中ACTB基因穩(wěn)定性最好，EF-1α最差；根中ACTB基因穩(wěn)定性最好，CYP最差。干旱脅迫處理下，GAPDH在葉片中穩(wěn)定性最好，CYP最差；18s rRNA在莖中穩(wěn)定性最好，CYP最差；18s rRNA在根中穩(wěn)定性最好，TUB最差。鹽堿脅迫處理下，葉片中最穩(wěn)定基因為GAPDH，最不穩(wěn)定基因為CYP；莖中最穩(wěn)定基因為TUB，最不穩(wěn)定基因為CYP；根中最穩(wěn)定基因為UBQ，最不穩(wěn)定基因為Actin(表8)。

表8 不同處理、不同組織中內(nèi)參基因穩(wěn)定性綜合排序Table 8 Comprehensive ranking of the stability of reference genes in different tissues under different treatments

3 討論與分析

現(xiàn)代分子生物學(xué)常以qRT-PCR技術(shù)進行目的基因表達情況的分析，而選擇合適的內(nèi)參基因是獲得準(zhǔn)確表達結(jié)果的前提。但由于發(fā)現(xiàn)新的內(nèi)參基因?qū)夹g(shù)的要求高且試驗步驟繁瑣，因此現(xiàn)常用傳統(tǒng)內(nèi)參基因來校正目的基因的表達量。本研究選用8個傳統(tǒng)內(nèi)參基因(18s rRNA、Actin、GAPDH、ACTB、EF-1α、UBQ、CYP、TUB)作為候選內(nèi)參基因。其中，18s rRNA為真核核糖體RNA，作為細胞中的保守基因，常參與編碼核糖體基因和核糖體循環(huán)[26-27]；Actin是細胞骨架的基本構(gòu)成單位，參與細胞分裂等生理活動[28]；GAPDH參與糖酵解、糖異生等過程[29]；EF-1α在蛋白質(zhì)合成延伸過程中起作用；UBQ為多聚泛素酶，常作用于修飾蛋白質(zhì)；TUB參與細胞生長過程；CYP參與調(diào)節(jié)肽基脯氨酸順反異構(gòu)酶活性[3]。

本研究對巨菌草進行正常生長、干旱脅迫以及鹽堿脅迫處理后，通過geNorm、NormFinder和BestKeeper計算8個內(nèi)參基因在葉片、莖和根中的表達穩(wěn)定值。但各個軟件的算法原理不同，得出的最穩(wěn)定基因也不一致。這在如羊草[20]、二穗短柄草(Brachypodium distachyon)[30]、大豆(Glycine max)[31]等內(nèi)參基因研究中也存在。geNorm通過計算基因穩(wěn)定性M值和配對變異V值來確定基因的穩(wěn)定性和最適基因的數(shù)量。M值低于閾值1.5，說明該基因適合作內(nèi)參，反之則不適合，且M值越小穩(wěn)定性越好。而當(dāng)Vn/n＋1＜ 0.15時，最適基因數(shù)為n個[4]。NormFinder與 geNorm計算原理大致上相同，都是基于計算內(nèi)參基因的穩(wěn)定性數(shù)值來確定基因是否穩(wěn)定。其中g(shù)eNorm是在不考慮其他基因的情況下，以該基因的組內(nèi)表達情況進行排序，而NormFinder則是根據(jù)樣品組內(nèi)變異和組間變異進行排序[4,32]。BestKeeper以原始Ct值進行配對相關(guān)性分析計算得到標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，若SD低于閾值1，則表明基因穩(wěn)定表達，適合作為內(nèi)參基因，反之則不適合，且SD越小越穩(wěn)定[4]。本試驗處理下的內(nèi)參基因的M值均小于1.5，SD值均小于1，表明各內(nèi)參基因符合要求。因此，最后通過賦值法綜合篩選出最佳的內(nèi)參基因。

