張 娜，左曉霜，王文慧

1.空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院骨科,西安 710032；2.空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院腫瘤科，西安 710032

神經(jīng)損傷可導(dǎo)致嚴(yán)重殘疾，對(duì)患者的活動(dòng)及生活質(zhì)量產(chǎn)生影響。與中樞神經(jīng)系統(tǒng)不同，周圍神經(jīng)具有再生能力，這取決于病變的性質(zhì)和嚴(yán)重程度。外周神經(jīng)損傷后，損傷部位的神經(jīng)纖維碎片和中斷的軸突可能阻礙神經(jīng)的再生，導(dǎo)致神經(jīng)元死亡[1]。多項(xiàng)研究表明，顯微手術(shù)器械的發(fā)展和新的縫合技術(shù)可修復(fù)患者的周圍神經(jīng)損傷[2- 3]，但目前仍沒有任何藥物能夠克服神經(jīng)損傷后軸突再生功能的局限性[4]。因此，迫切需要一種新的治療外周神經(jīng)損傷的策略。

MicroRNAs (miRNAs)是一種內(nèi)源性編碼的小RNA，研究顯示其是一類重要的新型分子開關(guān)，通過作用于靶基因的3’端，促進(jìn)蛋白質(zhì)編碼基因(mRNA)降解和(或)抑制蛋白翻譯，作為基因轉(zhuǎn)錄后的重要調(diào)節(jié)因子，在轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控中發(fā)揮作用[5]。miRNAs的產(chǎn)生是通過發(fā)育和再生的生物信號(hào)來調(diào)控的，這些信號(hào)與經(jīng)典的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子結(jié)合，協(xié)同放大廣泛的生物和細(xì)胞行為的改變，包括神經(jīng)發(fā)育、細(xì)胞存活和突觸重排。而且，神經(jīng)系統(tǒng)疾病與miRNA改變之間也存在相關(guān)性[6]。盡管針對(duì)miRNA進(jìn)行了大量研究， 但相對(duì)于mRNA，目前人們對(duì)miRNA的功能認(rèn)識(shí)還十分有限，尤其在神經(jīng)再生過程中的作用還鮮有報(bào)道。大量研究表明，miR-205-5p在乳腺癌、胃癌和子宮內(nèi)膜癌中具有抑制細(xì)胞增殖和侵襲的作用[7-9]，然而，miR-205-5p與周圍神經(jīng)損傷后再生的關(guān)系尚不清楚。

UHRF1是一種分子量為90kd的多結(jié)構(gòu)域蛋白，在調(diào)控表觀遺傳、機(jī)體生長(zhǎng)、發(fā)育及腫瘤發(fā)生等方面發(fā)揮重要調(diào)控作用。研究報(bào)道，UHRF1在調(diào)節(jié)結(jié)腸T細(xì)胞和造血干細(xì)胞的增殖、存活和分化中具有重要作用[10-11]，敲除小鼠胚胎中的UHRF1會(huì)表現(xiàn)出極端的生長(zhǎng)遲緩。此外，UHRF1可以促進(jìn)大腦皮層神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)育[12- 13]，并且在周圍神經(jīng)損傷后表達(dá)量明顯增高，能促進(jìn)軸突再生[14]。然而，在周圍神經(jīng)損傷情況下，miR-205-5p是否通過UHRF1發(fā)揮促進(jìn)神經(jīng)軸突再生的作用，目前鮮有報(bào)道。因此，該研究旨在確定miR-205-5p促進(jìn)大鼠坐骨神經(jīng)損傷修復(fù)的作用，希望為周圍神經(jīng)損傷提供了一種新的基于miRNA療法。

材料與方法

1 主要材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取0～2d齡SD大鼠10只，質(zhì)量5～6g，平均5.7g，用于提取嗅鞘細(xì)胞和背根神經(jīng)節(jié)；選取雄性SD大鼠30只用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，6～8周齡，質(zhì)量200～240g，平均214.6g。大鼠均購(gòu)置于空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，本實(shí)驗(yàn)經(jīng)空軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(KY20172005-1)。

1.2實(shí)驗(yàn)主要試劑 胞嘧啶(Sigma Aldrich公司，美國(guó))；B27(Gibco公司，美國(guó))；人神經(jīng)生長(zhǎng)因子(hNGF,R&D Systems公司，美國(guó))；L-谷氨酰胺(Gibco公司，美國(guó))；胰蛋白酶(北京Solarbio公司，中國(guó))；胎牛血清(Gibco公司，美國(guó))；DF12(DMEM和Ham’s F12的1∶1混合物)培養(yǎng)基(HyClone公司，美國(guó))；多聚左旋賴氨酸(poly-L-lysine，PLL)(Sigma公司，美國(guó))；青霉素-鏈霉素(北京Solarbio公司，中國(guó))；磷酸鹽緩沖鹽水(HyClone公司，美國(guó))；TRIzol(Invitrogen公司，美國(guó))；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒GoTaq@qPCR Master(Promega公司，美國(guó))；雙熒光素酶報(bào)告檢測(cè)試劑盒(Promega公司，美國(guó))；雙熒光素酶報(bào)告分析系統(tǒng)(Promega公司，美國(guó))；miRNA-205-5p抑制物，miRNA-205-5p-mimics和NC-mimics(上海吉?jiǎng)P基因公司，中國(guó))；UHRF1-siRNA和NC-siRNA(上海吉?jiǎng)P基因公司，中國(guó))；Lipofect AMINE 3000(上海銳賽生物公司，中國(guó))；Lipo6000TM(上海Beyotime公司，中國(guó))；miRNeasy Mini試劑盒和miRNeasy FFPE試劑盒 (Qiagen公司，德國(guó))；TaqMan MicroRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Applied Biosystems公司，德國(guó))；RAPI裂解緩沖液(上海Beyotime公司，中國(guó))；蛋白定量試劑盒(上海Beyotime公司，中國(guó))；UHRF1兔單克隆抗體(Abcam公司，美國(guó))；β-actin鼠單克隆抗體(Abcam公司，美國(guó))；β-tubulin-Ⅲ兔單克隆抗體(CST公司，美國(guó))；鼠抗NF160單克隆抗體(Abcam公司，美國(guó))；山羊抗兔綠色熒光二抗、山羊抗鼠紅色熒光二抗 (江蘇康為世紀(jì)公司，中國(guó))；山羊抗鼠二抗、山羊抗兔二抗(江蘇康為世紀(jì)公司，中國(guó))。

1.3實(shí)驗(yàn)主要儀器 臺(tái)式離心機(jī)(湖南湘儀公司，中國(guó))；培養(yǎng)瓶(廣州杰特生物，中國(guó))；電泳儀(BioRad公司，美國(guó))；轉(zhuǎn)膜儀(BioRad公司，美國(guó))；熒光顯微鏡(Olympus公司，日本)；熒光定量PCR儀(BioRad公司，美國(guó))；全自動(dòng)定量繪圖酶標(biāo)儀(BioTek公司，美國(guó))。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1新生SD大鼠背根神經(jīng)節(jié)(DRG)的提取和純化 將出生0～2d的SD大鼠置入冰凍的75%乙醇缸內(nèi)消毒處死，隨后轉(zhuǎn)移至超凈臺(tái)中，利用體視顯微鏡摘取背根神經(jīng)節(jié)，去除神經(jīng)周圍組織后用剪刀將神經(jīng)剪碎至1mm3小塊，然后用0.25%胰蛋白酶和0.2%Ⅳ型膠原酶消化60min，然后在含有2%的B27、50ng/mL的人神經(jīng)生長(zhǎng)因子(hNGF)、2mM的L-谷氨酰胺和1%的青鏈霉素混合液的神經(jīng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。差速貼壁純化后，用10μmol/L的胞嘧啶處理48 h去除其中的成纖維細(xì)胞。然后培養(yǎng)基被不含胞嘧啶的神經(jīng)基培養(yǎng)基替代，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2成年SD大鼠坐骨神經(jīng)損傷模型的構(gòu)建 選用SD大鼠30只，分為損傷組(15只)和對(duì)照組(15只)，腹腔內(nèi)注射3%戊巴比妥鈉溶液麻醉，切開左后肢的皮膚和鈍性分裂下面的組織，小心地暴露出左側(cè)坐骨神經(jīng)。在坐骨神經(jīng)上靠近背根神經(jīng)節(jié)一端距離坐骨神經(jīng)分叉處1cm的位置用止血鉗擠壓10s，然后將肌肉和表皮進(jìn)行縫合，損傷和對(duì)照組的SD大鼠同時(shí)暴露坐骨神經(jīng)，但對(duì)照組不對(duì)坐骨神經(jīng)進(jìn)行擠壓，為3d后提取神經(jīng)元做準(zhǔn)備。