Actin基因的基因序列具有高度保守性，使其幾乎在所有真核細胞中都有表達，被認(rèn)為是qRTPCR分析中內(nèi)參基因的合適選擇[33-34]。有研究表明在羊草葉片中Actin穩(wěn)定性較高[20]；在草地早熟禾葉片的不同發(fā)育期Actin表達也最為穩(wěn)定[7]；在不同處理條件下的大麥中Actin表達均穩(wěn)定[11]，與本研究結(jié)果相符，即本研究正常生長下的葉、莖和根中Actin類基因均穩(wěn)定表達。18s RNA在本研究所有處理下表達豐度均較高，且在干旱脅迫下莖和根中表達最穩(wěn)定。但有研究[35-36]表明，雖然18s RNA表達豐度較高，但其穩(wěn)定性差，因此不適合作為蟲害處理下水稻和鋁處理下繡球(Hydrangea macrophylla)的內(nèi)參基因?？紤]到樣本RNA量、目標(biāo)基因表達豐度等均會影響18s rRNA的表達穩(wěn)定性[7]。因此，可根據(jù)試驗需要選擇另一個穩(wěn)定的內(nèi)參基因與18s rRNA組合，而不是單獨以18s rRNA作為內(nèi)參基因進行目的基因表達分析。但若目標(biāo)基因表達豐度高，則可用18s rRNA單獨作為內(nèi)參基因。本研究的多數(shù)條件下CYP表達都不穩(wěn)定，但在Mallona等[37]對矮牽牛(Petunia hybrida)葉與花組織的研究下，CYP和EF-1α可作為穩(wěn)定的內(nèi)參基因組合來進行目的基因表達量的校正。丁蘇芹等[38]的研究表明，在小蒼蘭(Freesia hybrida)不同發(fā)育時期的球莖中CYP表達最不穩(wěn)定，而在不同外源激素誘導(dǎo)下的小蒼蘭種球中CYP穩(wěn)定性較好。進一步說明不同條件下同一個基因的穩(wěn)定性也不相同。后續(xù)研究可在確定具體的試驗條件后再進行內(nèi)參基因的篩選，從而提高試驗數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。正因如此，有些研究選擇兩個或以上基因組合來校正數(shù)據(jù)，從而更好的提高數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。如武志娟等[21]通過ΔCt、geNorm和NormFinder方法對干旱脅迫下的大針茅葉和根部組織進行分析后，再從每個分析中選擇穩(wěn)定表達的前3個基因，最終確定葉中穩(wěn)定基因組合為18s rRNA和TLF；根中為18s rRNA和EF-1α。

本研究中，正常生長下，Actin在葉中表達最為穩(wěn)定；ACTB在莖和根中表達最為穩(wěn)定。干旱脅迫下，GAPDH在葉中表達最為穩(wěn)定；18s rRNA在莖和根中表達最為穩(wěn)定。鹽堿脅迫下，GAPDH在葉中表達最為穩(wěn)定；TUB在莖中表達最為穩(wěn)定；UBQ在根中表達最為穩(wěn)定。未發(fā)現(xiàn)在不同條件下均穩(wěn)定表達的基因，這與前人關(guān)于植物內(nèi)參基因的報道相同，但上述結(jié)論可以作為日后巨菌草在脅迫處理下的合適候選內(nèi)參。此外，在實際研究中不太可能因不同組織選用不同內(nèi)參，在兼顧穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性的基礎(chǔ)上，通過賦值法將內(nèi)參基因在不同處理下的穩(wěn)定性前三者進行統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)ACTB除在鹽堿脅迫處理下的葉片外，其他處理下的各個組織中穩(wěn)定性均在前三。表明ACTB在不同處理下的較穩(wěn)定，受外界因素變化的影響相比其余基因較小，因此本研究中篩選的巨菌草內(nèi)參基因為ACTB。

4 結(jié)論

本研究基于qRT-PCR對正常生長、干旱脅迫和鹽堿脅迫處理下巨菌草的葉片、莖和根的內(nèi)參基因進行了篩選，發(fā)現(xiàn)ACTB表達較穩(wěn)定，為巨菌草的內(nèi)參基因。由于目前暫無巨菌草內(nèi)參基因穩(wěn)定性的研究，因而本研究結(jié)果為后續(xù)巨菌草功能基因表達分析奠定了基礎(chǔ)。