2.3成年SD大鼠的DRG神經(jīng)元的提取和神經(jīng)長(zhǎng)度分析 實(shí)驗(yàn)方法2.2中預(yù)處理損傷及對(duì)照組的SD大鼠中分離出L4的背根神經(jīng)節(jié)，分別從對(duì)照組和損傷組取部分DRG組織用于檢測(cè)miR-205-5p的表達(dá)情況。將取出的其他DRG組織剪碎后，置于含10mmol/L羥乙基哌嗪乙硫磺酸(HBSS-H)的Hanks平衡鹽溶液中，37℃下連續(xù)應(yīng)用含有木瓜蛋白酶(15U/mL)和膠原酶(1.5mg/mL)的HBSS-H溶液處理背根神經(jīng)節(jié)，用100 μm的細(xì)胞濾網(wǎng)過濾細(xì)胞。然后重懸于含有2%的B27(Gibco)、50ng/mL的hNGF、2mM的L-谷氨酰胺和1%的青鏈霉素混合液的神經(jīng)培養(yǎng)基中，并在含有聚d-賴氨酸/層黏連蛋白涂層的培養(yǎng)皿上培養(yǎng)。成年DRG神經(jīng)元培養(yǎng)20h，用β-III-tubulin(1∶200)染色。觀察DRG軸突生長(zhǎng)情況，測(cè)量其最長(zhǎng)神經(jīng)軸突長(zhǎng)度，并計(jì)算軸突的總長(zhǎng)度。

2.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-205-5p的表達(dá)水平 細(xì)胞中總RNA提取使用miRNeasy Mini試劑盒,組織中總RNA提取使用miRNeasy FFPE試劑盒。使用TaqMan MicroRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。根據(jù)制造商的說明，使用TaqMan MicroRNA檢測(cè)系統(tǒng)(應(yīng)用生物系統(tǒng))測(cè)量miR-205-5p的表達(dá)情況。RNU6B(MicroRNA內(nèi)參)被用作內(nèi)部對(duì)照,使用比較閾值(Ct)法計(jì)算相對(duì)表達(dá)。

2.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)UHRF1的表達(dá)水平 取適量背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，加入1mL TRIzol進(jìn)行勻漿，加入200μL氯仿萃取并離心取上清液，再加入等體積異丙醇，-20 ℃靜置過夜沉淀RNA；離心除去上清液，用75%乙醇溶液洗滌沉淀后，將RNA溶解于無酶的去離子水中。

利用酶標(biāo)儀檢測(cè)提取的RNA的濃度和純度，利用GoScript反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)獲得cDNA，之后使用Promega GoTaq@qPCR Master Mix行實(shí)時(shí)Q-PCR分析，以2-ΔΔCt值表示目的基因的相對(duì)表達(dá)量，引物序列見表1。

2.6miR-205-5p對(duì)DRG神經(jīng)元的影響 將提取的新生SD大鼠DRG神經(jīng)元分為4組，一組用PBS處理，其余三組使用脂質(zhì)體法(Lipofect AMINE 3000)分別轉(zhuǎn)染50nM的miR-205-5p-mimic、抑制物和miRNA-NC。轉(zhuǎn)染流程參閱試劑盒提供的操作說明， 每組細(xì)胞設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。轉(zhuǎn)染后細(xì)胞在37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育24h，用β-III-tubulin(1∶200)染色。觀察DRG神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)情況，測(cè)量其最長(zhǎng)神經(jīng)軸突長(zhǎng)度。

2.7熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè) miR-205-5p與UHRF1基因的相關(guān)性 通過Starbase網(wǎng)站(starbase.sysu.edu.cn/)分析miR-205-5p的相關(guān)靶基因，發(fā)現(xiàn)UHRF1基因可能是miR-205-5p的靶基因。

熒光素酶報(bào)告檢測(cè)按照制造商的方案進(jìn)行。293T細(xì)胞(工具細(xì)胞，具有易轉(zhuǎn)染特點(diǎn))被接種于24孔板中，使用Lipo6000TM將熒光素酶報(bào)告基因UHRF1-3’-UTR-WT或UHRF1-3’-UTR-MUT其中一種和miR-205-5p-mimics(50nm)或NC-mimics其中一種共轉(zhuǎn)染。根據(jù)制造商的協(xié)議，使用雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒測(cè)定熒光素酶活性。每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.8miR-205-5p過表達(dá)對(duì)大鼠DRG神經(jīng)元的影響 將提取的成年雄性SD大鼠DRG神經(jīng)元分為NC-mimics+未損傷、NC-mimics+損傷、miR-205-5p-mimics+未損傷和miR-205-5p-mimics+損傷4組，按照分組使用脂質(zhì)體法分別向其轉(zhuǎn)入對(duì)應(yīng)的質(zhì)粒。每組細(xì)胞設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。轉(zhuǎn)染后細(xì)胞在37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育24 h，用蛋白免疫印跡法(WB)檢測(cè)UHRF1的表達(dá)情況。

2.9檢測(cè)UHRF1的干擾RNA(UHRF1-siRNA)對(duì)坐骨神經(jīng)損傷大鼠DRG神經(jīng)元UHRF1表達(dá)的影響 為了敲除UHRF1，將提取的坐骨神經(jīng)損傷的成年雄性SD大鼠DRG神經(jīng)元分為損傷+NC、損傷+ UHRF1-siRNA1、損傷+ UHRF1-siRNA2和損傷+ UHRF1-siRNA3共4組，分別轉(zhuǎn)染25 nM的NC-siRNA、UHRF1-siRNA1、UHRF1-siRNA2和UHRF1-siRNA3。使用脂質(zhì)體法分別將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞。轉(zhuǎn)染流程參閱試劑盒提供的操作說明， 每組細(xì)胞設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。轉(zhuǎn)染后細(xì)胞在37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育24h，并用Q-PCR和蛋白質(zhì)印跡法(WB)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

2.10檢測(cè)miR-205-5p通過調(diào)節(jié)UHRF1表達(dá)進(jìn)而調(diào)控DRG神經(jīng)元軸突再生 將提取的新生SD大鼠DRG神經(jīng)元分為miR-NC、miR-205-5p抑制物、miR-205-5p抑制物+si-NC和miR-205-5p inhibitor+UHRF1-si-UHRF1共4組，按照分組使用脂質(zhì)體法分別向其轉(zhuǎn)入對(duì)應(yīng)的質(zhì)粒。每組細(xì)胞設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。轉(zhuǎn)染后細(xì)胞在37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育24h，用β-III-tubulin(1∶200)染色。觀察DRG神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)情況，測(cè)量其最長(zhǎng)神經(jīng)軸突長(zhǎng)度。

2.11蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)UHRF1蛋白表達(dá)水平 收集上述各組涉及到WB實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞，用RIPA裂解液處理細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，通過使用蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。取等量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分離，并用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上。用含5%脫脂奶粉封閉處理PVDF膜2h，按照1∶1000的稀釋比例配制一抗(UHRF1、β-actin)，4 ℃孵育過夜。用PBST清洗3次，每次5min。按照1∶3000的稀釋比例加入二抗，室溫孵1h，用PBST清洗3次，每次5min。最后使用化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影，分析各蛋白條帶的灰度值。以UHRF1蛋白與β-actin蛋白條帶灰度值之比表示其相對(duì)表達(dá)水平。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物情況

坐骨神經(jīng)損傷和對(duì)照組大鼠各15只，均存活，全部進(jìn)入后續(xù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析。

2 坐骨神經(jīng)損傷后，神經(jīng)再生能力增強(qiáng)，并且miR-205-5p表達(dá)降低

通過β-Ⅲ-tubulin染色發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組對(duì)比，坐骨神經(jīng)損傷組DRG神經(jīng)元最長(zhǎng)神經(jīng)軸突長(zhǎng)度顯著增加(P<0.01，圖1a、b)。采用Q-PCR檢測(cè)了損傷和未損傷SD大鼠的DRG組織和細(xì)胞中miR-205-5p的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，損傷組SD大鼠的DRG組織和細(xì)胞中miR-205-5p的表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組(P<0.01，圖1c)。以上結(jié)果表明，機(jī)體發(fā)生坐骨神經(jīng)損傷后，miR-205-5p表達(dá)水平明顯下降。

圖1 大鼠坐骨神經(jīng)損傷引起軸突再生，并抑制miRNA-205-5p表達(dá)。a、b.從對(duì)照組和損傷組大鼠身上分離的成年DRG神經(jīng)元，培養(yǎng)20h，用神經(jīng)元特異性標(biāo)記物β-tubulinⅢ染色；c.Q-PCR檢測(cè)坐骨神經(jīng)損傷后miRNA-205-5p在坐骨神經(jīng)損傷中的表達(dá)。標(biāo)尺:50μm。與對(duì)照組比較：**P<0.01

3 抑制miR-205-5p表達(dá)促進(jìn)背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突生長(zhǎng)

以新生SD大鼠提取的DRG細(xì)胞為模型，Q-PCR法檢測(cè)結(jié)果(圖2a)顯示，與PBS組和NC-mimics組相比，miR-205-5p-mimics組DRG中miR-205-5p的表達(dá)水平明顯上調(diào)，miR-205-5p inhibitor組DRG中miR-205-5p的表達(dá)水平顯著下降，提示成功構(gòu)建了miR-205-5p過表達(dá)及低表達(dá)的背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。

與PBS對(duì)照組和NC-mimics組對(duì)比，miR-205-5p抑制物組背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的最長(zhǎng)神經(jīng)軸突長(zhǎng)度顯著增加(P< 0.001，圖2b、c)。以上數(shù)據(jù)表明，抑制miR-205-5p表達(dá)能在體外環(huán)境中促進(jìn)背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突生長(zhǎng)。

圖2 抑制miR-205-5p促進(jìn)DRG細(xì)胞軸突生長(zhǎng)。a.miR-205-5p-mimic和miR-205-5p inhibitor轉(zhuǎn)染后，DRGs內(nèi)miR-205-5p的表達(dá)水平；b.用miR-205-5p-mimic和miR-205-5p inhibitor轉(zhuǎn)染DRGs后，用神經(jīng)元特異性標(biāo)記物β-tubulinⅢ染色；c.在轉(zhuǎn)染后96h后，觀察并定量各組最長(zhǎng)神經(jīng)突長(zhǎng)度。標(biāo)尺:50 μm。與NC-mimics比較：**P<0.01,***P<0.001

4 miR-205-5p與UHRF1相互作用

通過Starbase網(wǎng)站進(jìn)行生物信息學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)，UHRF1基因可能是miR-205-5p的直接靶點(diǎn)(圖 3a)，兩者具有一定的相關(guān)性。

進(jìn)一步采用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)來驗(yàn)證miR-205-5p是否直接靶向結(jié)合UHRF1。筆者發(fā)現(xiàn)，與NC-mimics+野生型UHRF1-3’-UTR重組質(zhì)粒組、NC-mimics+突變型UHRF1-3’-UTR重組質(zhì)粒組和miR-205-5p-mimics+突變型UHRF1-3’-UTR重組質(zhì)粒組相比，僅有miR-205-5p-mimics+野生型UHRF1-3’-UTR重組質(zhì)粒組的熒光素酶活性明顯被降低(P<0.01，圖3b)。結(jié)合Starbase網(wǎng)站預(yù)測(cè)結(jié)果分析推測(cè)miR-205-5p可直接靶向UHRF1基。

5 過表達(dá)miR-205-5p抑制UHRF1的表達(dá)

采用Q-PCR法和WB檢測(cè)UHRF1 mRNA 和蛋白的表達(dá)水平。Q-PCR法檢測(cè)結(jié)果顯示，與NC-mimics+未損傷組的背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞相比，NC-mimics+損傷組中UHRF1 mRNA的表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)，但是在轉(zhuǎn)入miR-205-5p-mimics(miR-205-5p-mimics+損傷組)后，損傷引起的UHRF1 mRNA升高被顯著抑制(圖3c)．采用WB檢測(cè)UHRF1蛋白的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)NC-mimics+損傷組DRG中UHRF1蛋白水平顯著升高(P<0.01)，但是這種情況在轉(zhuǎn)入miR-205-5p-mimics后(miR-205-5p-mimics+損傷組)明顯被抑制(P<0.01，圖3d、e)。上述結(jié)果說明，miR-205-5p能夠抑制周圍神經(jīng)損傷引起的UHRF1高表達(dá)。

圖3 miR-205-5p調(diào)控UHRF1的表達(dá)。a.預(yù)測(cè)UHRF1和miR-205-5p的結(jié)合位點(diǎn);b.雙熒光素酶報(bào)告基因轉(zhuǎn)染48h后，進(jìn)行熒光素酶測(cè)定;c.通過qRT-PCR確認(rèn)各組差異表達(dá)的miRNA;d、e.比較各組UHRF1表達(dá)差異。與NC-mimics組對(duì)比：##P<0.01；與NC-mimics+未損傷組對(duì)比：**P<0.01；與NC-mimics+損傷組對(duì)比：$$P<0.01

6 miR-205-5p通過調(diào)控UHRF1影響神經(jīng)再生

通過Q-PCR和WB發(fā)現(xiàn)UHRF1 siRNA-3對(duì)UHRF1表達(dá)下調(diào)作用最為顯著，所以UHRF1 siRNA-3被用作下一步實(shí)驗(yàn)(P<0.05,圖4a、b)。筆者將UHRF1 siRNA-3(si-UHRF1)和陰性對(duì)照載體(si-NC)分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染DRG神經(jīng)元，發(fā)現(xiàn)miR-205-5p inhibitor可上調(diào)DRG中UHRF1蛋白的表達(dá)水平，而si-UHRF1(miR-205-5p inhibitor+UHRF1-si-UHRF1組)恢復(fù)了DRG中UHRF1蛋白的表達(dá)(圖4c)。miR-205-5p抑制物對(duì)神經(jīng)突生長(zhǎng)的促進(jìn)作用被si-UHRF1抑制(圖4d～i)。這些結(jié)果共同表明，miR-205-5p通過調(diào)控UHRF1影響神經(jīng)再生。

圖4 miR-205-5p通過調(diào)控UHRF1影響神經(jīng)再生。a.用靶向UHRF1的3種不同siRNA和NC轉(zhuǎn)染后，qRT-PCR檢測(cè)DRG神經(jīng)元中UHRF1 轉(zhuǎn)錄水平;b.用3種不同的靶向UHRF1的siRNA和NC轉(zhuǎn)染后，檢測(cè)DRG神經(jīng)元中UHRF1的表達(dá);c.miR-205-5p inhibitor上調(diào)DRGs中UHRF1蛋白的表達(dá)，而轉(zhuǎn)染si-UHRF1質(zhì)粒可抑制DRGs中UHRF1蛋白的表達(dá);d、e.si-UHRF1再次導(dǎo)入DRG神經(jīng)元可部分抑制miR-23b-3p inhibitor對(duì)神經(jīng)突生長(zhǎng)的增強(qiáng)作用。標(biāo)尺:50μm。與損傷+NC組對(duì)比：*P<0.05，**P<0.01；與miR-NC組對(duì)比：##P<0.01

討 論

miRNA在神經(jīng)組織中表達(dá)具有組織特異性，如miR-9及miR-124僅在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)[15-16]。目前，已發(fā)現(xiàn)miR-9、miR-219及miR-13等多個(gè)分子在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中發(fā)揮關(guān)鍵作用[17-19]。盡管既往針對(duì) miRNA 開展了大量研究，但miRNA在周圍神經(jīng)再生中的作用研究尚處于初步階段。Zhou等[20]發(fā)現(xiàn)神經(jīng)損傷后大量miRNA分子表達(dá)改變，提示miRNA 在神經(jīng)損傷中可能發(fā)揮作用。Wu等[21]條件性敲除miRNA合成的關(guān)鍵分子Dicer后，大鼠坐骨神經(jīng)離斷后的功能恢復(fù)及形態(tài)重建等明顯受限，說明miRNA在神經(jīng)損傷修復(fù)過程中發(fā)揮了重要作用。目前，關(guān)于miR-205-5p的研究主要集中在腫瘤、血管及動(dòng)脈粥樣硬化等方面。王海波等[22]發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-205-5p可顯著抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。有研究報(bào)道m(xù)iR-205-5p高表達(dá)通過抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)，從而調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞的存活。并且，miR-205-5p通過下調(diào)PRKCA mRNA及蛋白表達(dá)，減少p38蛋白的磷酸化，進(jìn)而抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖與遷移,達(dá)到其抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用[23]。但關(guān)于miR-205-5p對(duì)坐骨神經(jīng)再生的作用鮮有報(bào)道，因此本研究中重點(diǎn)探討了其在周圍神經(jīng)損傷中的作用。

在某種程度上，周圍神經(jīng)系統(tǒng)的成熟神經(jīng)元在軸突損傷后可以切換到再生狀態(tài)。事實(shí)上，外周而非中樞軸突損傷會(huì)引起再生反應(yīng)背后涉及到復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳變化[24]。進(jìn)來研究的主要焦點(diǎn)是揭示再生相關(guān)基因(RAGs)促進(jìn)軸突再生和調(diào)控這些基因的分子[25-26]。然而，受傷后基因被抑制的作用和相關(guān)機(jī)制仍需深入研究。

Bronner等[27]發(fā)現(xiàn)UHRF1在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，并參與抑制腫瘤抑制基因?？紤]到腫瘤抑制因子在限制軸突再生方面的重要作用，Young等[14]通過在軸突上驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，在損傷的周圍神經(jīng)中，UHRF1通過抑制PTEN和p21 (CDKN1A)基因的表達(dá)促進(jìn)軸突再生。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，UHRF1通過與二甲基化和三甲基化H3K9相互作用并招募DNMT1和DNMT3a促進(jìn)PTEN和p21 (CDKN1A)的DNA甲基化來抑制其基因表達(dá)。同時(shí)，UHRF1也在高度增殖的神經(jīng)干/前體細(xì)胞中表達(dá)[28]，這提示在損傷的神經(jīng)元中上調(diào)UHRF1的表達(dá)可能會(huì)使其處于再生狀態(tài)。

本研究結(jié)果表明，與正常組織或細(xì)胞相比，周圍神經(jīng)損傷后神經(jīng)再生能力明顯增強(qiáng)，此外，筆者發(fā)現(xiàn)周圍神經(jīng)損傷的組織或細(xì)胞中 miR-205-5p表達(dá)降低。并且抑制miR-205-5p表達(dá)會(huì)增加DRG神經(jīng)元軸突再生的能力。而miR-205-5p過表達(dá)會(huì)抑制DRG神經(jīng)元軸突再生。此外， miR-205-5p可直接靶向UHRF1基因，miR-205-5p過表達(dá)可明顯抑制UHRF1 mRNA 和蛋白的表達(dá)水平，同時(shí)抑制miR-205-5p和UHRF1表達(dá)下調(diào)抑制miR-205-5p引起的DRG神經(jīng)元軸突再生能力。表明miR-205-5p通過對(duì)UHRF1蛋白表達(dá)水平的調(diào)控改變了DRG神經(jīng)元軸突再生能力。

綜上所述，本研究表明抑制miR-205-5p通過促進(jìn)UHRF1表達(dá)促進(jìn)了DRG神經(jīng)元軸突再生，為周圍神經(jīng)損傷提供了一種新的無細(xì)胞療法。

作者貢獻(xiàn)聲明：張娜：實(shí)驗(yàn)實(shí)施、收集數(shù)據(jù)、文章撰寫；左曉霜：分析數(shù)據(jù)；王文慧：課題設(shè)計(jì)